生物化学实验：米氏常数_第1页
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文档简介

1、蔗糖酶米氏常数的测定操作方法蔗糖酶米氏常数的测定操作方法1）将离子交换柱层析得的）将离子交换柱层析得的E3稀释稀释(pH4.6 HAC缓冲液缓冲液) )至至20U/mL20U/mL，共共16ml。2）取试管取试管8支，按支，按0-7编号，编号，0为对照管。为对照管。3）按表）按表1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35水浴中保温水浴中保温（使（使温度平衡，以下同）温度平衡，以下同）10min。4）取约取约16ml酶液，放入酶液，放入同一水浴中保温约同一水浴中保温约10min。5）于各管中依次按于各管中依次按同样时间间隔同样时间间隔加入已保温过的酶液加入

2、已保温过的酶液2ml，记时，立即摇记时，立即摇匀。在匀。在35水浴中准确反应水浴中准确反应3min。6）按按同样次序和时间间隔同样次序和时间间隔，加入，加入0.5ml的的1mol/L NaOH，摇匀，终止反应。摇匀，终止反应。7）吸取反应混合物）吸取反应混合物0.5ml，加入盛有加入盛有3ml DNS试剂和试剂和1.5ml去离子水的血糖去离子水的血糖管中，放入沸水中加热管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定摇匀后，测定A540值。值。反应物反应物活力测定活力测定数据处理数据处理管管号号0.1mol/L蔗糖液蔗糖液pH4.6buffer酶液酶液（ml

3、）1mol/LNaOH(ml)吸取吸取反应物反应物(ml)DNS试剂试剂(ml)水水(ml)A540底物底物浓度浓度(S)1/S1/A002.002.000.50.531.5010.41.602.000.50.531.50.01010020.51.502.000.50.531.50.01258030.61.402.000.50.531.50.01566.740.81.202.000.50.531.50.025051.01.002.000.50.531.50.0254061.50.502.000.50.531.50.037526.772.00.002.000.50.531.50.05020数据处理：数据处理： 以以A A值作为相对反应速度，以值作为相对反应速度，以1/1/S S为横坐为横坐标，

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