微生物工程概论

1、第一章 微生物工程概论1-1 微生物工程研究领域现状与研究内容1.1.1 微生物工程是生物工程科学的重要基础学科微生物工程（microbial engineering）是研究微生物生长代谢活动规律在工业化大规模生产上应用的科学。它在不同的范围内以研究菌种的特性和选育、培养基的特性和选择，微生物的代谢与控制、发酵工艺控制、微生物反应动力学、染菌的防治与控制和产品分离提纯工艺控制以及单元操作等为主要内容。微生物工程是当今生物工程学的重点，微生物工程是21世纪生物工程发展的重要组成部分。可以预见，微生物工程的研究将越来越深入，并将成为21世纪生物工程科学研究的重要领域之一。微生物工程是多层次、非线性

2、、多侧面的复杂工程体系，而微生物是微生物工程的最基本单位，工业化过程的现象都要从微生物及其生长代谢调控中寻找答案。微生物工程的研究是生物工程的基础，也是现代生物科学发展的重要支柱。微生物的生长遗传发育，代谢调控等重大活动现象的研究都要以微生物细胞为基础。以基因工程为主的现代生物技术主要是通过对细胞操作为基础而进行的。因此，微生物工程与轻工、农业、医药、化工、环境保护等发展有关密不可分的关系，它将解决人类面临的重大问题，促经济和社会发展中发挥重要的基础作用。由于分子生物学和基因工程概念、方法与技术的引入，微生物工程在近几年取得了突破性的进展，产生了许多新的生长点，并逐步形成新的概念与新的领域。许

3、多科学家认为，在21世纪，微生物工程将继续迅猛发展，其原因它是生物工程不可缺少的“主角”。微生物工程是在生产实践中和科学实验的基础上，通过总结归纳，逐步上升的理论，再用这些理论指导生产取得的。但是，生产放大方法中出现的某些实际问题尚无完善的理论指导；连续发酵的理论虽然很多，但实际生产的许多问题目前仍未能很好解决等等。假如不重视微生物工程的基础研究，势必是影响21世纪生物工程的整体发展速度。为此，我们应十分重视这一领域的基础研究。可以概括地说，微生物工程是应用现代微生物学与基因工程的技术成就和化工原理的概念和方法，以微生物作为生长繁殖、代谢调控活动的基本单位的出发点，探索工业化大规模生产规律的学

4、科，其核心问题在于比似放大及过程的管理两部分。应当指出，微生物工程是一门正在兴起和发展的新兴学科，与其他学科相比，还不具备完整的学科体系，其研究内容与范畴往往与生物工程的其他学科交错在一起，目前甚至很难为微生物工程划出一个明确的界线。 微生物工程领域国内外现状微生物工程是生物技术的重要内容之一，是生物细胞产物通向工业化的必经之路。在生物技术与现代化工程技术相结合的基础上发展起来的新型工程技术，不仅为传统发酵工业、传统医药工业的改造及新型的生物技术工业提供了高效的生物反应器、新型分离技术和介质以及现代的工程装备技术，还提供了生产设备单元化、工业过程最优化、在线控制自动化、系统综合没计等工程概念与

5、技术以及用于生物过程优化控制的基础理论。生物化工技术在生物技术产业化方面起着重要作用，使生物技术的应用范围更加广泛。微生物在高新技术研究中，发挥了极重要的作用如为基因工程的研究提供的质粒、粘粒和病毒载体及限制性内切核酸酶、连接酶、磷酸酶、磷酸激酶以及医学诊断和发酵过程检测用的生物传感器和用于微电子中的生物芯片等。微生物工程的下游加工由多种化工单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故用到的单元操作很多，如沉淀、萃取、吸附、干燥、蒸馏、蒸发和结晶等传统的单元操作，以及新近发展起来的单元操作，如细胞破碎、膜过滤技术和色层分离等。一些新技术、新工艺、新材料、新设备的使用，大大提高了生物技术产品的

6、产量和质量。微生物工程是指利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在发酵罐中生产有用物质的一种技术系统。微生物工程是化学工程与生物技术相结合的产物，是生物技术的重要分支，是生物加工与生物制造实现产业化的核心技术。与传统化学工程相比，发酵工程有某些突出特点：主要以可再生资源作原料；反应条件温和，多为常温、常压、能耗低、选择性好、效率高的生产过程； 环境污染较少；投资较小； 能生产目前不能生产的或用化学法生产较困难的性能优异的产品。由于这些特点，发酵工程已成为工业领域重点发展的行业，微生物工程产品包括各种抗生素、氨基酸、维生素、有机酸等与人们日常生活息息相关的产品。微生物工程技术主要包括提供高性能

