信号通路与肿瘤发生II0526

1、细胞信号传导与肿瘤发生TNF NF- B信号信号n1975年，E. A. Carswell和L. J. Old等人发现已接种卡介苗的小鼠注射脂多糖后，小鼠血清中产生了一种可引起动物肿瘤组织出血坏死的物质，该物质对体外培养的多种肿瘤细胞株都具有细胞杀伤作用，于是他们将这种物质命名为肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor, TNF）。TNF是迄今发现的抗肿瘤效果最强的细胞因子。TNF的发现n1968, Dr. Gale A Granger from the University of California, Irvine, reported a cytotoxic factor

2、 produced by lymphocytes and named it lymphotoxin (LT).n1968，Dr. Nancy H. Ruddle from Yale University, who reported the same activity in a series of back-to-back articles published in the same month and year.n1975 Dr. Lloyd J. Old from Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, reported anoth

3、er cytotoxic factor produced by macrophages, and named it tumor necrosis factor (TNF).nBoth factors were described based on their ability to kill mouse fibrosarcoma L-929 cells.TNF的命名n1984 When the cDNAs encoding LT and TNF were cloned , they were revealed to be similar.nThe binding of TNF to its re

4、ceptor and its displacement by LT confirmed the functional homology between the two factors. nThe sequential and functional homology of TNF and LT led to the renaming of TNF as TNF and LT as TNF. TNF alpha Model nTNF是一种糖蛋白，它以两种形式存在：TNF-和TNF-。nTNF-由单核细胞和巨噬细胞产生，它可引起肿瘤组织出血坏死，而脂多糖Lipopolysaccharides, LP

5、S）是较强的刺激剂。单核巨噬细胞系统n单核细胞来源粒-单系祖细胞，经原单核细胞、幼稚单细胞阶段分化成单核细胞，然后由骨髓释放入血，在血中34天后进入组织和浆膜腔转变成巨噬细胞。二者是相同但在部位不同名称不一样，共同构成单核巨噬细胞系统。 单核-巨噬细胞家族n单核-巨噬细胞系统（mononuclear phagocyte system） 包括血液中的单核细胞和组织中固定或游走的巨噬细胞，在功能上都具有吞噬作用。 n单核-巨噬细胞均起源于骨髓干细胞，在骨髓中经前单核细胞分化发育为单核细胞，进入血液，随血流到全身各种组织，进入组织中随即发生形态变化，如n肝脏中的枯否氏细胞(kupffer cell)

6、，n肺脏中的尘细胞（dust cells)，n结缔组织中的组织细胞（histocytes)，n神经组织中的小胶质细胞（microglialcells)，n脾和淋巴结中的固定和游走巨噬细胞等。 nTNF-是一种淋巴因子，又称淋巴毒素（lymphotoxin, LT）。抗原或丝裂原均可刺激T淋巴细胞分泌TNF-，具有肿瘤杀伤及免疫调节功能。T淋巴细胞n定义：表达T细胞受体和CD3复合物的淋巴细胞。来源于胚肝或骨髓的原T细胞，在胸腺微环境中分化、发育，成熟后迁移至外周血，继而定居于外周淋巴组织，可介导细胞免疫应答，并辅助机体针对T细胞依赖性抗原产生体液免疫应答。nT淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞（胚

7、胎期则来源于卵黄囊和肝）。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。 T细胞分类（根据不同的分类方法）可分为不同亚群n（一）初始、效应、记忆T细胞n从未接受过抗原刺激的成熟T细胞为初始T细胞，接受抗原刺激而活化，分化为效应T细胞和记忆T细胞。n（二）T细胞和T细胞n根据表达的TCR类型，T细胞可分为+T即细胞和+T细胞。+T细胞分布广泛，识别抗原具有MHC限制性，抗原识别受体具有多样性，既可分化为辅助性T细胞（Th），也可分化为细胞毒性T细胞（CTL）；+T细胞分布于皮肤粘膜组织，识别抗原无MHC限制性，抗原识别

