结构生物学：拉曼光谱基础与生物学上的应用-1

1、20:37:472022-5-3 什么是光谱？什么是光谱？ Spectroscopy 谱学谱学概念光谱: 是指测量样品对光的吸收或散射 的方法X-光紫外红外可见微波500,000 nm 100-300 nm 700-500,000 nm光谱区 光学现象光学现象 吸收吸收 absorptionabsorption荧光荧光 fluorescencefluorescence磷光磷光 phosphorescencephosphorescence化学发光化学发光 chemiluminescencechemiluminescence散射散射 scatteringscattering发射发射 emissio

2、nemission命名三种方式：现象/物质/波长分子吸收光谱 电子光谱：UV-Vis吸收光谱 振动光谱：IR红外吸收光谱 转动光谱：远红外吸收和微波分子发光光谱 光致发光：吸收光辐射 荧光光谱：单重激发态基态 磷光光谱：三重激发态基态 化学发光：化学能激发 拉曼光谱 光子与试样分子非弹性碰撞， 能量交换后的散射光谱 与分子振动能级跃迁对应 与红外吸收光谱有相似性什么是分子光谱？什么是分子光谱？吸收光谱吸收光谱红外光谱红外光谱紫外可见吸收紫外可见吸收散射光谱散射光谱荧光光谱荧光光谱拉曼光谱拉曼光谱振动光谱振动光谱红外光谱红外光谱拉曼光谱拉曼光谱紫外、可见吸收紫外、可见吸收荧光光谱荧光光谱电子光谱

3、电子光谱拉曼光谱拉曼光谱红外光谱红外光谱分子振动分子振动平动平动 振动振动 转动转动电子能级振动能级转动能级分子光谱分子光谱 振动使分子的振动使分子的偶偶 极极 矩矩感生偶极矩感生偶极矩活性振动活性振动变化的为变化的为红外红外拉曼拉曼从经典力学的观点，采用谐振子模型来研究双原子分子的振动，即化学键相当于无质量的弹簧，它连接两个刚性小球，它们的质量分别等于两个原子的质量。双原子分子振动时，两个原子各自的位移如图所示。图中为平衡时两原子之间的距离，为某瞬间两原子因振动所达到的距离。在低能量时，在低能量时，两条曲线大致两条曲线大致吻合，可以用吻合，可以用谐振子模型来谐振子模型来描述实际位能描述实际位

4、能。曲线左侧，。曲线左侧，实际位能曲线实际位能曲线高于谐振子位高于谐振子位能。原因是两能。原因是两原子间距离较原子间距离较近时，核间存近时，核间存在库仑排斥力在库仑排斥力(与恢复力同方与恢复力同方向向)，使位能值，使位能值大。高位能区大。高位能区，位能间距变，位能间距变小，因此的跃小，因此的跃迁成为可能。迁成为可能。 分子振动有伸缩振动和弯曲振动两种基本类型。伸缩振动指分子振动有伸缩振动和弯曲振动两种基本类型。伸缩振动指原子间的距离沿键轴方向的周期性变化，一般出现在高波数区；原子间的距离沿键轴方向的周期性变化，一般出现在高波数区；弯曲振动指具有一个共有原子的两个化学键键角的变化，或与某弯曲振动

5、指具有一个共有原子的两个化学键键角的变化，或与某一原子团内各原子间的相互运动无关的、原子团整体相对于分子一原子团内各原子间的相互运动无关的、原子团整体相对于分子内其它部分的运动。弯曲振动一般出现在低波数区。分子振动方内其它部分的运动。弯曲振动一般出现在低波数区。分子振动方式如所示。式如所示。1. 倍频倍频(overtune)的产生。位能曲线中的产生。位能曲线中0 0 1 1的跃迁称的跃迁称为基频为基频(fundamental tune)n n。而。而0 0 2 2的跃迁称为的跃迁称为第一个倍频第一个倍频2n n，相应地，相应地3n n, 4n n等均称为倍频。等均称为倍频。2. 组合频组合频(

6、combination tune)的产生。两个或两个以上的基频的产生。两个或两个以上的基频或基频与倍频的结合，如或基频与倍频的结合，如n n1+n n2，2n n1+n n2等产生的振动频率等产生的振动频率称为组合频。基频、倍频和组合频的产生可用图称为组合频。基频、倍频和组合频的产生可用图5来说明。来说明。设分子有三个简正振动，其振动量子数分别用设分子有三个简正振动，其振动量子数分别用n n1，n n2，n n3表表示。从能级（示。从能级（000）到能级（）到能级（100）的跃迁为）的跃迁为a，即，即n n2，n n3保保持不变，持不变，n n1从从0改变到改变到1，此跃迁产生与，此跃迁产生与

7、n n1相对应的简正振动相对应的简正振动的基频吸收。与此类似，从能级（的基频吸收。与此类似，从能级（000）到能级（）到能级（200）的跃）的跃迁迁b产生与产生与n n1所对应的简正振动的倍频吸收。从能级（所对应的简正振动的倍频吸收。从能级（000）到能级（到能级（101）的跃迁）的跃迁c，同时有振动量子数，同时有振动量子数n n1和和n n2的变化，的变化，此跃迁产生组合频吸收。此跃迁产生组合频吸收。Sir C. V. Raman拉曼散射的发现Chandrasekhara Venkata Raman07.11.1888 - 21.11.1970Discovery of the effect

