细菌菌群间的相互作用对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

1、项目编号：05048望道学者结题报告 课题名称：细菌菌群间的相互作用对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响申 请 人：芮晶 学号：0256365联系电话：0256365 e-mail: 0256365所在院系(专业)：上海医学院临床医学七年2002导 师：高谦导师单位(部门)：上海医学院分子病毒实验室填表日期：2006.5.10 复旦大学教务处制表细菌菌群间的相互作用对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响摘要：近年来，由表皮葡萄球菌造成的医院感染日趋严重，而生物膜被认为是表皮葡萄球菌致病的主要原因。本实验主要通过与表皮葡萄球菌共存的细菌分泌的种间信号分子AI-2对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响来分析这些共存菌对

2、表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。方法：1，测试共存菌的无细胞上清对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响(半定量生物膜检测方法)；2，把表皮葡萄球菌的共存菌用AI-2检测系统检测其无细胞上清液中有无AI-2分子。结果：大肠杆菌分泌AI-2，且明显影响表皮葡萄球菌生物膜的形成；金黄色葡萄球菌分泌AI-2，但发光值不高，未发现它明显抑制生物膜的形成；粪肠球菌，绿脓杆菌不分泌AI-2，但能抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。结论：与表皮葡萄球菌共存的细菌对表皮葡萄球菌生物膜形成有影响，这种影响是通过分泌AI-2或其他种间信号分子传递信息的。关键词：表皮葡萄球菌生物膜AI-2Abstract: Hospital inf

3、ection caused by Staphylococcus epidermidis becomes more and more serious over the years, and biofilm is thought as the main virulence factor responsible for those infections. This study is objected to investigate the influence of other bacteria living within the same microenviroment with S. epiderm

4、idis on its biofilm formation and one of the potential mechanisms is their communication by interspecies signaling molecule, autoinducer-2(AI-2). Methods: 1.Testing the effect of cell-free medium (including molecules secreted by the bacteria) from co-existing bacteria with S. epidermidis on its biof

5、ilm formation (semi-quantitative biofilm assay); 2. Testing if these co-existing bacteria produce AI-2 molecules (AI-2 report assay). Results: E coli obviously inhibited S. epidermidiss biofilm formation, and it also secreted AI-2; Staphylococcus aureus has no obvious effect on S. epidermidiss biofi

6、lm formation although it secreted AI-2; Enterococcus faecalis and aeruginosus Bacillus were not detected for AI-2 activity, however, they inhibited S. epidermidis from forming biofilm as well. Conclusion: Some of the bacteria co-exist with S. epidermidiss exert influence on its biofilm formation, wh

7、ich may depends on AI-2 or other interspecies signaling molecules to exchange information.Key words: Staphylococcus epidermidis, biofilm, autoinducer-2表皮葡萄球菌是重要的条件致病菌。近年来，随着插管、透析、人工瓣膜、人工关节、人工晶体等医疗技术和材料的广泛应用以及人口老龄化和免疫低下人群的出现，由表皮葡萄球菌造成的医院感染日趋严重(1)。由于这类感染很难治愈，因此最后不得不重新置换留置物，给患者造成很大的痛苦和沉重的经济负担。目前，对表皮葡萄球

8、菌的致病机理尚不清楚，全基因组测序分析表明在其基因组中没有通常认为的“致病基因”如外毒素、胞外酶等，而流行病学则显示大多数此类感染中都能发现生物膜的存在，因此生物膜被认为是表皮葡萄球菌致病的主要原因(2)。生物膜(biofilm)是指细菌不可逆转地粘附在物体表面或其本身细胞之间相互粘附，并被其自身所分泌的细胞外粘质所包裹而形成的特殊结构，它的形成导致细菌的生长状态和基因表达的改变。在由细菌引起的慢性感染性疾病中，如囊肿性纤维化病和牙周病以及高分子材料留置物(例如医用导管)植入而引起的血液和尿道感染等，生物膜作为致病因子起着重要作用。生物膜的形成提高了细菌抵抗人体免疫系统和抗生素的能力，导致了广

9、泛的耐药性。成熟的生物膜中不断有一些小碎片（pieces）脱落，在流动中破碎，释放出浮游菌细胞，成为不断产生游离细菌的储藏所，游离细胞在新的部位形成新的菌落，引起持续性感染。因此，细菌生物膜形成机理正成为研究热点。目前认为生物膜的形成是一个复杂过程，它不仅由多个基因参与，且在微生态环境中，周围细菌之间的相互作用对生物膜的形成也可能产生一定的影响。但现在对生物膜的调控机理研究还很不深入。在表皮葡萄球菌引起的导管相关性感染中，从生物膜中分离到的细菌虽然以表皮葡萄球菌为主，但通常还有一部分的其他细菌与其共存，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌等。在一

