饲料中沙门氏菌的监测概况及常规检测技术应用

1、饲料中沙门氏菌监测情况及常规检测技术的应用 常规沙门氏菌检测技术的应用 背景 1 饲料中沙门氏菌污染情况23背景沙门氏菌的检测是各国检验机构对多种食品的必检项目之一公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一引起食物中毒的重要病原菌在各类细菌性的食物中毒中沙门氏菌常居前列不得检出饲料卫生标准食品安全国家标准欧盟ICMSFCAC沙门氏菌DANIEL ELMER DANIEL ELMER SALMONSALMON, , (1850-1914)(1850-1914)美国兽医微生物和病理学家。美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学是美国授予的第一位兽医学博士。博士。18841884年任美国农业

2、部年任美国农业部畜牧局首任局长。他首次从畜牧局首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门氏病猪中分离出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的菌。在医学微生物中通用的沙门氏菌一词，就是为纪念沙门氏菌一词，就是为纪念他而以他的名字命名的。他而以他的名字命名的。沙门氏菌（Salmonella）一群形态、培养、生化反应和抗原构造相类似的杆菌，种类繁多。已发现2500多种血清型，我国目前发现的有200多种血清型。沙门氏菌主要生物学性状革兰氏阴性短杆菌，革兰氏阴性短杆菌，无芽孢和荚膜，有无芽孢和荚膜，有鞭毛（除鸡白痢沙鞭毛（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外），大多门氏菌外），大多数具有毛。数

3、具有毛。需氧或兼性厌氧；普通营养琼脂上需氧或兼性厌氧；普通营养琼脂上生长良好。生长良好。7-457-45均可生长，最适温度均可生长，最适温度3737，最适最适pH6.8-7.8pH6.8-7.8。抵抗力60 20-30min即被杀死在水中能生存23周在粪便中可生存12个月在冰中能生存3个月 沙门氏菌生物学特性 伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌鸡伤寒沙门氏菌及一部分及一部分鸡白痢鸡白痢沙门氏菌沙门氏菌发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不发发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不发酵麦芽糖。酵麦芽糖。O抗原抗原 Vi抗原抗原H抗原抗原OO抗原抗原：为脂多糖，多糖部分决定其特异性，耐热：为脂多糖

4、，多糖部分决定其特异性，耐热(100(100、2.5h2.5h不破坏不破坏) )，其特异性不易丧失或变异。，其特异性不易丧失或变异。H H抗原抗原：H H抗原存在于鞭毛中，蛋白质，不耐热，抗原存在于鞭毛中，蛋白质，不耐热，6060、30-60min30-60min及酒精作用均可破坏其抗原性，能抵抗甲醛。及酒精作用均可破坏其抗原性，能抵抗甲醛。ViVi抗原抗原：是一种：是一种N-N-乙酰乙酰-D-D-半乳糖胺糖醛酸聚合物，半乳糖胺糖醛酸聚合物，6060加热加热1h1h即破坏其凝集性和免疫原性。即破坏其凝集性和免疫原性。DHL:无色半透明有黑色中心或几乎全为黑色酚红黄绿：菌落呈红色透明，同时培养基

5、颜色变红HE：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色科马嘉显色培养基：呈紫色或紫红色沙门氏菌在不同选择琼脂平板上的菌落特征沙门氏菌伤寒和副伤寒急性肠胃炎败血症内毒素对人的危害 据调查，沙门氏菌是美国食物中毒致死的主要原因。美国每年大约报告40000例沙门氏菌感染病例。但实际的感染人数可能要达20倍以上，因为许多轻型病人可能未确诊，据不完全统计，每年大约1000人死于急性沙门氏菌感染。沙门氏菌对动物的危害 畜禽食用含有沙门氏菌的饲料，就可引起疾病或带菌。一般情况下畜禽肠道带菌率比较高。当动物因患病、衰弱、营养不良、疲劳以致抵抗力降低时，肠道中的沙门氏菌即可经肠系膜淋巴结和淋巴组织进入血液引起

6、全身感染，甚至死亡。（1）急性败血症 多见于断奶前后（24月龄）仔猪，主要由猪霍乱沙门氏菌引起。发热，拒食，耳根，胸前，腹下等处皮肤出现紫斑，后期见下痢，呼吸困难，咳嗽跛行，经14d死亡。病死率可达2040。（2）亚急性和慢性 表现为：体温升高，畏寒；结膜炎， 顽固性下痢，伴以消瘦，脱水而死；部分病猪在病中后期皮肤出现弥漫性湿疹。（1）雏鸡感染：引起败血症，可造成大批死忙 ；病鸡表现虚弱，口渴，食欲不振，腹泻，发育迟滞等。（2）成年鸡：最常见产蛋量降低或停止。另外可引起卵巢炎，可在卵黄内带菌而传给幼雏。（1）犊牛：体温升高，呼吸困难；排出血丝粪便；病期延长时，腕和跗关节可能肿大，有时伴有支气管

