第十二章乳蛋白质化学

1、第十二章第十二章 乳蛋白质化学乳蛋白质化学 乳蛋白质包括酪蛋白和乳清蛋白两大类。 正常牛乳中蛋自质含量为30 -35g/L，这些蛋白质中的80%是以酪蛋白胶体形式存在。 酪蛋白胶体中含92%的蛋白和8%的无机盐，无机盐土要以磷酸钙为主，乳中约65%的钙存在于酪蛋白中，仅有10%以游离钙的形式存在。第一节第一节 酪蛋白化学酪蛋白化学 一、酪蛋白的遗传变种和性质一、酪蛋白的遗传变种和性质 酪蛋白占乳蛋白的76%-86%，包括s1酪蛋自、。s2酪蛋白、-酪蛋白、-酪蛋白。 其它的酪蛋白来源于酪蛋白的磷酸化和糖苷化及有限水解，最常见的是as2酪蛋白磷酸化、一酪蛋白的糖苷化和-酪蛋白水解，产生-酪蛋白、

2、肽等。 s1酪蛋白的遗传变种为5个，s2酪蛋白为4个，-酪蛋白是7个，-酪蛋白有2个，不同的遗传变种在牛乳中有不同的概率和分布，不同品种牛之问、同一品种的牛之间均呈一定的差异性。 酪蛋白遗传变种的发现和命名以及其所含细微成分的确认和证实，均依赖于蛋白的传统分离技术、电泳技术和柱色谱技术等。 二、酪蛋白的化学组成二、酪蛋白的化学组成 三、酪蛋白的一级结构三、酪蛋白的一级结构 （一）（一）s1酪蛋白的一级结构酪蛋白的一级结构 s1酪蛋白中疏水性残基、带电荷残基的分布是不均匀的，在氨基酸序列中疏水区、电荷比-乳球蛋白、-乳白蛋白更明显。 疏水区在144，90113,132199氨基酸区段。 磷酸化是

3、s1酪蛋白（钙敏性蛋白质）的特征结构。 （二）（二）s2酪蛋白的一级结构酪蛋白的一级结构 s2酪蛋白在所有酪蛋白中亲水性最强。 结构中有三簇带负电的磷酸丝氨酸、谷氨酸残基，即位于812,56 63,129 133氨基酸位。 有两个区域相对疏水，即C端序列的160207位和90120位。 （三）（三）-酪蛋白的一级结构酪蛋白的一级结构 -酪蛋白是所有酪蛋白中疏水性最强的。 含有负电荷的磷酸化丝氨酸簇N端和非常疏水的C端清晰区分开来。 pH6.6时N端21残基的极性区域有-11.5的静电荷，而强疏水的C端没有静电荷。 极性区域链长度的1/10带全部电荷的1/3，而疏水性C端占整个链长的3/4的特定

4、结构决定了-酪蛋自的强疏水性。 （四）（四）-酪蛋白的一级结构酪蛋白的一级结构 没有磷酸丝氨酸簇和苏氨酸糖苷化残基，故使-酪蛋白不能结合钙。 有约1105(副-酪蛋白)的强疏水性N端，和一个极性的C端。 功能特性：功能特性： 和钙敏性酪蛋白间相互作用; 极性区域对钙离子不敏感; 被凝乳酶专一性地有限水解。在干酩加工中凝乳酶专一性地断裂Phe105-Met106链，导致极性糖巨肽从-酪蛋白中分离，从而去除了酪蛋白胶粒的表面极性静电和位阻稳定性，使表面疏水性增加，而产生胶体凝集四、酪蛋白的空间结构四、酪蛋白的空间结构 酪蛋白的二级结构通过CD和Raman光谱的方法测定，但数据仅有一定参考意义。 五

5、、酪蛋白的自聚五、酪蛋白的自聚 （一）（一）s1酪蛋白的自聚酪蛋白的自聚 s1酪蛋白在pH6时除去酪蛋白中有最弱疏水性的s2酪蛋白后，它带有最大量的电荷。 疏水基团在长链中呈不均匀分布，在低离子强度(0.0030. 01mol/L)的中碱性溶液中是单体，离子强度增加，自聚作用增强。 自聚作用受pH影响，pH升高自聚减少，而温度对自聚的影响很小。 s1酪蛋白可形成二聚、三聚、六聚侧等。 （二）（二）s2酪蛋白的自聚酪蛋白的自聚 s2酪蛋白疏水比弱，能高度磷酸化，其磷酸脂在长链的三簇中均有分布。 聚合度强烈地依赖于离子强度(I),离子强度增加，聚合度增加，但当I0.2mol/L时，离子强度增加，聚

