微生物专业毕业论文

1、安 徽 农 业 大 学毕 业 论 文（设计）论文题目 真菌发酵液对纳塔尔链霉菌纳他霉素产量的影响 姓 名学号院 系 _生命科学学院_ 专 业 生物技术_指导教师 职 称 讲师_中国·合肥二o 13 年 5 月目录摘要1前言11实验材料及方法21.1实验材料 2实验菌种2培养基21.2实验方法2纳塔尔链霉菌的培养2真菌发酵液的制备 2纳他霉素产量的测定2真菌发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响2真菌发酵时间对纳他霉素产量的影响2真菌发酵液添加量对纳他霉素产量的影响32结果与分析32.1纳他霉素标准曲线的制作32.2发酵液加入时间对N5菌株纳他霉素产量的影响3产黄青霉发酵液加入时间对N5菌

2、株纳他霉素产量的影响3黑曲霉发酵液加入时间对N5菌株纳他霉素产量的影响4酿酒酵母发酵液加入时间对N5菌株纳他霉素产量的影响52.3真菌培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响5 产黄青霉培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响5黑曲霉培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响6酿酒酵母培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响62.4真菌发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响7产黄青霉发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响7黑曲霉发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响8酿酒酵母发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响83讨论与结论9参考文献 9致谢10英文摘要10真菌发酵液对纳塔尔链霉菌纳他霉素产量的影响作

3、者：潘 指导教师：曹（安徽农业大学生命科学学院2009级生物技术1班，学号09121012）摘要：纳他霉素是由纳塔尔链霉菌（streptomyces natalensis）、褐黄孢链霉菌（streptomyces gilvosporeus）、恰塔努加链霉菌（streptomyces chattanoogensis）等菌株发酵而产生的一种广谱抗真菌剂。因其低毒和极小改变食物本身味道可作为生物防腐剂。本实验通过在纳塔尔链霉菌N5菌株中添加真菌发酵液的方法提高菌株纳他霉素的产量。实验结果表明产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母三种菌的发酵液均对纳塔尔链霉菌N5菌株的纳他霉素产量有明显的促进作用。产黄青霉和黑曲

4、霉培养1d时，其发酵液对N5菌株纳他霉素的合成促进效果最佳，而酿酒酵母在3d时促进效果最好，此时菌株纳他霉素产量较未加真菌发酵液处理样品高出约1倍。关键词：纳塔尔链霉菌N5菌株 纳他霉素 产黄青霉 黑曲霉 酿酒酵母前言1955年struyk等人首次从南非natal州土壤中分离得到纳塔尔链霉菌（streptomyces natalensis），并发现该菌种可以产生一种内酯类抗生素，strnyk将其命名为匹马菌素（pimaricin）1，后世界卫生组织将其统一命名为纳他霉素。该抗生素是一种二十六元多烯大环内酯类抗生素，主要由纳塔尔链霉菌（streptomyces natalensis）、褐黄孢链霉

5、菌（streptomyces gilvosporeus）、恰塔努加链霉菌（streptomyces chattanoogensis）等菌发酵产生2。纳他霉素是一种高效、广谱的抗真菌剂，能有效抑制霉菌及酵母的生长，并能有效抑制丝状真菌中黄曲霉素的形成，可广泛应用于食品保鲜及治疗真菌引起的疾病3。由于其分子上的疏水部分可以范德华力与细胞质膜上的甾醇分子结合，形成抗生素甾醇复合物，破坏细胞质膜渗透性，引起菌体细胞内电解质渗出，因而可导致菌体死亡，起到抑菌作用4。纳他霉素在室温下溶解度仅为30-100mg/L，微溶于甲醇，易溶于稀酸、冰醋酸和二甲基甲酰胺，不溶于非极性溶剂5。一般认为，由于纳他霉素难溶

6、于水和油脂，所以很难被消化和吸收，因此人体摄入的纳他霉素大部分会随粪便排出6。因为纳他霉素具有毒性低和不会对食品天然风味有较大改变的性质，美国食品及药物管理局(FDA)和我国卫生部已经先后于1982年与1997正式批准纳他霉素作为食品添加剂。迄今为止纳他霉素已经在食品工业中得到广泛应用7。由于各种因素的制约，国内纳他霉素的主要来源至今仍然是从国外进口。限制我国自主生产纳他霉素的主要问题是菌株产量偏低，导致纳他霉素的生产成本过高。这已成为急需解决的问题。提高纳他霉素产量可以通过添加诱导子的方法。已有报道称一些微生物的发酵代谢物可产生某种诱导子调节其它微生物的次级代谢，促进其次级代谢产物的生成8,

