分子生物学——蛋白质组学的研究方法和进展

1、2022-5-31第九章第九章 蛋白质组学蛋白质组学 的研究方法和进展的研究方法和进展2022-5-32One Genome different ProteomesLife is based on proteins and their interactions前言从基因组学到蛋白质组学2022-5-332020世纪生命科学的辉煌成就世纪生命科学的辉煌成就l19531953年年Watson & Crick，DNADNA双螺旋结构提出双螺旋结构提出l19571957年，年，“中心法则中心法则”的问世的问世l2020世纪世纪9090年代，人类基因组计划（年代，人类基因组计划（HGP）2022

2、-5-34基因组计划的局限基因组计划的局限无法解决无法解决“基因精基因精细调控细调控”问题问题“mRNA” 无法反无法反映蛋白质的质与量。映蛋白质的质与量。2022-5-35以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。大规模、全方位的蛋白质研究势在必行。大规模、全方位的蛋白质研究势在必行。2022-5-36 第一节第一节 蛋白质组学的概念及其发展史蛋白质组学的概念及其发展史2022-5-37蛋白质

3、组（proteome） l同一基因组在不同细胞、不同组织中同一基因组在不同细胞、不同组织中蛋蛋白质白质表达各不相同。表达各不相同。l空间和时间上呈动态变化。空间和时间上呈动态变化。 由一个细胞或一个组织的基因组所表由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。达的全部蛋白质。2022-5-38蛋白质组学(proteomics) 从整体角度分析细胞内动态变化的蛋从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间相互作用与联系，揭示蛋白质功白质之间相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。能与细胞生命活动规律。2022-5-3

4、9主要研究内容主要研究内容 l了解特定的细胞、组织或器官表达的了解特定的细胞、组织或器官表达的 蛋白质种类；蛋白质种类； l 明确各种蛋白质分子相互作用网络；明确各种蛋白质分子相互作用网络； l 描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其 结构上的关键部位，如与药物结合结构上的关键部位，如与药物结合 并且决定其活性的部位。并且决定其活性的部位。 2022-5-310功能蛋白质组学(functional proteomics) 细胞在一定阶段或与某一生理现象细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的全部蛋白质。相关的全部蛋白质。2022-5-311国际研究进展u19961996年

5、，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（究中心（APAF）u美国美国NCI NCI 肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋白质组数据库白质组数据库uNCI与与FDA 有关癌症不同发病阶段和治疗阶有关癌症不同发病阶段和治疗阶段的蛋白质组数据库段的蛋白质组数据库u英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资进行英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资进行蛋白质组学的研究蛋白质组学的研究 2022-5-312The HUPO WorldCanadaUSAChinaJapanKoreaAsia OceaniaSwedenRussiaUni

6、ted KingdomItalyGermanyFranceLatin AmericaAustraliaThe Human Proteome Organisation2022-5-3131. Human Liver Proteome Project(HLPP) 2. Human Brain Proteome Project(HBPP)3. Proteomic Standards Initiative(PSI)4. Human Antibody Initiative(HAI) 5. Plasma proteome Project(PPP)6. Mouse Models Human Disease(

7、MMHD) 7. Human Disease Glycomics/Proteome Initiative (HGPI)8. HUPO Cardiovascular Initiative(HUPO CVI)2022-5-314国内进展l国家自然科学基金委于国家自然科学基金委于19971997年设立了重大项年设立了重大项目目“蛋白质组学技术体系的建立蛋白质组学技术体系的建立”l19981998年启动了蛋白质组学研究年启动了蛋白质组学研究l中国科学院生物化学研究所、军事医学科学中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院等单位启动蛋白质组研究院等单位启动蛋白质组研究l中国科学院上海生命科学研究院、军事医

8、学中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质组学研究中心组学研究中心2022-5-315l 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国国“973”973”计划项目和计划项目和“863”863”计划项计划项目；国家自然科学基金委员会也将目；国家自然科学基金委员会也将“蛋蛋白质组研究白质组研究”列为重点项目。列为重点项目。l 我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大进展。蛋白质组研究方面取得了较大进展。2022-5-316 第二节第二节 蛋白质组学研究方

9、法概述蛋白质组学研究方法概述2022-5-317一、蛋白质组表达模式研究方法l研究蛋白质组的组成成分研究蛋白质组的组成成分 l主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表的主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。 2022-5-318（一）蛋白质组研究中的样品制备 l采用细胞或组织的全蛋白质组分进行蛋白质采用细胞或组织的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。组分析。 l进行样品预分级，将细胞或组织中的全体蛋进行样品预分级，将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究，白质分成不同部分，分别进行研究，提高低提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度

10、丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。2022-5-319样品预分级的主要依据样品预分级的主要依据l蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等l蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等l蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等绿体等 2022-5-320组织水平蛋白质组样品制备组织水平蛋白质组样品制备 原因：临床样本都是各种细胞或组织混原因：临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。细胞总是与血管、基质细胞等混杂。2