6、合反而减弱。 本身带有负电荷的酪蛋白之间有排斥力。低离子强度时排斥力占主导地位，离子强度增加，排斥力减弱，吸引力增强，但当离子强度太高时会出现相反的情况。 （三）（三）-酪蛋白的自聚酪蛋白的自聚 自聚作用依赖于离子强度和温度。 在低温低离子强度时仅有单体-酪蛋白存在，温度和离子强度增加，聚合作用增大。 pH对其聚合的影响尚未能完全确定。 （四）（四）酪蛋白的自聚酪蛋白的自聚 -酪蛋白和-酪蛋白的自聚作用相似。 -酪蛋白的自聚形态和-酪蛋白不同，-酪蛋白不受温度、离子温度影响而形成固定大小的聚合体。 这主要缘于c端区域相对低的电荷，带负电荷C端间的相互排斥和胶体体积限制的空间要求也起了一定的作用

7、。六、六、 酪蛋白的金属结合性质酪蛋白的金属结合性质 所有酪蛋白均能结合不同的二价金属离子。 酪蛋白中磷酸丝氨酸残基的磷酸基团是钙的主要结合部位，此外，钙也和其它基团如天门冬氨酸、谷氨酸的羧基结合。 酪蛋白的钙结合能力按s2酪蛋白s1-酪蛋白-酪蛋白-酪蛋白的顺序下降。 在pH7.0时，钙和酪蛋白的结合减少了它们的负电荷，减少了分子间的静电排斥，引起聚合直至最后沉淀。-酪蛋白因其含磷酸丝氨酸基团少而没有上述现象。 -酪蛋白能防止其它酪蛋白的钙诱导沉淀，这是乳中含有大量钙，足以使s1-酪蛋白、s2-酪蛋白、-酪蛋白沉淀而酪蛋白胶体呈溶解性的原因。 钙和酪蛋白的结合受pH、温度、离子强度的影响，和

8、钙离子导致沉淀的浓度影响呈一致性。 故平衡结合常数随pH、温度的增加而增加，随离子强度的增加而下降，这些常数对s1-酪蛋白、-酪蛋白是相似的。 在Ca2+浓度为01.0mmol/L时，结合是一个放热反应。钙离子结合于磷酸丝氨酸、酪氨酸、色氨酸由水相转移至极性环境。 在Ca2+浓度为1.03.0mmol/L时，随浓度的增加，进入第二个放热相。Ca2+结合于磷酸丝氨酸基团和羧基，浊度稍微增加。 在Ca2+浓度为3.05.0mmol/L时，反应呈强吸热。Ca2+在羧基上的结合继续，浊度迅速增加最终形成沉淀。七、酪蛋白胶体七、酪蛋白胶体 酪蛋白胶体是四种酪蛋白组分与磷酸钙、少量镁钠、钾和柠檬酸盐形成的

9、大的结合体。 （一）酪蛋白胶体中酪蛋白组分的位置（一）酪蛋白胶体中酪蛋白组分的位置 Schmidt和Both：-酪蛋白位于酪蛋白胶体的表面，s1-酪蛋白、-酪蛋白均匀分布于整个酪蛋白胶体。 Farrell：在大的胶体中-酪蛋白位于表面，小的胶粒则均匀分布于整体。 Dalgleish：胶体外层是由等摩尔的s-酪蛋白、-酪蛋白和少量-酪蛋白组成，内部则由等摩尔的s-、-酪蛋白和少量-酪蛋白构成。 （二）酪蛋白胶体的结构（二）酪蛋白胶体的结构 Stothart等研究证明酪蛋白存在亚单元。Kumosinski等研究支持这一学说，亚微粒在钙不存在情况下呈电荷的不均匀分布，故他们认为亚单元有一个高电子密度