7、炎和肺炎症状。（2）成年牛：常有高热，昏迷，食欲废绝，呼吸困难，体力迅速衰竭；怀孕母牛多数发生流产。传播途径最主要的传播途径是水、土壤和饲料病菌随人和动物的粪尿等排泄物及病死畜禽来污染土壤和水源因宰杀患病、带菌的畜禽而造成病菌的散布，致使健康动物的胴体和环境受到污染饲料和饮水的污染，是导致畜禽沙门氏菌病以及相互传染的主要原因 危害程度分类 中华人民共和国卫生部人间传染的病原微生物名录序号病原菌名称危害程度分类实验活动所需生物安全实验室级别学名中文名大量活菌操作1 S a l m o n e l l a choleraesuis猪霍乱沙门菌第三类BSL-22Salmonella enterica

8、肠沙门菌第三类BSL-23Salmonella meleagridis火鸡沙门菌第三类BSL-24Salmonella paratyphi A,B,C甲、乙、丙型副伤寒沙门菌第三类BSL-25Salmonella typhi伤寒沙门菌第三类BSL-26Salmonella typhimurium鼠伤寒沙门菌第三类BSL-2 加强饲料的卫生管理，防止沙门氏菌的污染，不仅是发展畜禽生产的需要，也是减少人类感染沙门氏菌、预防食物中毒的一个重要环节。意义Torres G J等2011年对西班牙3844个饲料样品检测发现，沙门氏菌的检出率为4.8%美国对12个牛场的295份饲料样品进行沙门氏菌检测，检出

9、率为9.8% 国外沙门氏菌污染情况传统检测方法 分子生物学方法免疫学方法常规沙门氏菌检测技术国内现行标准分子生物学方法免疫学方法传统检测方法GB/T13091-2002（培养法）GB/T 4789.4-2010（培养法）GB/T29642-2012（PCR法）SN/T 1059.7-2010（实时荧光PCR法）GB/T 22429-2008（酶联免疫法）DB34/T816-2008（免疫色谱反应法）传统检测方法前增菌选择性增菌分离培养生化鉴定血清学鉴定传统检测方法原理沙门氏菌生化特性修复受损伤的沙门氏菌饲料中含大量杂菌主要培养基、试剂、血清 缓冲蛋白胨水（BPW） 氯化镁-孔雀绿增菌液（RV）

10、 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC） 酚红黄绿琼脂 DHL琼脂 营养琼脂 色氨酸肉汤 赖氨酸脱羧酶肉汤 尿素酶 氰化钾培养基 甘露醇 山梨醇 -半乳糖苷 沙门氏菌 O，Vi，H型血清主要仪器设备与材料高压灭菌锅干热灭菌箱培养箱水浴锅接种环培养瓶或三角瓶 量筒平皿25g样品225ml BPW36 16-20h1ml BPW增菌液+10ml SCMM增菌液在42、SC增菌液在36各培养24h0.1ml BPW增菌液+10ml MM分别从MMMM和SCSC增菌液中取1环，接种到酚红黄绿和DHL琼脂上培养在36培养20-24hDHL琼脂在36培养24h分别选择性培养基上挑选可以菌落进行TSI等生化鉴定TSI

11、生化试验底层产H2S底层产酸斜面产碱斜面底层产酸产碱底层产酸斜面产碱底层产H2S产酸产气产酸产气产H2S只在TSI产碱的情况下可判定无沙门氏菌，其余任何情况均需进行生化鉴定生化鉴定O.5个麦氏浊个麦氏浊度的菌悬液度的菌悬液依次在每个安瓿依次在每个安瓿瓶中滴加菌悬液瓶中滴加菌悬液23滴。滴。第一步第一步第二步第二步第三步第三步生化鉴定试剂套装色氨酸肉汤经36，1824h培养后滴加靛基质试剂，片刻观察结果，阳性为玫瑰红色色氨酸脱羧酶及对照和氰化钾及对照转种结束后需滴加液体石蜡覆盖试验管方可进行培养靛基质试验+时补做甘露醇山梨醇试验，试验阳性后进行血清学鉴定TSI-时，进行ONPG试验，ONPG阴性

12、时进行血清学鉴定H2S+、靛基质- 、尿素-、KCN-、赖氨酸+后进行血清学鉴定结果判定 其他商品化生化鉴定系统其他商品化生化鉴定系统VITEK GNI+ 应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。VITEK6-8h商品化生化鉴定系统API 20E API 20E 生化鉴定是根据快速酶促反应及代谢产物的检测技术发展而来的一种细菌编码鉴定法，广泛应