11、022-5-321激光捕获显微切割激光捕获显微切割( (laser capture microdissection，LCM) ) 可直接可直接在显微镜下在显微镜下从组织切片从组织切片中精确分离中精确分离特定的细胞特定的细胞或细胞群。或细胞群。2022-5-322（二）蛋白质组研究中的样品分离l双向凝胶电泳双向凝胶电泳( (two-dimensional electrophoresis, 2-DE) ) 利用蛋白质等电点和分子量差异，结合凝利用蛋白质等电点和分子量差异，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。2022-5-323工作原理：工作原理：l根据蛋白质等

12、电点的不同进行第一向等电聚焦根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电聚焦电泳分离电泳分离l转移到第二向转移到第二向SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同进行分离相对分子质量大小不同进行分离2022-5-324等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）低低pH低低pH高高pH高高pH第一向等电聚焦电泳第一向等电聚焦电泳（isoelectrophoresis focusing, IEF） 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝用下沿电场方向在凝

13、胶内制造一个胶内制造一个pHpH梯度。梯度。每种蛋白质都将迁移每种蛋白质都将迁移至与它的至与它的pI pI 相一致相一致的的pHpH处。处。2022-5-325固相固相pHpH梯度等电聚焦的优点梯度等电聚焦的优点u克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。u可以精确设定可以精确设定pHpH梯度。梯度。 尤其可在较窄的尤其可在较窄的pHpH范围内进行第二轮分范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。析，大大提高了分辨率及重复性。 2022-5-326双向凝胶垂直双向凝胶垂直 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：水平方向反映

14、出蛋白在二维分布图：水平方向反映出蛋白在pIpI上上的差异，垂直方向反映分子量上的差别的差异，垂直方向反映分子量上的差别。第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳2022-5-3273-4 mm70 - 240 mmgelPlastic backing固相pH梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图2022-5-328SDS-PAGESDS-PAGE电泳（第二向）示意图2022-5-329 二维电泳的主要步骤二维电泳的主要步骤： 1. 样品准备样品准备2. 第一维：固相第一维：固相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦3. 第二维：第二维：SDS-PAGE电泳电泳4. 染染 色：考马氏亮兰或银染色：考马氏亮兰或银染

15、5. 图像分析：肉眼或自动扫描图像分析：肉眼或自动扫描 2022-5-330Gel staining1st dimension IEF2nd dimension SDS-PAGEImaging and data evaluationSpot excision and mass spectrometrySamplepreparation2-DE流程图流程图2022-5-331蛋白质二维电泳图谱3010kDapH 10pH 3pI2022-5-332低分化星形胶质细胞瘤中表达明显上调蛋白cAMP-dependent protein kinase (L4) 1212L4L4Low-gradeHigh

16、-gradeTCP-1- epsilon (L2)Protein disulfide isomerase A3 (L3)6659L2L3L2L36659Low-gradeHigh-gradeDihydropteridine reductase (L5)3636L5L5Low-gradeHigh-grade3944L13944L1Low-gradeHigh-gradeGlial fibrillary acidic protein, astrocyte (L1) 2022-5-333Low-gradeHigh-gradePeroxiredoxin 6 (H5)Apoliprotein A-I (H

17、4)4040H4H413134848H5H5Fibrinogen fragment D (H3)-Internexin (H1)H1H168686868H2H2H3H3Actin, cytoplasmic 1 (H2)Low-gradeHigh-gradeLow-gradeLow-gradeHigh-gradeHigh-grade高分化星形胶质细胞瘤中表达明显上调蛋白2022-5-334二维电泳优点l 可分离可分离10100 kD 范围内蛋白质范围内蛋白质l 高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率l 便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 l 与质谱分析匹配与质谱分析匹配 2022

18、-5-335二维电泳缺点 l 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质及低丰度蛋白质用大蛋白质、极小蛋白质及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。此种技术难于有效分离。l 胶内酶解过程费时、费力，难于与质胶内酶解过程费时、费力，难于与质 l 谱联用实现自动化。谱联用实现自动化。 2022-5-336新型非凝胶技术 l液相色谱法液相色谱法 分配色谱法分配色谱法 吸附色谱法吸附色谱法 离子交换色谱法离子交换色谱法 排阻色谱法排阻色谱法l毛细管电泳毛细管电泳LabAlliance Model 2000二元高压半制备梯度系统二元高压半制备梯度系统202

19、2-5-337（三）蛋白质组研究的样品鉴定 基本原理：样基本原理：样品分子离子化品分子离子化后，根据离子后，根据离子间质荷比间质荷比(m/z)的差异来分离的差异来分离并确定样品的并确定样品的分子量。分子量。 2022-5-338Spot identificationSpot PickingDigestionMS Analysis and Database searchSpot cutterSpots of interestMass (m/z)01000020000300004000050000 1000 2000 3000 4000 2022-5-339 生物质谱技术生物质谱技术( (Mass