10、个微环境中，通常有多种细菌共同生长。例如，在尿导管表面的生物膜上发现多种细菌，以葡萄球菌、微球菌、G+杆菌为主(尿道口正常菌群) (3)。而。比如在口腔这一微环境中，一些兼性厌氧菌的生长消耗了氧气，从而创造了厌氧微环境，使绝对厌氧梭菌有可能在口腔这一开放环境中得以定植。生活在同一微环境中的微生物之间的关系，除了促进作用之外，也可以有抑制作用。比如，在体外，许多细菌如牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、产黑色素普氏菌、具核梭杆菌和二氧化碳噬纤维菌，对牙周组织有破坏作用，但如果在它们的生成环境中有血液链球菌的存在，则血液链球菌分泌的细菌素对这些细菌有抑制作用(4)。牙龈卟啉单胞菌可以在牙齿表面形成生物膜，

11、但如果和戈氏链球菌的一种突变株生活在一起，就不能形成生物膜(5)。以上的这些现象提示我们，与表皮葡萄球菌共存的细菌可能也会对表皮葡萄球菌形成生物膜产生一定影响。目前国内外对这方面的研究还未见报道，我们的研究就是基于这个假设展开的。生长在同一微环境中的细菌相互之间的作用可以大致分为两种：一，通过细菌表面结构（比如细胞壁，鞭毛，纤毛等）提供一个物理的相互作用面；二是通过细菌分泌的化学物质（比如信号分子）相互作用。本实验主要针对后一种作用方式进行研究。细菌间可以通过信号分子传递一定的信息，而数量阈值感应系统是传递细胞密度信息的一种机制。该系统通过感知周围细胞密度的变化而调控自身的基因表达，从而调控自

12、身的行为。这种感应系统分泌两种类型的信号分子（autoinducer，AI）种内信号分子和种间信号分子。前者有种属特异性，各种细菌各不相同；后者迄今为止只发现了一种，称为AI-2，可在不同种属细菌间通用。它首先在哈氏弧菌中发现，可以引起哈氏弧菌发光(6)。后来发现除了哈氏弧菌外，许多细菌都能分泌AI-2，而且这种存在于无细胞上清中的AI-2都能引起哈氏弧菌发光。表皮葡萄球菌及其常见的几种共存菌中，都存在LuxS，即AI-2合成酶，因此都有潜在分泌AI-2的能力。在表皮葡萄球菌中，我们已经证明其自身分泌的AI-2对其生物膜的形成有抑制作用。那么其他细菌分泌的AI-2对表皮葡萄球菌的生物膜是否也有

13、影响，有待我们进一步研究。综上所述，本实验主要通过与表皮葡萄球菌共存的细菌分泌的种间信号分子AI-2对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响来分析这些共存菌对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。实验材料：1 主要试剂和材料：LB培养液，TSB培养液，AB培养液，血平板，试管，PBS溶液，固定液，结晶紫溶液，EP管，针管，抽滤器，96孔板，空平板。2 菌株：华山医院寻找到的与表皮葡萄球菌共存的菌株，表皮葡萄球菌1457（野生株），表皮葡萄球菌1457LuxS突变株（AI-2合成缺陷），哈氏弧菌BB170（AI-1-AI-2+）。3 主要仪器：37培养箱，超净台，-70冰箱，离心机，分光分度计，30培养箱，荧光测

14、试仪。实验方法：一. 通过寻找文献资料和华山医院检验科资料，找出与表皮葡萄球菌共存的细菌。二. 测定与表皮葡萄球菌共存的细菌的生长曲线并确定其对数生长期：1将菌种接种到血平板上，37培养过夜。2将单克隆挑至3ml培养液中，37培养16h。转速为200rpm。3将菌液1:100稀释，分装成12管，37培养，转速为200rpm。4稀释后原管作为0h的管，此后12管分别代表112h的管，把无菌培养液作为空白对照调零，每小时进行比色一次, 测600nm处的OD值。三观察与表皮葡萄球菌共存的细菌对其生物膜形成是否有影响：1收集与表皮葡萄球菌共存的细菌的无细胞上清液。1) 将菌种接种到血平板上，37培养过