7、生产菌种的菌种技术、实现低成本大规模生产产品的发酵技术及最终获得合格产品的分离提取技术。进行发酵工程关键技术及重大产品的研究开发，将发挥中国丰富的生物资源优势，提高发酵工程的技术水平，促进食品加工、生物化工、生物医药等相关行业的产品竞争力和可持续发展。.1世界微生物工程的发展现状从世界范围的发展情况看，生物技术己成为发达国家科技竞争的热点。美国、日本和欧洲主要发达国家和地区竞相开展了生物技术的研究和开发工作，许多国家建立了一系列的生物技术研究组织，制定了近期和中长期的发展规划，在政策和资金上给予大力支持。企业界也纷纷投入巨资进行生物技术的开发研究，取得了系列的重大成果，从而使生物技术产业化得到

8、迅速的发展。微生物工程发展至今已经历了半个多世纪，目前已形成了一个完整的工业技术体系，整个微生物工程行业也出现了一些新的发展态势。最早主要是生产抗生素；随后是氨基酸发酵、有机酸发酵、甾体激素的生物转化、维生素的生物法制备、单细胞蛋白及淀粉糖等工业化生产。20 世纪70 年代初第一次出现石油危机后，西方各发达国家积极寻找替代能源的同时，加大了对生物技术发展的投入，开发可再生资源的利用技术，使微生物工程的应用领域得以进一步拓展。随着现代生物技术的兴起，微生物工程的应用已涉及国计民生的方方面面，包括农业生产、轻化工原料生产、医药卫生、食品、环境保护、资源和能源的开发等各领域。当代，随着生物工程上游技

9、术的进步以及化学工程、信息技术和生物信息学（bioinformatics ）等学科技术的发展，微生物工程迎来了又一个崭新的发展时期。面对新技术革命的兴起，化学工业作为传统的基础工业，不可避免地面临着生物新技术的挑战，随着基因重组、细胞融合、酶的固定化等技术的发展，微生物工程技术不仅可提供大量廉价的化工原料和产品，而且还有可能改善某些化工产品的传统工艺，出现少污染、省能源的新工艺，甚至合成一些性能优异的新型化合物。微生物工程技术的发展将推动生物技术和化工生产技术的变革和进步，产生巨大的经济效益和社会效益，因此微生物工程技术将在21 世纪有着辉煌的前景。由于微生物工程应用面广，涉及行业多，所以应用

10、微生物工程技术的企业较多。据报道，目前美国生物技术企业有1200 多家，西欧有580多家，日本有300多家。其中既有ADM 公司、诺维信（原诺和诺德）公司等专门以发酵工程技术大规模生产各种产品的公司，也有DSM 公司、汉高公司等利用大规模发酵技术生产部分产品的公司，还有在某一方面有专长的公司如生产基因重组蛋白质的Amgen公司等。生命科学已成为新世纪最具活力的领域之一，世界大公司正在把注意力向生命科学部分转移，生物技术正在从食品、医药、农产品这些传统领域向化工、塑料、燃料和溶剂等工业领域扩展，尤其是微生物工程技术在向传统的化学工业延伸，这必将给化学工业带来巨大的变革。近年来许多国家对利用生物技

11、术生产塑料和燃料的研究力度都在加大。对于塑料生产厂家而言，用植物这样的可再生资源来取代以石油为基础的原料，发展前景极为诱人。树脂生产厂家不再依靠化石燃料的有限供应，可降解性的生物高分子可以变成肥料，不仅节省了填埋场所占的土地面积，而且更有利于环境保护和工业的可持续发展。从玉米、高粱或其他植物获取的淀粉和糖，是目前正在开发的几种生物化学新工艺的基础原料。例如，日本三井化工正在生产用于农用地膜、瓶子和耐热容器等生物包装材料的LaceaPLA 。他们还在研究完全由赖氨酸、天冬氨酸等氨基酸构成的生物高分子，并已开发出一种专有的工艺技术。这种工艺采用经基碳酸、二醇、二羧酸等共聚单体生产聚醋。另外，环保型