10、的核心，并被低电子密度的浓缩外壳包围。 （三）酪蛋白胶体的解离（三）酪蛋白胶体的解离 在恒定pH情况下钙离子从胶体中的逐渐移去会引起酪蛋白的释放，开始时未影响胶体的体积，最终会引起胶体的完全解离。 在胶体中单个酪蛋白解离速度：-酪蛋白-酪蛋白s1-酪蛋白s2-酪蛋白，这和每个酪蛋白中磷酸酯含量下降相一致。 （四）胶体磷酸钙（四）胶体磷酸钙 酪蛋白胶体除含各种酪蛋白外，还含有Ca, Mg、无机磷酸盐和柠檬酸盐。 阴阳离子的相互作用构成了胶体相中的胶体磷酸钙，它和酪蛋白相互作用成为酪蛋白胶体的一部分。 胶体磷酸钙的结构存在有两种不同的观点：一种认为胶体磷酸钙是以Ca3(PO4)的形式存在；一种认为

11、酪蛋白的磷酸酯化基团和钙结合在一起。也有人认为胶体磷酸钙应是一个不同于前两种形态的特殊类型结构。 （五）酪蛋白胶体的理论模型（五）酪蛋白胶体的理论模型 1. “套核”模型(Coat core models) 胶体的核是由s、-酪蛋白形成球体颗粒构成，-酪蛋白构成外表面即“套”。 2.内部结构模型内部结构模型 双结合模型 s1、s2、-酪蛋白之间既可以通过疏水作用力结合在一起，又可以通过磷酸钙（CCP）的交联作用相互连接，形成酪蛋白胶束的核心部分。 -酪蛋白几乎不含磷酸丝氨酸，位于胶束的表面，因此它不但不能与胶束中的磷酸钙交联，同时还会阻止胶束核的增长，在酪蛋白胶束的表面形成一层保护壳，这样就能

12、使胶束在溶液中稳定地存在。图2 酪蛋白胶束的双结合模型示意图 3.亚单元模型 酪蛋白首先通过疏水相互组成一个个含15-20个酪蛋白分子的亚单元结构。 这种亚单元结构又可以分成两类：富含-酪蛋白的亚单元和-酪蛋白含量很少的亚单元。富含-酪蛋白的亚单元形成了酪蛋白胶束的表面结构，而-酪蛋白含量很少的亚单元位于酪蛋白胶束的内部，各个亚单元通过磷酸钙相互连接，进而形成酪蛋白胶束。 由于内部的亚单元结构疏水性较强，而胶束表面的亚单元结构的亲水性较强，因此酪蛋白胶束能在溶液中稳定地存在。 酪蛋白胶束的中心部分是磷酸钙将酪蛋白缠绕在一起而形成一种无定形状态的微簇状的结构。 -酪蛋白以毛发层状的结构存在于胶束

13、的表面并伸向溶液中。 同时-酪蛋白的这种毛发层结构会提供静电作用，使酪蛋白胶束能稳定地存在于溶液之中。4.微簇结构模型 总之，虽然许多学者提出的酪蛋白胶束结构的总之，虽然许多学者提出的酪蛋白胶束结构的假说模型各不相同，但是大都认为，假说模型各不相同，但是大都认为，-酪蛋白酪蛋白处于酪蛋白胶束的表面，在维持酪蛋白胶束结处于酪蛋白胶束的表面，在维持酪蛋白胶束结构的稳定性方面起到了决定性的作用。构的稳定性方面起到了决定性的作用。第二节第二节 乳清蛋白化学乳清蛋白化学 乳清蛋白主要包括-乳白蛋白、-乳球蛋白、血清白蛋白免疫球蛋白等。 一、一、-乳球蛋白乳球蛋白 -乳球蛋白是反刍动物如牛、羊和单胃动物如

14、猪、马、猫乳中的主要乳清蛋白，人乳和啮齿动物乳中含量极微。（一）（一）-乳球蛋白的遗传变种和一级结构乳球蛋白的遗传变种和一级结构 牛-乳球蛋白有8个遗传变种，即-乳球蛋白A、B、C、D、E、F、G、Dr。 反刍动物-乳球蛋白的序列不同。（二）（二）-乳球蛋白的理化性质乳球蛋白的理化性质 1.1.分子大小分子大小 单个-乳球蛋白的相对分子质量为18200，二聚体为36000。 正常牛乳中-乳球蛋白是以二聚体的形式存在，在pH3.5时解离为单体。 当pH由4.5变化至2.0时，伴随着缓慢的构象变化，二聚体迅速解离为单体。（二）（二）-乳球蛋白的理化性质乳球蛋白的理化性质 2.-2.-乳球蛋白的变性