8、受体缺乏多样性，只识别多种病原体表达的共同抗原，效应细胞为CTL.n（三）CD4+和CD8+T细胞nT细胞又可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞识别MHC类分子所提呈的外源性抗原肽，活化后主要分化为Th. CD8+T细胞识别MHC类分子所提呈的内源性抗原肽，活化后主要分化为CTL.n（四）Th、CTL和Tr细胞n根据功能可将T细胞分为Th、CTL和调节性T细胞（Tr细胞），均为效应细胞。Th细胞可分化为Th1、Th2、Th3三类细胞，分别分泌不同的细胞因子，Th1和Th2在细胞和体液免疫中发挥作用；Th3对免疫应答起负调节作用。CTL细胞可分化为Tc1和Tc2，分泌细胞因子不同

9、，Tc1与Th1相似；Tc2与Th2相似。Tr细胞参与免疫应答的负调节及在自身免疫耐受中发挥作用。TNF基因n人的TNF- 基因长2.76 kb，由4个外显子和3个内含子组成，定位在第六号染色体上。人TNF-前体由233个氨基酸组成，含有76个氨基酸残基的信号肽TNF多态性MHCn定义：主要组织相容性复合体，是存在于脊椎动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原的一组紧密连锁的基因群，与免疫应答、免疫调节和移植排斥等有关。 n类和类分子是结构相似的细胞膜表面糖蛋白，除作为移植抗原外，还与抗原递呈及某些疾病相关。n类分子包括c2、c4、b因子和肿瘤坏死因子等多种可溶性蛋白质，相互间差别很大，与类和类

10、分子在结构和功能上相关性很小nTNF 基因具有多态性, 这种多态性的标志是TNF 及其受体基因内的碱基变化, 这种变化与一些自身免疫疾病TNF 水平特征性增高有密切关系, 尤其是与MHC 连锁的疾病相关示例1（论文）n肿瘤坏死因子基因多态性对子宫内膜异位症患者血清中TNF浓度的影响n目的：研究内异症患者及非内异症妇女肿瘤坏死因子( tumor necro sis factors beta) 基因+ 252 位点的多态性与两组血清中TNF 浓度的关系n方法：PCRRFLP 检测82 例内异症患者( 内异症组) 和8 0 例非内异症妇女( 对照组)检测两组血清中TNFa 和TNFb 的含量n结论：

11、+ 252 位点AA基因型血清中TNFb 水平较GG 基因型TNFb水平明显升高示例2n肿瘤坏死因子基因多态性与脓毒症易感性及预后间的关系n目的: 确定肿瘤坏死因子基因多态性与脓毒症易感性及细胞因子产量间的相关性。n方法: 采用 PCR- RFLP 分析正常人群和脓毒症患者肿瘤坏死因子( TNF) - 启动子- 308 位点及TNF- 第一内含子+252 位点基因的单碱基突变多态性之间的异同。采用双抗夹心酶联免疫吸附( ELISA) 方法检测脓毒症患者血浆TNF- 和白细胞介素6 ( IL- 6) 的浓度。n结果: 45 例脓毒症患者的TNFB 等位基因频率为67.78%, 高于正常对照组的5

12、3.33%( P 0.05) , 结论:nTNF- 第一内含子+252 位点的等位基因TNFB2 与脓毒症的易感性和体内TNF- 、IL- 6 浓度有关。RFLPTNF基因治疗n1984年起，欧美国家就开始把TNF的基因工程产品应用到癌症临床治疗中，并一度取得轰动的成果，然而最终由于毒副作用严重而被迫终止。n九十年代末以来，随着基础研究的深入和基因工程技术的发展，科学家研制出一些高效、低毒的TNF变构体，从而重新确立了TNF在抗肿瘤中的重要地位n切除信号肽后形成157个氨基酸的成熟型非糖基化的TNF-。通过基因工程方法改造后的TNF-具有更好的生物学活性和抗肿瘤效果。分泌蛋白的转运过程 （1）