7、9,10。本实验将产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母的发酵液分别添加入纳塔尔链霉菌（streptomyces natalensis）发酵液中，研究不同真菌发酵液对该菌株纳他霉素产量的影响，以期提高菌株纳他霉素产量。1实验材料与方法1.1实验材料菌种纳塔尔链霉菌N5菌株由中国科学院合肥物质科学研究院等离子所提供。黑曲霉、产黄青霉、酿酒酵母由安徽农业大学生命科学学院微生物学实验室保藏。培养基种子培养基 (g/L)：葡萄糖20、酵母浸膏5、蛋白胨6、氯化钠10，pH 7.2发酵培养基 (g/L)：葡萄糖10、酵母浸膏5、大豆蛋白胨20、淀粉40，pH7.21.2实验方法纳塔尔链霉菌的培养用接种环刮取斜面菌种

8、一环于装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，28、 200r/min摇床培养，40h后以9%接种量接种于装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28、200r/min摇床培养 4d。真菌发酵液的制备将产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母分别接种于装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28、150r/min摇床培养适当时间，用八层纱布过滤，再在10000r/min下离心15min，取上清液进行微孔滤膜过滤即可得到无菌的真菌发酵液。纳他霉素产量的测定称取纳他霉素标准样品，溶于5%冰乙酸的甲醇溶液中，使纳他霉素浓度分别为1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、

9、7mg/L、8mg/L，用紫外分光光度计测其在303nm处的OD值，以纳他霉素浓度为横坐标，OD303值为纵坐标，绘制标准曲线。取N5菌株发酵液0.8mL于7.2mL 5%冰乙酸的甲醇溶液中。在震荡器上震荡5min后10000r/min离心15min。取上清液用紫外分光光度计测量303nm波长下的吸光度，根据标准曲线计算纳他霉素产量。真菌发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响将产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母培养3d后分别以5%接种量接种于纳塔尔链霉菌N5菌株发酵液中，接种时间分别为0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，每个处理重复3次，并以不添加真菌发酵液的处理为对照。培养4d后测定菌

10、株纳他霉素产量。确定真菌发酵液最适添加时间。真菌发酵时间对纳他霉素产量的影响分别在产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母培养1d、2d、3d时取样，制备无菌发酵液。将培养不同时间的真菌发酵液以5%接种量加入培养12h的纳塔尔链霉菌N5菌株发酵培养液中，每个处理重复3次，并以不添加真菌发酵液的处理为对照。继续培养84h后测定菌株纳他霉素产量。确定3种真菌的最佳发酵时间。真菌发酵液添加量对纳他霉素产量的影响将产黄青霉、黑曲霉培养1d，酿酒酵母培养3d，制备无菌发酵液，并分别以1% 、2% 、5% 、8% 、10% 、15% 、20%的添加量加入到培养12h的纳塔尔链霉菌N5菌株发酵培养液中，每个处理重复3次并

11、以不添加真菌发酵液的处理为对照。培继续培养84h后测定菌株纳他霉素产量。确定3种真菌的最佳发酵时间。2结果及分析2.1 纳他霉素标准曲线的制作以纳他霉素浓度为横坐标，OD303值为纵坐标绘制纳他霉素标准曲线，见图1。由图1可看出纳他霉素浓度与OD303值呈线性相关，且R2=0.9988线性较好。因此可通过此标准曲线方程x=（y0.0065)/0.1489计算纳他霉素产量。图1 纳他霉素标准溶液曲线Fig1 The standard curve ofnatamyctn2.2 发酵液加入时间对N5菌株纳他霉素产量的影响产黄青霉发酵液加入时间对N5菌株纳他霉素产量的影响将产黄青霉发酵培养基进行适当处

12、理后接种于培养不同时间的纳塔尔链霉菌N5菌株发酵液中，继续培养，当菌株培养4d时用紫外分光光度法测定纳他霉素产量，结果如图2所示。由图2可看出产黄青霉发酵液对N5菌株纳他霉素产量有明显的促进作用，当在发酵培养12h时添加效果最佳，此时菌株纳他霉素产量达1.42g/L，较对照提高65.96。图2 产黄青霉发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响Fig 2 Effects of addition time of fermentation broth ofPenicillium chrysogenumon the natamycin production of N5 strain黑曲霉发酵液加入时间对N5