15、夜。2) 将单克隆挑至3ml培养液中，37培养16h。转速为200rpm。3) 将菌液1：100稀释至另一试管中，37培养至其对数生长期时间（细菌在此时期分泌到细胞外的AI-2最多），转速为200rpm。4) 将对数生长期的菌液倒入两个EP管中，13*103转*1min。用针管吸取无细胞上清，用抽滤器抽滤至EP管中，放入-70冰箱保存。2测试以上细菌的无细胞上清对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响(半定量生物膜检测方法)：1) 将表皮葡萄球菌1457（wt）和表皮葡萄球菌1457突变株(mu)接种至TSB平板, 37培养过夜。2) 将单克隆挑至3mlTSB培养液中，37培养16h。转速为200rpm

16、。3) 将菌液1:100稀释至新鲜培养基中，加入96孔板，培养24h使其形成生物膜。用来稀释的培养基分为2种，一种培养基中加入了一定比例（可以设定为5，10，20）的无细胞上清（CM），此无细胞上清即是放入-70冰箱的保存物，用时提前融化约半小时左右。另一种培养基中则未加无细胞上清液。每块96孔板共检测2种共存菌的无细胞上清液。每孔容量为200ul，四孔准备共1ml液体备用。96孔板上分布如下： 123456789101112Awt(0%)：990ulTSB+10ul菌液TSBwt(0%)：990ulTSB+10ul菌液Bwt(5%)：940ulTSB+10ul菌液+50ulCM1TSBwt(

17、5%)：940ulTSB+10ul菌液+50ulCM2Cwt(10%):890ulTSB+10ul菌液+100ulCM1TSBwt10%):890ulTSB+10ul菌液+100ulCM2Dwt(20%):790ulTSB+10ul菌液+200ulCM1TSBwt(20%):790ulTSB+10ul菌液+200ulCM2Ewt(0%)：990ulTSB+10ul菌液TSB wt(0%)：990ulTSB+10ul菌液Fwt(5%)：940ulTSB+10ul菌液+50ulCM1TSBwt(5%)：940ulTSB+10ul菌液+50ulCM2Gwt(10%):890ulTSB+10ul菌液+

18、100ulCM1TSBwt(10%):890ulTSB+10ul菌液+100ulCM2Hwt(20%):790ulTSB+10ul菌液+200ulCM1TSBwt(20%):790ulTSB+10ul菌液+200ulCM24) 24h形成生物膜后，吸出孔内菌液，用PBS反复洗4遍，加固定液Bouin固定1h以上，吸出固定液，再用PBS洗4遍，最后用2的结晶紫染色1min，洗去染液，晾干，测570nm处的OD值。四检测与表皮葡萄球菌共存的细菌是否分泌AI-2：1 把表皮葡萄球菌的共存菌用AI-2检测系统检测其无细胞上清液中有无AI-2分子。本次实验用于检测AI-2的报告菌株是哈氏弧菌BB170（

19、AI-1-AI-2+），此种细菌表面有LuxQ，可以识别AI-2（包括LuxP的参与），然后通过一系列磷酸化过程传递信息，最终调节它本身的LuxCDABE基因的表达，使细菌发光。 若干干777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777771) 将AI-2报告菌株哈氏弧菌BB170（AI-1-AI-2+）接种到LB（NaCl为2%）平板上，30培养过夜。2) 将单克隆挑至3mlAB培养液中，30培养16h。

20、转速为200rpm。3) 1:5000稀释该菌液（提供能感应表皮葡萄球菌分泌的AI-2而发光的细胞，而在此稀释浓度下其自身分泌的AI-2可以忽略不计）。4) 从-70冰箱中取出上述无细胞上清液，以1:10的比例与稀释过的BB170细胞混合，加入96孔板中，检测其发光值，同时设立不加入无细胞上清液的BB170菌液作为阳性对照组。123456789101112A1000ul BB1701000ul AB1000ul BB170B900ul BB170+100ul菌1 CM1000ul LB900ul BB170+100ul菌1 CMC900ul BB170+100ul菌2 CM1000ul TSB

21、900ul BB170+100ul菌2 CMD900ul BB170+100ul菌3 CM900ul BB170+100ul菌3 CME1000ul BB1701000ul AB1000ul BB170F900ul BB170+100ul菌4 CM1000ul LB900ul BB170+100ul菌4 CMG900ul BB170+100ul菌5 CM1000ul TSB900ul BB170+100ul菌5 CMH900ul BB170+100ul菌6 CM900ul BB170+100ul菌6 CM5) 每隔1h测一次发光值，直至5小时。选出较稳定的发光值。实验结果：一. 为了研究与表皮