8、of inelasticscattering of light: 1928Nobel Prize for Physics: 1930 印度物理学家拉曼于印度物理学家拉曼于19281928年研究年研究苯苯的光散射时发现，在的光散射时发现，在散射光中除了有与入射光频率相同的谱线外，还有与入散射光中除了有与入射光频率相同的谱线外，还有与入射光频率发生位移且强度极弱的谱线。前者是已知的瑞射光频率发生位移且强度极弱的谱线。前者是已知的瑞利利(Rayleigh)(Rayleigh)散射光，称为瑞利效应，而后者是新发现散射光，称为瑞利效应，而后者是新发现的，后来以发现者拉曼的名字命名的拉曼散射光，称为的，后

9、来以发现者拉曼的名字命名的拉曼散射光，称为拉曼效应。为此，拉曼获得了拉曼效应。为此，拉曼获得了19301930年度的诺诺贝尔物理年度的诺诺贝尔物理学奖金。学奖金。 几乎在同时，前苏联物理学家兰斯别尔格几乎在同时，前苏联物理学家兰斯别尔格(1andsberg)(1andsberg)和曼捷斯塔姆和曼捷斯塔姆(Mandelstam)(Mandelstam)研究石英研究石英的光散射时发现了的光散射时发现了相同的效应，相同的效应， 而法国的学者罗卡德而法国的学者罗卡德(Rocard)(Rocard)，和卡巴尼斯，和卡巴尼斯(Cabannes)(Cabannes)则是在则是在研究气体研究气体的光散射时也观

10、察到了这种效应。的光散射时也观察到了这种效应。 拉曼效应的发现并非偶然。拉曼效应的发现并非偶然。光光的的散散射射等离子体光散等离子体光散射射晶体光散晶体光散射射布里源散射布里源散射自由电子光散射自由电子光散射康普顿吴有训效应分子光散射分子光散射瑞利散射拉曼散射Light scattering - RayleighElastic (Rayleigh) scattering dominatesBeforeAfterLight out has same frequencyas light inexcitinglightmoleculemoleculelight outexcitationemissi

11、onLight scattering - Raman1 part in 108 is inelastically (Raman) scatteredBeforeAfterLight loses energy to the molecule vibrationexcitinglightmoleculeexcitationmoleculevibrateslight outexcit.-vib.emission1.1. 每一种物质每一种物质( (分子分子) )有自己的特征拉曼光谱，因之可以有自己的特征拉曼光谱，因之可以作为表征这一物质之用。作为表征这一物质之用。2.2. 每一物质的拉曼频率位移每一物

12、质的拉曼频率位移 ( (即入射频率与散射频率之即入射频率与散射频率之差差) )与入射光的频率无关。拉曼散射是瞬时的，即入射与入射光的频率无关。拉曼散射是瞬时的，即入射光消失时，拉曼散射在光消失时，拉曼散射在1010-11-111010-12-12s s后消失。后消失。3.3. 拉曼谱线的线宽一般较窄，并且成对出现，即具有数拉曼谱线的线宽一般较窄，并且成对出现，即具有数值相同的正负频率差。在短于入射光波长一边的称为值相同的正负频率差。在短于入射光波长一边的称为反斯托克斯线，在长波长一边的称为斯托克斯线。反斯托克斯线，在长波长一边的称为斯托克斯线。4.4. 拉曼频率位移拉曼频率位移的数值可从几个波

13、数到的数值可从几个波数到38003800个波数。个波数。5.5.在分子作拉曼散射的同时，还有比拉曼散射强几在分子作拉曼散射的同时，还有比拉曼散射强几个数量级的瑞利散射，其波长与入射光的波长相个数量级的瑞利散射，其波长与入射光的波长相同。同。6.6.拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论是气体、拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论是气体、液体或固体。液体或固体。7.一般的拉曼频率是分子内部振动或转动频率，有一般的拉曼频率是分子内部振动或转动频率，有时与红外吸收光谱所得的频率部分重合，波数范时与红外吸收光谱所得的频率部分重合，波数范围也是相同的。围也是相同的。8.拉曼谱线的强度和偏振性质，对于各条谱线是

14、不拉曼谱线的强度和偏振性质，对于各条谱线是不同的。同的。9.量子论说明拉曼效应为光子与分子发生非弹性量子论说明拉曼效应为光子与分子发生非弹性碰撞而发生的，碰撞而发生的，h0(入射光入射光)+M(分子分子)M (分分子内振动态变化子内振动态变化)+h(散射光散射光) 0R ； M=M hRhR为分子内部运动的能级差。斯托克斯线的强为分子内部运动的能级差。斯托克斯线的强度与反斯托克斯线的强度比代表分子在基态与度与反斯托克斯线的强度比代表分子在基态与在第一激发态的布居数之比，这个比值是温度在第一激发态的布居数之比，这个比值是温度的函数，可由玻尔兹曼公式算出。温度愈低则的函数，可由玻尔兹曼公式算出。温