13、菌株纳他霉素产量的影响将培养3d的黑曲霉发酵培养液适当处理后于不同时间添加入N5菌株发酵培养液中，继续培养，当菌株培养4d时测定纳他霉素产量，结果见图3。从图3中可以看出黑曲霉发酵液对N5菌株纳他霉素产量的提高有显著的促进作用。当在发酵培养12h时添加效果最佳，此时菌株纳他霉素产量达1.44g/L，较对照提高67.44。图3黑曲霉发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响Fig 3 Effects of addition time of fermentation broth ofAspergillus Nigeron the natamycin production of N5 strain酿酒酵母发

14、酵液加入时间对N5菌株纳他霉素产量的影响酿酒酵母发酵液加入时间对N5菌株纳他霉素产量的影响见图4。由图可见，酿酒酵母发酵液也可明显促进N5菌株纳他霉素的合成，最适接入时间也是菌株培养的12h。图4 酿酒酵母发酵液添加时间对纳他霉素产量的影响Fig 4 Effects of addition time of fermentation broth ofSaccharomyces cerevisiaeon the natamycin production of N5 strain2.3 真菌培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响产黄青霉培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响将分别培养1d、2d、3d的产

15、黄青霉发酵液进行适当处理，添加至培养12h的N5菌株发酵培养液中，继续培养84h后测定菌株纳他霉素产量，结果如图5所示。由图5可以看出培养1d的产黄青霉发酵液对N5菌株纳他霉素产量的促进作用最显著。随着产黄青霉培养时间的延长，发酵液对N5纳他霉素产量的促进作用呈下降趋势。因此，产黄青霉的最佳培养时间为1d。图5产黄青霉培养时间对纳他霉素产量的影响Fig 5 Effects of culture time of Penicillium chrysogenumon the natamycin production of N5 strain黑曲霉培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响 将培养不同时间的

16、黑曲霉发酵液添加入N5菌株发酵液中，培养后测定纳他霉素产量，结果见图6。由图6可以看出当在N5菌株发酵液中添加培养1d的黑曲霉发酵液时，纳他霉素产量最高，因此，黑曲霉的最佳培养时间确定为1d。图6黑曲霉培养时间对纳他霉素产量的影响Fig 6 Effects of culture time of Aspergillus Nigeron the natamycin production of N5 strain酿酒酵母培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响酿酒酵母培养时间对N5菌株纳他霉素产量的影响如图7所示。由图7可见，当在N5菌株发酵液中添加培养3d的酿酒酵母发酵液时，纳他霉素产量最高，因此，酿

17、酒酵母的最佳培养时间确定为3d。图7酿酒酵母培养时间对纳他霉素产量的影响Fig 7 Effects of culture time of Saccharomyces cerevisiaeon the natamycin production of N5 strain2.4真菌发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响产黄青霉发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响将培养1d的产黄青霉发酵液处理后以不同添加量添加于培养12h的纳塔尔链霉菌N5菌株发酵培养液中，于28、200r/min条件下继续培养84h，测定纳他霉素产量。以产黄青霉发酵液添加量为横坐标，纳他霉素产量为纵坐标做图，见图8。从图8中可

18、以添加5的产黄青霉发酵液对N5菌株纳他霉素的积累效果最显著，此时纳他霉素产量达1.69g/L，较对照提高94.25%。图8产黄青霉发酵液添加量对纳他霉素产量的影响的影响Fig 8 Effects of addition amount of Penicillium chrysogenumfermentation brothon the natamycin production of N5 strain黑曲霉发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响将培养1d的黑曲霉发酵液处理后以不同添加量添加于培养12h的纳塔尔链霉菌N5菌株发酵培养液中，于28、200r/min条件下继续培养84h，测定纳他霉素

19、产量结果如图8所示。由图可看出5的黑曲霉发酵液对N5菌株纳他霉素的积累效果最佳，因此，黑曲霉发酵液的最适添加量确定为5。图9黑曲霉发酵液添加量对纳他霉素产量的影响的影响Fig 9 Effects of addition amount of Aspergillus Nigerfermentation brothonthe natamycin production of N5 strain酿酒酵母发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响酿酒酵母发酵液添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响见图10。从图10中可以看出5的酿酒酵母发酵液对N5菌株纳他霉素的积累效果最佳，因此，黑曲霉发酵液的最适添加量确定为