13、信号肽被信号肽识别粒子（SRP）结合，SRP把核蛋白体带至胞膜的胞浆面与对接蛋白结合，核蛋白体与内质网膜结合。 （2）信号肽被信号肽酶切割掉，蛋白质分泌到内质网腔。 1以TNF基因修饰的肿瘤细胞为瘤苗的主动免疫治疗n患者自体或同种肿瘤细胞在体外转入TNF基因后,致瘤性消除,仍然保留有免疫原性,注入机体后,可激起机体产生免疫反应,且对相应肿瘤起治疗作用.瘤苗相关报道n所谓“瘤苗”，即由科研人员先制备恶性肿瘤治疗所需的细胞因子cDNA，将其克隆到安全的逆转录病毒载体，并包装成重组的缺陷型逆转录病毒颗粒，用以感染肿瘤细胞的疫苗。这种“瘤苗”经60钴辐射后，致瘤性消失，而细胞的免疫性则保留，并在一定时

14、间内还持续分泌细胞因子。陈诗书、钱关祥等潜心10年时间制备的“白介素-2基因工程化胃癌细胞瘤苗”,于2000年10月被SDA批准为可用于临床试验的生物制品一类新药，同意进行8例小样本临床试验。8例晚期癌症患者经过该“瘤苗”2个月的治疗和1个月的疗效观察，证实病人接受“瘤苗”治疗是安全的、可耐受的，而且病情稳定。2供TNF基因的过继免疫治疗n供TNF基因的过继免疫治疗是指利用对肿瘤有免疫力的供者淋巴细胞或患者自身的免疫细胞在体外转入TNF基因活化后、增殖,再输入患者体内,使TNF基因在患者体内表达,发挥抗肿瘤作用.3通过对TNF基因的表达调控,使TNF在肿瘤细胞中高效特异表达n调控TNF基因在肿

15、瘤细胞中特异性表达,可达到定向转移的目的.进入肿瘤细胞中的TNF基因要受到启动子、增强子等序列的调控,因此可通过改变或引入有关特异性序列来实现其定向转移与表达.4将TNF受体基因转入肿瘤细胞,提高肿瘤细胞对TNF的敏感性nTNF杀伤肿瘤细胞的主要机制就是TNF与肿瘤细胞表面的受体结合所形成的内在化效应,对某些肿瘤治疗效果不理想.原因是肿瘤细胞缺乏TNF受体,从而对TNF不敏感.故将TNF受体基因转入肿瘤细胞,使不表达或低表达TNF受体的肿瘤细胞表达TNF受体,可提高TNF治疗效果.TRADD分子nTNF receptor 1 associated via death domainn有死亡区的肿

16、瘤坏死因子受体1相关蛋白抗原 nTRADD is an adaptor protein.nThe protein encoded by this gene is a death domain containing adaptor molecule that interacts with TNFRSF1A/TNFR1 and mediates programmed cell death signaling and NF-kappaB activation.n This protein binds adaptor protein TRAF2, reduces the recruitment of

17、inhibitor-of-apoptosis proteins (IAPs) by TRAF2, and thus suppresses TRAF2 mediated apoptosis. This protein can also interact with receptor TNFRSF6/FAS and adaptor protein FADD/MORT1, and is involved in the Fas-induced cell death pathway.Signal transducing adaptor proteinnproteins which are accessor

18、y to main proteins in a signal transduction pathway. These proteins tend to lack any intrinsic enzymatic activity themselves but instead mediate specific proteinprotein interactions that drive the formation of protein complexes.NF-B的发现和命名nNF-B（nuclear factor-kappa B）是1986年从B淋巴细胞的细胞核抽提物中找到的转录因子，它能与免疫