15、度愈低则反斯托克斯线愈弱。拉曼频率愈小，则斯托克反斯托克斯线愈弱。拉曼频率愈小，则斯托克斯和反斯托克斯谱线的强度比愈接近斯和反斯托克斯谱线的强度比愈接近1。第一电子激发态电子基态振动量子数拉曼跃迁拉曼跃迁斯托克斯线反斯托克斯线荧光光谱荧光光谱和荧光光谱比较0123= = = = =vvvvStokesInelastic StrokeRayleighElastic StrokeAntistokesInelastic StrokeIR Spectroscopy:Interaction of the molecular dipole momentwith an external electromag

16、netic field Mid IR: fundamental vibrations Near IR: overtone and combinational vibrationsRaman Spectroscopy:Inelastic scattering of photons at a molecule Stokes lines: energy loss of photons Anti-Stokes lines: energy enhancement of photonsInfrared versus Raman SpectroscopyIRRamanComplementary spectr

17、al informationSample: Copper complex拉曼光谱与红外光谱的关系同同属分子振(转)动光谱异：红外分子对红外光的吸收强度由分子偶极距决定异：拉曼分子对激光的散射强度由分子极化率决定红外：适用于研究不同原子的极性键振动 OH, CO，CX拉曼：适用于研究同原子的非极性键振动 NN, CC互补拉曼光谱与红外光谱的关系O=C=O对称伸缩O=C=O反对称伸缩偶极距不变无红外活性极化率变有拉曼活性极化率不变无拉曼活性偶极距变有红外活性Raman and Infrared Spectra of H-CC-HAsymmetric C-H StretchSymmetric C-H

18、 StretchCC Stretch拉曼光谱和红外光谱的比较拉曼光谱和红外光谱的比较 拉拉 曼曼 光光 谱谱 红红 外外 光光 谱谱1水是有用的溶剂水是非常差的溶剂2光学器件和样品池由玻璃或者石英做成，简化样品处理操作光学器件和样品池材料用盐材料做成3传感器是标准的UV可见器件，检测器响应快，可用以研究寿命或者透明组分和跟踪快速反应动力学 热检测器4可以覆盖整个振动频率范围FTIR需要通过改变检测器或光束劈裂器来实现覆盖整个振动频率范围：传统的IR需要两台以上仪器才能覆盖整个区域5可以看到整个对称振动看不到整个对称振动6激光光源的性质易于探测微量样品、表面、薄膜、粉末、溶液气体7因为谐波和合频

19、带都不非常强，所以拉曼光谱比IR光谱简单的多，重叠谱带很少见到8偏振拉曼的测量给拉曼光谱所得的信息增加一个额外的因次，对带的认定和结构测定是一个帮助9拉曼强度与浓度和激光强度成正比红外光谱与拉曼光谱相比的优点 由于谐波和频带的强度，对于对于小的结构差别来说IR光谱更加灵敏。在定性分析中它更有用，而且对结构解析研究来所它与拉曼光谱是互补的 IR光谱仪比较便宜。拉曼测量易于受光栅缺陷和其他光源引起的光谱干扰（如鬼线）。拉曼光谱仪的单色仪的质量必须比IR光谱法高。 IR光谱仪的校准比较简单 拉曼光谱与激光功率、池的几何形状以及仪器的特性有非常大的关系，所以很难对不同仪器的拉曼强度进行比较。用IR光谱

20、仪吸收测量的性质使得这种比较易于进行 IR光谱法的检出限一般优于拉曼光谱法，除非后者采用共振增强技术 拉曼过程的效率非常低只有很小部分的入射光（如10-8）被转换成入射光子，宽带荧光发射有可能会把拉曼信号完全淹没显微共聚焦拉曼光谱仪 纵向空间分辨率为2m 横向空间分辨率为1m 光斑尺寸连续可调（1-100 m ）样品： 聚丙烯（PP）基底上2m的聚乙烯（PE）薄膜激光： HeNe激光器（波长633 nm）放大倍数： x50物镜光谱仪设置： 狭缝宽度10 m1.1.灵敏度高灵敏度高2.2.快速分析，鉴别各种材料的特性与结构快速分析，鉴别各种材料的特性与结构3.3.微量样品分析，样品可小于微量样品分析，样品可小于2 2微米微米4.4.对样品无接触，无损伤，样品无需制备对样品无接触，无损伤，样品无需制备5.5.适合黑色和含水样品适合黑色和含水样品6.6.高、低温及高压测量高、低温及高压测量7.7.光谱成像快速、简便，分辨率高光谱成像快速、简便，分辨率高8.8.仪器稳固，体积适中，维护成本低，使用仪器稳固，体积适中，维护成本低，使用简单。简单。三种拉曼光谱仪性能比较三种拉曼光谱仪性能比较 传统拉曼光谱仪传统拉曼光谱仪 JY HG JY HG 2S2S FT FT RAMANRAMAN BRUKER RFS BR