20、5。图10酿酒酵母发酵液添加量对纳他霉素产量的影响的影响Fig 10 Effects of addition amount of Saccharomyces cerevisiae fermentation brothonthe natamycin production of N5 strain3讨论与结论 随着人们对健康、安全问题的日益关注，食品安全问题越来越受到人们的重视，化学防腐剂的缺点逐渐暴露，纳他霉素受到人们的青睐。纳他霉素是和乳酸链球菌素并列的仅有的两种生物防腐剂，其具有毒性低且不会造成食品风味巨大改变的特性，是一种极具有使用、生产价值的抗生素。但纳他霉素产生菌株产量不高一直是我国纳

21、他霉素自主生产的瓶颈，过低的单株产量会使生产成本过高而不利于工厂生产。本实验将产黄青霉、黑曲霉、酿酒酵母发酵液添加入纳塔尔链霉菌N5菌株发酵液中，研究这3种真菌培养时间、发酵液添加时间及添加量对N5菌株纳他霉素产量的影响，以促进菌株纳他霉素的合成。实验结果表明这三种真菌的发酵液均对纳塔尔链霉菌N5菌株的纳他霉素产量有明显促进作用。产黄青霉和黑曲霉培养1d时，其发酵液对N5菌株纳他霉素的合成促进效果最佳，而酿酒酵母在3d时促进效果最好。三种真菌最佳发酵液添加时间及添加量均为12h和5。具体这些真菌发酵液中何种因素对N5菌株纳他霉素生产起到促进作用还不清楚，有待于进一步实验研究。参考文献1 Mar

22、ta V Mendes ，sedef Tunca ，Nuria Anton et al The two-component phoR-phoP system of streptomyces natalensis ;inactivation or deletion of phoP reduces the negative phosphate regulation of pimaricin biosynthesis metabolic engineering 2007 ,9 (2)：217227；2 PEDERSEN J C Natamycin as a fungicide imager medi

23、a JApplied and environment 。microbiobogy 1992 ，58（3）.10641066；3 陈晓丽、吕振岳、黄东东等。新型天然食品防腐剂纳他霉素的研究进展J食品研究与开发.2002.23（4）：23；4 卢国营、张朝辉、洪伟杰，新型防腐剂纳他霉素的研究进展J中国食品添加剂 2005（3）：3032；5 魏宝东、孟宽军、天然生物性食品防腐剂纳他霉素的特性及应用J，辽宁农业科学 2004 （2）：2426；6 贺家亮、张敏、赵胜娟，纳他霉素的研究现状J中国食品添加剂2005（3）：3032；7 Martin J F DEMAIN AL control of an

24、tibiotic biosynthesis 1980（02）；8 叶辉、王兆慧、陈佩林等 微生物诱导子对卡诺氏菌属N05205 菌株的影响J，生物技术，2004 14（6）：5758；9 边猛、田黎、张久明等，诱导子对海洋真菌penicillium crustosum 204215菌株生物碱代谢的调节作用J海洋学报，2008.30（2）：117123；10 边猛 海洋真菌产生生物碱代谢调节的研究D：硕士学位论文青岛科技大学 生物化工系 。11 史强 真菌代谢产物中促进纳他霉素合成的诱导子的研究D：硕士学位论文江南大学。致谢感谢曹老师对于本试验的悉心指导，她对生物学科领域中的基本问题和发展前景的

25、敏锐洞察力，对学术思想的重视，对选题和研究内容的严格要求，以及对论文工作中遇到的关键问题和疑难问题的指导使我受益匪浅。她对试验的研究态度和严谨的工作作风给予我今后的学习和工作很深的启示。同时我还要感谢一起做实验的同学，他们在我的实验过程中给了我很大的帮助。The effect of fungusfermentedliquidontheoutputof Streptomyces natalensisnatamycinAuthor: instructor: (2009 College of life science of Anhui agricultural University-level biotechnology class 1, 09121012,)Abstract:Natamycin is a broad-spectrum antifungal agent generated by the fermentation of the streptomyces natalensis,streptomyces gilvosporeus,streptomyces chattanoogensis and other strains.It can be used