12、的醋类溶剂也可以来自植物，它们将能取代大约80的现有的有毒性的石油溶剂。国外科学家于1999年就已获得这项技术的专利权。这项专利技术可从碳水化合物原料中提取出高纯度乳酸醋，并使生产成本降低一半，大大节约了能源，减少了挥发性排放物。.2国内微生物工程的发展现状我国微生物发酵工业也有着悠久的历史。解放后，微生物在工农业中的应用迅速发展。不仅对传统发酵产品生产技术作了科学的总结不断提高产品质量与革新工艺而且在全国范围内先后兴建了不少新的工厂和专业研究机构高等院校也设置专业培养这方面的专业技术人才从事酒精、溶剂、抗生素、有机酸、氨基酸、酶制剂、激素、维生素、核苷酸发酵等方面的研究与生产。石油微生物脱蜡

13、的推广以石油为原料的柠檬酸发酵、谷氨酸发酵和反丁烯二酸发酵的研究，都取得了一定进展。最近糖质原料以高渗透酵母发酵生产甘油又获成功。我国微生物工业已经迅速发展成为一门新兴工业经过长期发展已有一定基础，并一直持续快速发展。特别是改革开放以后，微生物工程的发展进人了一个崭新的阶段，不同品种虽然发展速度不一，但大都呈几倍乃至数十倍的增长，目前微生物工程产品涉及医药、保健、农药、食品、饲料、有机酸等各个方面。但是由于基础薄弱，条件较差因此与世界先进技术相比差距还是大的。由于国内生物产业的产业化程度低、科研成果转化为生产力的周期长、速度慢，技术水平和装备水平还有待进一步提高，缺少一支强大的生物化工技术企业

14、队伍，对生物化工产品的开发投资不够、投资渠道单一、缺乏应有的经济支撑，所以我国的微生物发酵总体技术水平与国外的差距较大，产品生产成本明显高于国外，既难以进人国际市场参与竞争，也难以抵挡国外产品进人国内市场。国内微生物发酵产品总体生产规模较小，产品在竞争中处于不利地位，因此发酵产品的开发，应该坚持规模经济的原则。在发展战略上，应选择一些达到国际水平的生物化工和精细化工项目作为开发重点，以带动整个行业的技术进步。重点开发的项目应具备以下条件：已有较大的生产规模，市场容量和潜力较大；技术上比较成熟，与国外差距较小，有规模化的可能性；有代表性的骨干产品，能形成产品链，具有带动整个领域发展的示范作用。这

15、样就能逐步解决我国生物产业生产规模小、产品转化率低、应用开发能力差、难以形成产业链等问题。我国的微生物发酵工业正面临着既要推进传统产业革命，又要迎头赶上世界新技术革命的现状。发酵工业的发展必须要有超前意识，政府应从机制、税收、金融等方面予以扶持，积极创造条件，在有选择地引进消化吸收国外先进技术成果的同时，以微生物发酵工程、酶工程和生化工程的开发为重点，以工程和装备及放大技术为突破口，逐步开展基因工程和细胞工程等基础研究，建立高效能的科研开发体系，大力培养并建立企业的开发力量，为新世纪开创发酵工程及其产业新局面奠定坚实的基础。1.1.3 微生物工程主要研究内容微生物工程是利用微生物生长代谢活动产

16、生的各种生理活性物质来生产商业产品，它包括从投入原料到最终产品获得的整个过程。微生物工程就是要研究和解决整个工程中的工艺和设备问题，将实验室和实验中型实验所取得的成果迅速扩大到工业化大规模生产中去。微生物工程研究与教学内容一般可分为微生物细胞和过程管理两大部分，但它们又不能截然分开。由于分子生物学和基因工程原理的概念、原理和方法的引入，使微生物育种发生了巨大的变化，不仅使研究更加深入，对微生物细胞的活动规律及其调控机制的研究也取得长足发展，极大地丰富与改变了育种的方法和措施。当前微生物工程研究内容大致归纳为以下诸多领域：1.1.3.1微生物菌种、菌种选育的研究微生物的菌种是微生物工程的基础，也

17、是微生物工程的动力源。优良菌种的选育是提高产品收得率的前体，也是微生物工程的核心部分，菌种选育方法的选择使用是优良菌种获得的关键。因此，微生物工程目前的核心课题之一就是研究菌种与菌种选育方法的关系，以及如何获得高产、优良、遗传稳定的突变株，它也是分子生物学、遗传工程细胞工程在细胞水平与分子水平上相结合的最活跃的热门课题。1.1.3.2微生物的代谢调节和代谢工程的研究代谢控制就是用遗传学的方法或其生物化学的方法，人为地在分子生物水平上，改变和控制微生物的代谢，使有用的产物大量生产、积累。代谢控制的关键，取决于控制机制是否能够被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，来人为控制微生物的代谢。由于代谢图

