抗旱性指标试验方法

1、抗性指标实验方法一氮蓝四唾（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）1【注意事项】2.二愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定-愈创木酚法3【注意事项】4.三CAT（过氧化氢酶）的测定5.【注意事项】6.四、丙二醛（MDA）含量的测定6.【注意事项】7.五.可溶性总糖的测定7.六叶绿素含量的测定8.七、采用饱和称重法测定叶片相对含水量（RWC）9八、采用电导率法测定相对电导率（REC）10一氮蓝四嚏（NBD法测定超氧化物岐化酶（SOD（测量避光，光影响极大）【仪器、材料与试剂】（一）仪器1 .分光光度计2 .台式离心机（二）材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .甲硫氨酸4 .EDTA-Na2

2、5 .核黄素6 .氮蓝四唾（NBT）7 .陶瓷小研钵8 .4-5ml离心管9 .10ml玻璃试管（三）试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS,pH7.8）:A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：取NaHPO12H2O分子量358.14）71.7g;B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaHPO2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸储水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液（NazHP（4）228.75ml,B母液（NaHPO）21.25ml,用蒸储水定容至1000ml。2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818gMet用

3、磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。3. 3mMEDTA-Na容液：称取0.1117gEDTA-Na用磷酸缓冲液定容至100ml。4. 60仙M核黄素溶液：称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。5. 2.25mM氮蓝四唾（NBT）溶液：称取0.092gNBT用PBS定容至50ml,避光保存。【实验步骤】1 .酶液提取称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g下离心20min,上

4、清夜即为SOD粗提液。2 .酶活性测定（1）反应混合液配制（以60个样为准）：分别取配好的Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液6ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和40小（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40履PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40仙lPBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照25c下反应20min；（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（。展0）3.计算

5、结果已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位（U）,按下式计算活性n=（ODmarOC560）/ODma/2SOD总活性=（Ack-AE）刈/（1/2Ack>W<Vt）SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）;比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；Ae为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。【注意事项】1 .酶液提取须在4c下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2 .植物中的酚类物质对测定有干扰，

6、制备粗酶液时可加入聚乙烯叱咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。3 .NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。4 .加反应液时最好在暗光下进行；5 .核黄素产生O2,NBT还原为篮甲潸都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40Nmolm2s同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；6 .测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50%为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50

7、%的酶量为一个SOD酶活性单位。）（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）【参考文献】BeauchampC,FridovichI.Superoxidedismutase.Improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegel.AnalBiochem,1971,44:276-287.ZhouW,ZhaoD,LinX.Effectsofwaterloggingonnitrogenaccumulationandalleviationofwaterloggingdamagebyapp

8、licationofnitrogenfertilizerandmixtalolinwinterrape（BrassicanapesL.）.J.PlantGrowthRegul,1997,16,47-53.二愈创木酚过氧化物酶（POD活性白测定-愈创木酚法【实验原理】在过氧化物酶催化下，将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1 .分光光度计2 .台式离心机（二）材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .2-甲氧基酚4 .30%H2O5 .陶瓷小研钵6 .2ml离心管（三）试剂1. 0.2mo

9、l/L磷酸缓冲液（pH6.0）:A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：取NaHPO12H2O分子量358.14）71.7g;B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaHPO20（分子量156.01）31.2g。分别用蒸储水定容到1000ml。0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）的配制：分别取A母液（NazHPO）12.3ml和B母液（NaHPO）87.7ml混匀即为100mlPBS（0.2M,pH6.0）;【实验步骤】1 .酶液提取称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的

10、磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g下离心20min,上清夜即为酶粗提液。2 .酶活性测定（1）反应混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0,0.2M）缓冲液于烧杯中，力口入28口愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入1930%的H2Q,混匀后保存于冰箱中备用。（2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40仙l酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，3 .计算结果以每minODfi变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。，按下式计算活性POD舌性二（AA470XVt）/（WXVs

11、X0.01Xt）（u/gFW）AA470:为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）;t为反应时间（min）;Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。【注意事项】1 .反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2Q前注意溶液冷却，防止HO的挥发。2 .由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。参考文献J.L.Mu?oz-Mu?oz,F.Garca-Molina,P.A.Garca-Ruiz,E.Arribas,J.Tudela,F.Garca-Cnovas,iJ.N.Rodrguez-Lpez,Enzymaticandchemicaloxidation

12、oftrihydroxylatedphenols,FoodChemistry,Volume113,Issue2,15March2009,Pages435-444F.Quintanilla-Guerrero,M.A.Duarte-Vzquez,B.E.Garca-Almendarez,R.Tinoco,R.Vazquez-Duhalt,C.Regalado,Polyethyleneglycolimprovesphenolremovalbyimmobilizedturnipperoxidase,BioresourceTechnology,Volume99,Issue18,December2008,

13、Pages8605-8611三CAT（过氧化氢酶）的测定【实验原理】过氧化氢酶（Catalase,CAT）,是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2Q分解为水和氧气，消除组织中的过氧化氢。H2Q在240nm处有一个吸收高峰，其吸光度与H2Q的含量成正比，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1 .分光光度计2 .台式离心机（二）材料植物叶片等植物材料（三）试剂1 0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）:取A母液（NazHPQ228.75ml和B母液（NaHzPO）146.2

14、5ml混合后用蒸储水定容至500ml。2 0.3%HzQ:吸取0.5ml30%的H2Q,用PBS（pH7.0）定容至50ml。【实验步骤】1.酶液提取称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g下离心20min,上清夜即为CAT粗提液。2酶活性测定（1）反应混合液的配制：取100mlPBS0.15M,pH7.0）,力口入0.1546ml30%的H2Q摇匀即可。（2）取2.9ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS

15、为对照调零，测定OD240值在40s内的变化。3结果计算：酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=AA240XVt/（WXVsX0.01Xt）（u/gFW）AA240:为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）;t为反应时间（min）;Vt为提取酶液总体积（ml）;Vs为测定时取用酶液体积（ml）。【注意事项】HO易分解,应现用现配。【参考文献】AebiH（1984）Catalaseinvitro.In:PackerL（ed）Methodsinenzymology.Orlando,FL:AcademicPress,pp121T26四、丙二醛（MDA含量的测定【

16、实验原理】MDAE高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1 .分光光度计2 .台式离心机（二）材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .三氯乙酸4 .硫代巴比妥酸5 .陶瓷小研钵6 .10ml离心管（三）试剂1. 5%的三氯乙酸（TCA）溶液：称取5g三氯乙酸用少量蒸储水溶解后定容于100ml容量瓶中；2. 0.67%（w/v）硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取0.67g硫代巴比妥酸用10%三氯乙酸溶液溶解后定容于100ml容量瓶中。【实验步骤】1 .取0.5g样品（叶片或根系）剪碎放入研钵中，加入5ml

17、5%TCA溶液研磨成匀浆后转入离心管中在3000r/min下离心20min；3000r/min下离心2 .取上清液2ml于离心管中，加入等体积的0.67%TBA（硫代巴比妥酸）混和后在100c沸水浴中煮30min,用冷水迅速冷却后在10min；3 .取上清液在450nm、532nm、600nm下测OD值（用去离子水调零）；4 .计算组织中MDA含量：MD腐度C（umol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450MD的量（umol/gFW）=C乂V/W式中V为提取液体积（1.8ml）,W为样品鲜重（0.5g）o【注意事项】1 .加热时间不宜过长2 .煮沸后要再进行一次离心【参

18、考文献】KumarGNM,KnowlesNR.Changesinlipidperoxidationandlipolyticandfree-radicalscavengingenzymeactivitiesduringagingandsproutingofpotato(Solanumtuberosum)seed-tubers.PlantPhysiol,1993,102:115124五.可溶性总糖的测定【实验原理】实验采用意酮比色法测定可溶性总糖的含量。糖在硫酸作用下生成糖醛，糖醛与慈酮作用形成绿色络合物，在一定范围内，颜色深浅与糖含量有关。在625nm波长下的OD值与糖含量成正比。方法简单，但没

19、有专一性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1 .分光光度计2 .恒温水浴锅3 .分析天平4 .烘箱5 .刻度试管（二）材料1 .活性炭2 .刻度试管、3 .漏斗4 .酒精（20%5 .植物叶片或种子6 .滤纸（三）试剂1 .葡萄糖标准液：80c烘箱烘至恒重的葡萄糖100mg配成500ml溶液，即为200ig/ml的标准液，2 .慈酮试剂：100mg®酮?§于100ml稀硫酸(76ml浓硫酸加30ml水中)。3 .酒精(20%:20ml酒精溶解至100ml。【实验步骤】1 .可溶性糖的提取各种植物叶片或种子在110c烘箱中烘15min,然后调至70c过夜。干叶片磨碎后称取50m

20、g样品倒入10ml刻度试管内，加入4ml80%酒精，置于80c水浴中不断搅拌40min,离心，收集上清液，残渣加2mll80%酒精重复提取2次，合并上清液。在上清液中加10mg活性炭，80c脱色30min,定容至10ml,过滤后取滤液测定。2 .显色及比色吸取上述酒精提取液1ml,加5ml；®酮试剂混合，沸水浴煮10min,取出冷却。在625nm处测OD值。从标准曲线上得到提取液中糖的含量。3 .绘制标准曲线取标准糖溶液将其稀释成一系列0-100仙g/ml的不同浓度的溶液。按上述方法分别测定OD值，然后绘制标准曲线。【参考文献】1 .FairbairnNJ.Amodifiedanth

21、ronereagentJ.Chem.andInd.,1953(4):862 .中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会.现代植物生理学实验指南M.北京：科学出版社，1999.127六叶绿素含量的测定【实验原理】根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm,类胡萝卜素为470nm,可据此列出以下关系式：Ca=13.95A665-6.88A649Cb=24.96A649-7.32A665Cx.c=(1000A470-2.05Ca114.8Cb)/

22、245Ca+b=6.1A665+20.04A649式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx.c为类胡萝卜素的总浓度。试剂及配制：95%乙醇【仪器、材料与试剂】8（一）仪器1 .分光光度计2 .电子天平（三）试剂95%乙醇【实验步骤】1 .取新鲜植物叶片（或其他绿色组织），擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2 .称取待测剪碎的新鲜样品0.1g（可调整），共3份，分别置于试管中。每个试管加入5ml95%乙醇，使样品完全浸泡在乙醇溶液中。置于暗处浸泡24h后,进行比色测定。3 .将叶绿素色素提取液倒入比色杯内，以95%为对照调零，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。4 .按上面的公式分别计算叶绿素ab和类胡萝卜素的浓度（mg/L）,a+b即得叶绿素总浓度。求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重的各色素的含量：叶绿体色素的含量=（色素浓度x提取液体积）/样品鲜重单位mg/g【参考文献】ArnonDL.Copperenzymesinisolatedchloroplasts,polyphenoloxidaseinBrtavulgaris,Plan