19、球蛋白kappa轻链基因的增强子B序列GGGACTTTCC特异性结合，促进轻链基因表达，故而得名。增强子n存在于基因组中的对基因表达有调控作用的DNA调控元件。位置不定，结合转录因子后，可增强基因表达。 Kappa CHAINSnWhen immunoglobulin molecules are produced by the plasma cells in the bone marrow, the heavy chains (G, A, M, D, or E) and the light chains (kappa or lambda) are produced separately. Th

20、e kappa and lambda molecules are bound to the heavy chains and intact immunoglobulins are assembled, then transported to the surface of the plasma cell. REL家族n它是真核细胞转录因子Rel家族成员之一，广泛存在于各种哺乳动物细胞中。迄今为止，在哺乳动物细胞内共发现5种NF-B/Rel家族成员，它们分别是RelA（即p65）、RelB、C-Rel、p50/NF-B1（即p50/RelA）和p52/NF-B2。这些成员均有一个约300个氨基酸的

21、Rel同源结构域（Rel homology domain, RHD）。这个高度保守的结构域介导Rel蛋白形成同源或异源二聚体，该结构域也是NF-B与靶基因DNA序列的特异性结合区域。n细胞内NF-B的活化过程受到精细调控。通常情况下，在细胞质中的NF-B处于失活状态，与抑制蛋白IB（inhibitory protein of NF-B）结合成三聚体复合物。信号传递过程1n当出现TNF-信号、炎症因子以及LPS、紫外线等外界刺激时，细胞因子与细胞膜表面的TNF受体结合后，TNF受体发生多聚化并与细胞质中TRADD分子发生相互作用。信号传递过程2nTRADD招募TRAF（TNFR-associat

22、ed factor）和激酶RIP（receptor interacting protein），由RIP将信号传递给IKK（IB kinase）信号传递过程3nIKK由、和三个亚基组成，作为激酶的IKK能使IB的亚基的Ser32和Ser36残基和亚基的Ser19和Ser23残基磷酸化。IB随即从p50/p65/IB异源三聚体中解离出来，经泛素化修饰后通过蛋白酶体降解。信号传递过程4n受到IB抑制的NF-B得以暴露其核定位序列（nuclear localization signals, NLS），迅速从细胞质进入细胞核内，与核内DNA上的特异序列相结合，从而启动或增强相关基因的转录NF-B与肿瘤密

23、切相关nNF-B具有明显的抑制细胞凋亡的功能，与肿瘤的发生、生长和转移等多个过程密切相关。在人类肿瘤尤其是淋巴系统的恶性肿瘤中，常可发现NF-B家族基因的突变。nNF-B家族与癌症相关性的第一个线索是c-Rel 基因的发现，它是禽类逆转录病毒癌基因v-Rel 在细胞内的同源基因。该病毒在鸡体中造成多种造血细胞恶性转化，引起淋巴癌的发生。nImmunogen Synthetic peptide - KLH conjugated, Synthetic peptide nReactivity Human, Mouse (Murine), Rat (Rattus) nHost Rabbit nClon

24、ality Polyclonal nDescription Gene: V-rel Reticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog Specificity Peptide encompassing amino acid Ser 552 of human RelB nNF-B与肿瘤治疗息息相关。IFN-a、IFN-b、TNF-、IL-2、G-CSF、GM-CSF和EPO是迄今为止被批准用于临床肿瘤治疗的几种细胞因子，其中前6种生长因子已被证实与NF-B的信号通路有关。n国内外主要以NF-B为靶点，使用抗氧化剂抑制NF-B活性以及针对p65和p50设计小分子干扰RNA（siRNA）抑制NF-B合成等方法作为癌症的治疗策略，而且在动物实验及细胞培养中取得不同程度的疗效，但是离临床应用还有很大距离。示例1n肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子a诱导蛋白诱导蛋白3 对对NFkB 信