18、的确立分子生物学和分子遗传学的发展，可以在DNA分子水平上改变微生物的代谢，使微生物的菌学性质，按人为的目的发展，合理控制环境条件，加强科学化管理，进行最优化控制。目前，采用代谢途径的研究，通过基因工程、细胞工程等手段创造新型微生物突变株是现代微生物工程的重要课题之一。它们的突破毕竟获得新的产品、新的工艺、新技术、新理论。1.1.3.3培养基的研究微生物的生长、繁殖、代谢和合成都是通过微生物培养来实现的，研究培养基地的组成与配比，不仅可控制微生物生长繁殖的环境条件，而且是研究微生物代谢与合成，产品的提炼与质量提高的重要途径，目前微生物培养的研究主要是，一是培养基最基本的成分要求与生产培养基的最

19、基本成分要求以及它们之间的差别，二是培养基的环境条件，并通过改变培养环境条件的改变对微生物代谢控制的影响，三是培养基正在从糖质原料转到利用石油、天然气、空气及纤维素新资源，更为远大目标是利用碳酸气、氢、氧等的研究，开辟原料新途径。1.1.3.4发酵工艺控制研究发酵工艺控制是微生物工程的基础。逐年发酵工艺控制是研究已越来越显示出其重要性，也是微生物工程、细胞工程遗传工程的重要会合点。近代生物工程的发展，尤其是分子生物学，遗传达室工程，细胞工程和发酵工程设备的完善与建立已为发酵工艺控制的研究奠定了良好的基础，也是近年发酵工艺控制蓬勃发展的重要原因。一个优良的菌种通过发酵工艺控制如何获得产品为复杂的

20、综合体，是生物工程与生物技术学科中引人入胜的主要课题之一。由于发酵工艺控制影响因素和发酵理论的全面提示，发酵工艺向大型发酵、连续化、自动化方向发展，为控制发酵的计算机控制发酵展示诱人的前景。多数研究人员认为，发酵工艺控制实现全面计算机化是必然结果。1.1.3.5下游加工技术的研究先进的下游加工技术研究是微生物工程工业化的关键。下游加工技术研究不仅可实现微生物工程的工业化，而且使工业化产品获得良好的经济效益，下游加工技术研究不仅有纯理论的研究，而且包括各种具体单元操作的研究。虽然单元操作与化学工程有共性，但仍存在着特殊性，原因是微生物工程是培养和处理活的有机体，因此，也可以认为，微生物工程是微生

21、物工业发酵应用化学工程有关理论和单元操作而发展成为具有新的特点的一门科学。1.1.4当前微生物工程研究的总趋势与重点领域微生物工程与分子生物学、基因工程、细胞工程、酶工程相互渗透与交融是总的发展趋势。无论是对微生物特性与功能的深入研究，还是对微生物活动规律的探索，都需用分子生物学的新概念、新方法，在分子水平上进行研究。换言之，微生物分子生物学将是今后研究的主流。1.1.4.1当前微生物工程研究中的基本问题与发展趋势当前微生物工程研究的课题归纳起来是研究六个根本性问题：1.1.4.1.1 菌种技术微生物菌种应用开发技术即菌种技术是其中的一个主要环节。菌种技术包括从自然界中得到生产目的产物菌种的菌

22、种筛选技术、提高菌种生产性能的菌种选育技术及保证菌种生产能力长时间维持的菌种保藏技术。代谢调控机制如何指导微生物育种工作？我们能否打破微生物正常的代谢调节，来人为控制微生物的代谢工程菌构建并用于生产。这也是微生物作为生命活动的基本单位的奥妙所在，因此发展高效、快速的菌种筛选技术是一项长期的科研任务。微生物细胞的生命活动的有序性是十分复杂的是非线性调控过程。这种调控是任何一台计算机都无法比拟的。1.1.4.1.2 微生物营养物质的资源开发主要是利用石油、天然气、空气及纤维素资源，这是21世纪极富挑战性的领域。它对于开辟人类未来粮食资源，燃烧废气中物资回收以及解决公害具有很大意义。它们是新兴微生物

23、工程的重要组成部分。1.1.4.1.3 微生物发酵动力学的研究微生物发酵动力学模型理论研究和生物传感器的研究涉及到发酵过程中菌体浓度、基质浓度、温度、pH值、溶解氧等工艺参数。它们是如何调控发酵的？发酵动力学为探索发酵中各种因素的作用和最佳控制开辟新的前景，其模型理论研究为比似放大提供理论依据。这方面的研究正方兴未艾。1.1.4.1.4 微生物工程的发酵技术一是发酵培养基制备技术，原料来源和价格；灭菌技术包括工艺路线、灭菌时间和温度，其发展趋势是将发酵和提取结合综合考虑产品的生产成本来开发培养基制备的技术；二是发酵过程控制优化技术是在现有的菌种或基因工程菌的基础上，在发酵罐中通过操作条件的控制