15、乳球蛋白的变性 碱性物质、加热、有机化合物和金属离子均会引起-乳球蛋白变性。 在pH8以上-乳球蛋白的变性变得明显，pH由8变为l0,二聚体解离为单体；pH11时-螺旋结构不变，-折叠转化为任意构象，pH12时结构完全呈任意状态。 变性速度随pH增加而变快，最终产生大量的凝集。（二）（二）-乳球蛋白的理化性质乳球蛋白的理化性质 2.-2.-乳球蛋白的变性乳球蛋白的变性 当温度由30上升至55时，-乳球蛋白二聚体解离为单体，在较高温度下-乳球蛋白结构变得伸展，同时伴随硫琉化合物的增加和氧化。 pH与乳成分（乳糖、-酪蛋白）对其变性有一定的影响。（二）（二）-乳球蛋白的理化性质乳球蛋白的理化性质

16、2.-2.-乳球蛋白的变性乳球蛋白的变性 乳球蛋白被尿素、盐酸胍、乙醇和消毒剂等有机物作用而变性。 尿素变性经过两个步骤：pH3.5时-乳球蛋白解离为单体。第一步-乳球蛋白变性是一级反应，聚肽链可逆伸展为任意螺旋构象；pH5.2时发生复杂的动力学反应第一阶段包括-乳球蛋白的解离和伸展；第二阶段伸展蛋白经过一SH/SS交换反应产生不可逆凝集。（二）（二）-乳球蛋白的理化性质乳球蛋白的理化性质 3.-3.-乳球蛋白和有机物质的结合乳球蛋白和有机物质的结合（二）（二）-乳球蛋白的理化性质乳球蛋白的理化性质 4.-4.-乳球蛋白和离子的结合乳球蛋白和离子的结合 乳球蛋白能和单价、二价金属离子结合。 N

17、a+能在其等电点以上结合于羲基和咪哇基团上。 Ag+、Cu2+、Hg2+与游离硫琉基结合。 I-专一性地和-乳球蛋白中的硫巯基结合，产生二者间的络合物。 5.-5.-乳球蛋白和乳蛋白质的结合乳球蛋白和乳蛋白质的结合 -乳球蛋白能和-乳白蛋白相互作用，它也和多种酪蛋白作用。 和-酪蛋自通过疏水相互作用形成3:1的络合物，由于二硫键相互交换导致构象变化，使二硫桥不易受到进攻。 -乳球蛋白和免疫球蛋白间发生交联反应,已证实它和IgG、IgE、IgA间均存在络合反应。 5.-5.-乳球蛋白的含量乳球蛋白的含量 -乳球蛋白乳球蛋白在人、鼠乳中基本没有，在海豚、海牛、小猎犬乳中较为丰富。 6.-6.-乳球

18、蛋白的分离方法乳球蛋白的分离方法（二）（二）-乳球蛋白的二级结构、乳球蛋白的二级结构、空间结构空间结构 1.-1.-乳球蛋白的二级结构乳球蛋白的二级结构 乳球蛋白中约有710%的-螺旋。 43%-51%反平行-折叠。 其余部分呈任意构象。（二）（二）-乳球蛋白的二级结构、乳球蛋白的二级结构、空间结构空间结构 2.-2.-乳球蛋白的空间结构乳球蛋白的空间结构 在不同pH、盐浓度和介质存在的情况下-乳球蛋白至少有12种晶体结构形态。 盐析法制得的晶体形式已证明是最适于用XRD测定其结构的晶体形式。 通过X衍射的方法已获得四种-乳球蛋白的晶形结构，即晶形K,X,Y,Z，它们中均有一个a-螺旋和许多-