20、 Spectrometry) 通过测定样品离子的质荷（通过测定样品离子的质荷（m/z）来进行成分和结构分析。来进行成分和结构分析。MolecularsIonsDetectorSuccessful ion path Quadrupole Ion Analyzer Electron Impact Ionizer2022-5-340“软电离软电离”的特点的特点l分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。碎片离子。l灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效量和结构信息、既可定

21、性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。地与各种色谱联用来分析复杂体系。 2022-5-341u基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/ /电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） u电喷雾质谱电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） 主要质谱类型主要质谱类型2022-5-342鉴定和注释蛋白质的路线鉴定和注释蛋白质的路线 u通过肽质谱指纹图通过

22、肽质谱指纹图(peptide mass finger-printing,PMF)和数据库搜寻匹配和数据库搜寻匹配u通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配2022-5-343Sample MS Spectrum2022-5-344典型二级质谱图2022-5-345肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因的可能原因l样品量太少，样品量太少，PMFPMF图信噪比太低图信噪比太低l2-DE2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质l角蛋白

23、或其他蛋白质的污染角蛋白或其他蛋白质的污染l蛋白质发生较多的转译后修饰，数据库中未有记载蛋白质发生较多的转译后修饰，数据库中未有记载l所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 l未知的新蛋白质未知的新蛋白质 l数据库规模太小数据库规模太小 2022-5-346l 组织切片或印片原位质谱分析技术组织切片或印片原位质谱分析技术l 两级飞行时间串联质谱（两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）l 傅里叶转换回旋共振质谱（傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）l 表面增强激光解吸表面增强激光解吸/ /电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱 （SELDI-TO

24、F-MS） 联合技术精确鉴定蛋白质联合技术精确鉴定蛋白质 2022-5-347 液质联用技术（液质联用技术（LC-MS/MS） 蛋白质混合物通蛋白质混合物通过液相色谱分离以代过液相色谱分离以代替替2-DE2-DE的分离的分离, ,然后然后进入进入MSMS系统获得肽段系统获得肽段分子量分子量, ,再通过串联再通过串联MSMS技术技术, ,得到部分序得到部分序列信息列信息, ,最后通过计最后通过计算机联网查询、鉴定。算机联网查询、鉴定。2022-5-348 根据蛋白质带电性及疏水性不同，根据蛋白质带电性及疏水性不同，用用MSMS分离多肽复合物。分离多肽复合物。 l多维色谱技术（多维色谱技术（LC/

25、LC-MS/MS）l多维蛋白质鉴定技术多维蛋白质鉴定技术 ( (multidimensional protein identification technology) ) 2022-5-349（四）蛋白质组学研究的生物信息学 生物信息学是蛋白质组学研究的一个不生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。可缺少的部分。 l构建和分析双向凝胶电泳图谱构建和分析双向凝胶电泳图谱 l数据库的搜索与构建数据库的搜索与构建 2022-5-350蛋白质组数据库蛋白质组数据库lSWISS-PROT: http:/www.expasy.ch/sprot/ 拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。拥有目

26、前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。lNRDB:http:/www.nrdb.co.uk/ldbEST:/lNCBI:/Genomes/lEMBL:/ lProsite：/prosite/lPDB：/pdb/目前应用最普遍数据库目前应用最普遍数据库2022-5-351secondary structure local spatial arrangementb-sheeta-helixp

27、rimary structure amino acid sequenceDRLEFIVTALLKPWN-terminusC-terminustertiary structure protein foldingquaternary structure multimeric complexes二、蛋白质功能模式的研究方法2022-5-352结构蛋白质组学（结构蛋白质组学（Structural Proteomics）2022-5-353（一）蛋白质翻译后修饰的研究l糖基化、乙酰化、甲基化、羧基化糖基化、乙酰化、甲基化、羧基化 l二硫键配对、焦谷氨酸化二硫键配对、焦谷氨酸化 l蛋白质降解蛋白质降解20

28、22-5-354（二）蛋白质相互作用研究技术l生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用有序和协同作用 l新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现同作用实现 l细胞信号转导及病原体感染和免疫反应细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 2022-5-355l19891989年年Field 和和Song等人在酵母细胞中设计的分析等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。蛋白质相互作用的方法。l真核细胞转录激活因子真核细胞转录激活因子( (GAL4) )的结构和活性特点的结构和活性特点为基础的。为基础的。

29、lN端含端含NLS和与酵母和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列基因启动子上游激活序列( (UASG) )结结合的结构域。合的结构域。lC端含端含GAL1转录激活结构域转录激活结构域1.1.酵母双杂交系统酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system） 2022-5-356系统构建系统构建l分别构建含分别构建含GAL4 BD 和和AD 的两个酵母融的两个酵母融合蛋白表达载体；合蛋白表达载体；l建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析的酵母菌株。的酵母菌株。 2022-5-357酵母双杂交（酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）2022-5-358主要特点和优势主要特点和优势l使蛋白质表现型和基因型相联系使蛋白质表现型