22、葡萄球菌共存的细菌对表葡菌生物膜形成是否有影响，通过文献资料以及华山医院检验科资料寻找表葡共存菌，发现与表皮葡萄球菌共存菌有以下几种：1. 据文献报道，在导尿管表面生物膜中分离出的表葡共存菌大多数为：大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌，金黄色葡萄球菌，溶血性葡萄球菌，粪肠球菌；而在气管导管内壁生物膜分离出的表葡共存菌大多数为：大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，肺炎克雷伯杆菌，鲍曼不动杆菌。而这些细菌即是本次实验重点研究的对象。2. 除了寻找到与表葡共存菌外，在华山医院检验科资料中还发现了一些重要院内感染菌：粘质沙雷菌和嗜麦芽窄食单胞菌。这些细菌可以作为表葡共存菌的对照和补充。3. 此外，

23、在华山医院检验科资料中还寻找到一些重要的体内正常寄生菌：中间肠杆菌，奇异变形杆菌，也同样作为表葡共存菌的对照和补充。从华山医院检验科获取并培养以上这些细菌，为后面实验做准备。二. 测定表葡共存菌的生长曲线：细菌在对数生长期生长速度快，细菌间信息交流多，分泌到细胞外的信号分子也多，因此选用这个时间点培养细菌，进行后面部分的实验。为了测出对数生长点，就必须画出生长曲线。通过培养表葡共存菌，测得这些细菌菌液的12个小时的OD值，将测得的数值绘成图表1,即为表皮葡萄球菌共存菌的生长曲线，得到这些细菌的对数生长时间点。图表 1表皮葡萄球菌共存菌生长曲线从图表1中可得各表皮葡萄球菌共存菌的对数生长期的时间

24、点： 大肠为2h； 奇异，阴沟，中肠，肺克为2.5h；粘沙，粪肠，绿脓，金葡，溶葡，鲍曼为3h；嗜麦芽为4h。三. 观察与表皮葡萄球菌共存的细菌对其生物膜形成是否有影响：通过将与表皮葡萄球菌共存的细菌的无细胞上清液以不同的浓度加入表皮葡萄球菌1457（野生株）和表皮葡萄球菌1457LuxS突变株（AI-2合成缺陷）共同培养，来观察野生株和突变株生物膜的变化。重复三次，在得到的结果中，大肠杆菌，金葡菌，粪肠球菌，绿脓杆菌这四种细菌具有典型的代表意义。a.b.c.d.图表2 四种表葡共存菌的无细胞上清液对表葡生物膜形成的影响 图表2中，两条曲线分别代表表葡野生株和表葡突变株生物膜随着表葡共存菌的无

25、细胞上清液浓度的增加而改变的过程，如果生物膜生成越多，染色就越深，OD值也就越高；反之亦然。图表2a中，两条曲线完全不同，大肠杆菌对表葡野生株的生物膜无明显影响，而突变株的生物膜却随着大肠杆菌上清液浓度的增加而明显减少，说明大肠杆菌对表葡突变株的生物膜有抑制作用；图表2b中，两条曲线基本平行，均没有随无细胞上清液浓度的增加而发生变化，说明金葡对表葡野生株和突变株的生物膜均无明显影响；图表2c和图表2d的曲线类似，两条曲线均随着无细胞上清液浓度的增加而下降，说明粪肠球菌和绿脓杆菌对表葡野生株和突变株的生物膜均有明显的抑制作用。四. 用AI-2检测系统检测与表皮葡萄球菌共存的细菌是否分泌AI-2：

26、利用哈氏弧菌BB170（AI-1-AI-2+）可以识别AI-2并发光的特性检验无细胞上清液中是否含有AI-2，发光值的高低可以在一定意义上代表AI-2活性的强弱和浓度的高低。将表葡共存菌的无细胞上清加入到哈氏弧菌BB170中共培养，经过实验发现，大多数情况下，细菌在3小时的发光值最为稳定，将测得的稳定的发光值除以同时刻的阳性对照组（不加入共存菌无细胞上清液的哈氏弧菌BB170菌液）的发光值，其比值若为阳性，则表示此共存菌的无细胞上清液中含有AI-2；若为阴性则反之。比值越高，说明含有的活性AI-2的成分越多。将三次重复实验的数值绘成图表3。由图表3可知，在表葡的共存菌中，荧光值为阳性的是溶葡，