19、折叠，它们间的差异性不明显。（二）（二）-乳球蛋白的二级结构、乳球蛋白的二级结构、空间结构空间结构 2.-2.-乳球蛋白的空间结构乳球蛋白的空间结构 反平行-折叠的9个串簇，其中8个(A，B，C，D，E，F，V，H)围绕成一个低平的圆桶状。 在外表面有3个转折的-螺旋，色氨酸-19和胱氨酸-121在亚单元间相互作用起固形作用，色氨酸-19位于-桶状的底部内表面，胱氨酸-121在疏水通道的近表面部分，边缘延至a-螺旋。 亚单元间的相互作用包括Ile-29, Ile-147的疏水相互作用和His-146的堆积。 二、二、-乳白蛋白乳白蛋白 （一）（一）-乳白蛋白的一级结构和空间结构乳白蛋白的一级结

20、构和空间结构 1.一级结构一级结构 -乳白蛋白是低分子量（14.2ku）的球形乳清蛋白。 -乳白蛋白和鸡的溶菌酶、禽及哺乳动物的-乳白蛋白同型间存在着密切的生物进化关系。 溶菌酶一乳白蛋白的基团起源是溶菌酶的结构基因。 2. -乳白蛋白的空间结构乳白蛋白的空间结构 -乳白蛋白的多肽主链和溶菌酶比较，除C端有明显差异外，其余是相似的。 -乳白蛋白有两种构象，N构象(天然构象)和A构象(酸构象)。 pH 5. 0时，N构象向A构象转移。 升温、碱性pH、添加低浓度变性剂、Ca2+的去除和一定金属离子如Zn2+的添加均会引起构象的转化。（二）（二）-乳白蛋白的性质乳白蛋白的性质 1.1.金属结合性质

21、金属结合性质 （1）Ca2+ Ca2+和-乳白蛋白的结合常数在pH68时恒定，pH4时迅速减小，在低pH时，-乳白蛋白构象变化导致其物理化学性质变化，这种构象变化和Ca2+的解离密切相关，此时和Ca2+结合的天门冬氨酸、-羧基质子化导致Ca2+的解离。在时角结构中有5个天门冬氨酸残基存在，有3个参与Ca2+结合。（二）（二）-乳白蛋白的性质乳白蛋白的性质 （2）Mn2+ Mn2+和脱盐-乳白蛋白具有相对高的亲和性，使其呈类似天然的构象。 Mn2+与Ca2+结合的位置不同。 （3）与其它金属离子的结合 除上述两种以外，还可和多种离子结合，这些结合对蛋白质的物理化学性质和功能性质均有影响。（二）（

22、二）-乳白蛋白的性质乳白蛋白的性质 2.2.金属对其结构和活性的影响金属对其结构和活性的影响 Ca2+增加了天然LA的稳定性，在一定pH,温度、离子强度和氧化还原电位情况下LA的再次折叠和还原氧化均呈钙依赖性，故认为Ca2+在任何情况下均是LA结构的必需部分。 Ca2+和-乳白蛋白的导致其热变性、化学变性和其它物化性质的变化。（二）（二）-乳白蛋白的性质乳白蛋白的性质 3.-3.-乳白蛋白在乳糖合成酶中的作用乳白蛋白在乳糖合成酶中的作用 LA在乳糖合成酶中的作用就是增加半乳糖苷转移酶对葡萄糖的亲和，通过减少Km值使乳糖在生理的葡萄糖浓度下被合成。 同时LA对半乳糖苷转移酶的糖蛋白、寡糖底物形成竞争抑制。 三、其它乳清蛋白三、其它乳清蛋白 （一）血清蛋白（一）血清蛋白 血清白蛋白是血清的主要成分，它在肝脏中合成通过分泌细胞进入乳中，它仅占乳蛋白的1.2%左右。 哺乳动物乳中约有200种含有血清白蛋白成分。 牛乳中分离的血清白蛋白和牛血液中的血清白蛋白无差别。 血清白蛋白呈单链结构，含582个氨基酸。 三级结构呈三个等体积的球形区域，有一个游离硫巯基(胱氨酸34)和17个二硫键，它们在一个多环状结构中支持固定着蛋白质。 血清白蛋白是许多小分子的载体（如脂肪酸）。 血清白蛋白相对分子质量为66000，从牛乳中分离的血清白蛋