13、用于临床、食品中革兰氏阴性杆菌的快速鉴定。API 20E18-24hAPI 20E第第1位数位数第第2位数位数第第3位数位数第第4位数位数第第5位数位数第第6位数位数第第7位数位数结结果果判判定定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX1 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 4反应反应结果结果- + + + +- - - - + + + - +- + -沙沙门门氏氏菌菌应得应得数值数值0 2 41 2 40 0 0 0 0 41 2 41 0 40 2 0组合组合编码编码 6 7 0

14、 4 7 5 2BD PhoenixTM 1002-8h血清学鉴定 阴性 阳性 GB/T29642-2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法-聚合酶链式反应（PCR）法SN/T 1059.7-2010 进出口食品中沙门氏菌检测方法-实时荧光PCR法现行标准PCR技术原理 PCR技术是是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA目的片段进行短时间内大量扩增的技术。25g样品225ml BPW36 16-20h1ml BPW增菌液+10ml SCRVS增菌液在41.5、SC增菌液在36各培养243h0.1ml +10ml 大豆蛋白胨肉汤（RVS）煮沸离心PCR扩增电泳检测GB/T29642

15、-2012-主要仪器设备、培养基、试剂PCR仪离心机微量移液器电泳仪凝胶成像仪分析天平缓冲蛋白胨水大豆蛋白胨肉汤亚硒酸盐胱氨酸增菌液引物Premix Taq DNA 聚合酶琼脂糖Marker 2000TAE缓冲液溴化乙锭（EB）-GB/T29642-2012DNA模板制备方法方法一：热裂解法 取选择性增菌液1ml于离心管中，12000r/min离心10min，灭菌去离子水洗涤2次，最后用0.2ml灭菌去离子水悬浮，煮沸10min，将离心管迅速转移至冰浴中冷却，10000r/min离心5min，取上清液作为模板。方法二：试剂盒 可选用商业试剂盒。-GB/T29642-2012PCR扩增 反应体系

16、 反应程序 -GB/T29642-2012PCR结果分析及判定结果判定：在阴性对照无条带，阳性对照有条带的前提下，如果待测样品再330处未出现相应大小的扩增条带，则可报告未检出沙门；如果待测样品在330bp处出现扩增条带，则为疑似阳性样品，需用GB/T 13091进行确证，最终结果以后者为准。-GB/T29642-2012实时荧光PCR原理实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过阳性对照、Ct值及扩增曲线对模板进行定性分析的方法。25g样品225ml BPW36 16-20h1ml BPW增菌液+10ml SCRVS增菌液在41.5、S

17、C增菌液在36各培养243h0.1ml +10ml 大豆蛋白胨肉汤（RVS）煮沸离心反应体系扩增曲线实时荧光PCR法主要仪器设备、培养基、试剂 荧光定量PCR仪 离心机 微量移液器 恒温水浴锅 高压灭菌锅 缓冲蛋白胨水 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 四硫磺酸钠孔雀绿增菌液 引物 探针 DNA提取试剂盒 Taq DNA聚合酶-SN/T 1059.7-2010模板DNA的制备方法一：热裂解法 取增菌液1ml，置于离心管中，5000r/min离心5min，灭菌生理盐水洗涤2次，最后用1ml灭菌去离子水悬浮，煮沸15min，10000r/min离心5min，取上清液作为模板。方法二：试剂盒法 参照美国Prom

18、ega公司生产的DNA抽提试剂盒，或其他等效产品操作程序进行。-SN/T 1059.7-2010实时荧光PCR扩增反应体系（25ul）反应条件10PCR缓冲液2.5uldNTPs1ul上游引物1ul下游引物1ul探针1ul模板2ulTaq DNA 酶0.5ul双蒸水16ul1个循环9510min40个循环9515s6530s-SN/T 1059.7-2010 样品Ct值35时，报告沙门氏菌筛选阳性； 样品Ct值介于35-40之间，重复一次，如果Ct值40，且曲线有明显的对数增长期，报告沙门氏菌筛选阳性，否则，报告未检出； 样品Ct值40时，报告未检出。 筛选阳性的样品按SN0170的规定进行确证，以确证结果为准。结果分析及判定-SN/T 1059.7-2010其他分子生物学技术环介导等温扩增技术（LAMP）多重PCR技术基因芯片技术免疫学方法现行标准GB/T 22429-2008食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验（酶联免疫法）DB 34/T 816-2008饲料中沙门氏菌的测定（免疫色谱反应法）技术原理 免疫学检测是基于免疫学理论基础，根据抗原抗体的特异性反应而进行检测的技术。 沙门氏菌特异性抗体是快速定性检测的基础。主要仪器设备、培养基、试剂酶联免疫分析