27、大肠，肺克，粘沙，奇异，中肠，阴沟，鲍曼，金葡，分泌AI-2；荧光值为阴性的是绿脓，嗜麦芽，粪肠，不分泌AI-2。图表3 表葡共存菌的无细胞上清液中AI-2的荧光比值纵坐标为表葡共存菌的无细胞上清液的发光值除以同时刻的阳性对照组（不加入共存菌无细胞上清液的哈氏弧菌BB170菌液）的发光值后的比值，溶葡，大肠，肺克，粘沙，奇异，中肠，阴沟，鲍曼，金葡含AI-2；绿脓，嗜麦芽，粪肠不含AI-2。讨论：通过寻找文献资料和华山医院检验科资料，寻找到与表皮葡萄球菌共存菌有以下几种：大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌，金黄色葡萄球菌，溶血性葡萄球菌，粪肠球菌，大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，肺炎克

28、雷伯杆菌，鲍曼不动杆菌，粘质沙雷菌，嗜麦芽窄食单胞菌，中间肠杆菌，奇异变形杆菌。我们的研究发现，大多数共存菌对表皮葡萄球菌生物膜的形成有一定的抑制作用，其中比较具有代表性的是：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，粪肠球菌，绿脓杆菌。通过AI-2检测系统可以检测到溶葡，大肠，肺克，粘沙，奇异，中肠，阴沟，鲍曼，金葡中有大量AI-2分泌；而绿脓, 嗜麦芽，粪肠不分泌AI-2。通过实验，发现以下四种细菌具有比较典型的作用：1) 大肠杆菌的无细胞上清对突变株和对野生株的作用有明显的差别。对表皮葡萄球菌1457 LuxS突变株（AI-2合成缺陷）生物膜的形成有明显的抑制作用，而对表皮葡萄球菌1457生物膜的形成抑

29、制作用不明显，而这两种菌株遗传背景完全相同，只是突变株丧失了合成AI-2的能力，而我们收集的菌无细胞上清里经鉴定有大量的AI-2的存在，并可以说明大肠杆菌分泌的AI-2可以被表皮葡萄球菌的数量阈值感应系统所感应，传递种间信息，抑制其生物膜的形成。因此，大肠杆菌很可能就是通过AI-2向表皮葡萄球菌传递信息。2) 金黄色葡萄球菌虽然可以分泌AI-2，但发光值不高，在我们研究中，无论是野生株还是突变株，都并未发现它明显抑制生物膜的形成。由于数量阈值感应系统是需要信号分子积累达到一定阈值才能激发的过程，因此本实验中金黄色葡萄球菌分泌的AI-2很可能未达到表皮葡萄球菌可以感知的阈值，所以未能发挥作用。为

30、了排除实验中由于金黄色葡萄球的菌株特异性而导致分泌AI-2不够高的情况，我们还选取金黄色葡萄球菌的标准株和另一株临床金黄色葡萄球菌检测AI-2的分泌情况，发现发光值同原实验株一样，虽然为阳性，但发光值不高。通过查看金黄色葡萄球菌的表皮葡萄球菌两种细菌的LuxS的基因序列，并经过比对，发现金黄色葡萄球菌的表皮葡萄球菌此段基因的相似度为95.5%，但两种细菌分泌AI-2的能力却不同，因此推断可能金黄色葡萄球菌LuxS的表达没有表皮葡萄球菌强，分泌的AI-2数量比较少，也有可能是LuxS基因以外存在其他基因序列，对LuxS基因的表达及AI-2分子的作用发挥起到调控作用。3) 粪肠球菌，绿脓杆菌：不分

31、泌AI-2，但能抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，可能这两种细菌可以分泌其他信号分子，同样被表皮葡萄球菌所感应，从来抑制其生物膜的形成。综上所述，通过本次实验，可以发现与表皮葡萄球菌共存的细菌会分泌种间的信号分子，可以被表皮葡萄球菌所感应，并对其生物膜的形成有影响。并进一步揭示表皮葡萄球菌的致病机理，对探索抑制生物膜形成的方法、筛选新的抗表皮葡萄球菌感染的药物靶标提供了新的方向。通过从与表皮葡萄球菌共存的细菌着手来影响生物膜的形成，为防治生物膜的相关感染提供了新的思路。生物膜也是多种病原菌的致病因子，本研究结果也可以为研究其它细菌所借鉴。参考文献1.C. Vuong, M. Otto, Micro

32、bes Infect 4, 481-9 (Apr, 2002).2.Y. Q. Zhang et al., Mol Microbiol 49, 1577-93 (Sep, 2003).3. J.H.Gu,R.H.Yang, Chin J Nosocom iol, 13-9 (2003)4. J.Z.Zhang,Y.M.Suo, 华西口腔医学杂志,12-4 (1994)5. R.Mcnab,S.K.Ford,Journal of Bacteriology,185-1(Jan,2003)6.M. G. Surette, B. L. Bassler, Proc Natl Acad Sci U S A 95, 7046-50 (J