24、或发酵装备的适当改造达到发酵产品的生产最优，即生产能力最大或经济效益最高或产品质量最好；三是发酵过程配套的技术，涉及到空气压缩过滤技术、搅拌器的配套技术、制冷技术等，包括水、电、气、汽等的动力成本占发酵生产成本的40%60%，而由于搅拌轴机械加工技术落后，使发酵罐容积难于突破200m3。发酵过程控制优化指的是在已经提供的菌种或基因工程菌基础上，在发酵罐中通过操作条件的控制或发酵罐装备的选型改造，达到发酵产品生产最优，即生产能力最大、成本消耗最低或产品质量最高。当前中国在传统生物技术产业上有关发酵产品的品种和生产量已经处于世界第一的地位，但是由于发酵过程优化技术研究和应用滞后的原因，许多产品的生

25、产水平不高，与国际差距很大，因而生产成本高，市场竞争能力弱。1.1.4.1.5 下游分离纯化技术 在发酵工程中寻求操作简单、经济适用的分离纯化技术，已经成为生物化工领域的热点研究问题之一，主要是利用现有的分离纯化技术进行重新组合和开发，减少操作工艺程序，降低生产成本。分离纯化技术的研发有两个方向，一是结合其他学科的发展开发新的分离纯化技术；二是对现有的分离纯化技术进行重新开发，从另一个角度对现有的分离纯化技术进行利用，如絮凝和凝聚通常用于发酵工艺菌体去除，而国内有报道将絮凝和凝聚用于含延胡索酸酶活菌体的收集，通过选择适合的絮凝剂，可以最大程度地去除杂质，保护酶的活性。新型分离纯化技术的开发与应

26、用，可以减少后提取工艺的操作费用，提高后提取工艺的产品收率，大大降低了生产成本，使许多产品大规模生产成为可能，使生化过程替代化学过程成为可能。1.1.4.1.6 新技术的应用。主要是结合其他学科的发展开发新的分离纯化技术，涉及微生物学、生物学、工程学、电子学、信息学、机械学、计算机等诸多学科领域，任何学科的发展都可以促进发酵工程的技术进步。新技术的应用与探索，将促使微生物工程产业迈向一个新天地。新技术的应用包括膜分离技术、连续离子交换、连续结晶、分子蒸馏技术、气体超临界萃取技术等等的研究，1.1.4.2 微生物工程研究的主要课题和研究方向1.1.4.2.1 计算机控制微生物发酵过程主要计算机自

27、控系统的作用近年来，有关计算机在微生物工程中的应用有很大的改变。根据微生物发酵动力学模型模拟理论作为依据来设计计算机程序，使得工艺流程和发酵技术参数达到最优化控制。微生物发酵机制，发酵动力学，发酵工艺是计算机控制基础和理论指导而计算机控制可促进微生物工程的发展。因此，大量的通过微生物发酵动力学的研究来进行最佳发酵工艺条件的控制是研究的主要问题，而计算机如何控制工艺参数及程序的动态变化是核心问题，计算机所起作用的大小完全取决于提供数据的分析测试仪器的可靠性精确度，以及对微生物工程的生物化学知识是否了解透彻。1.1.4.2.2 育种与分子生物学、组胚工程、遗传工程、代谢调控之间关系及其研究微生物遗

28、传育种的研究与分子生物学、遗传工程、代谢调控等许多重要问题密切相关，它成为了解错综复杂的微生物工程现象不可缺少的内容，并成为多领域、多层次的纽带，微生物遗传育种的研究对了解微生物工程的本质与活动的规律有关重要的理论意义。微生物育种的研究一直是生物工程领域的热点课题之一，它的基本内容是：突变菌株的筛选：重点是缺陷型菌株的筛选产生各种氨基酸；杂交育种：重点是改变产品的产量和质量，创造出新品种；质生质体融合技术；DNA体外重组技术；基因表达系统。把育种与基因表达调控联系起来的研究是现代最时髦的热点课题。应当指出，微生物育种是一项十分复杂而艰巨的系统技术，并非简单的技术叠加组合。因此，通过代谢调控途径

29、的指引，采用合理的育种技术，在分子水平上选育微生物新菌种将是长期的研究课题之一。1.1.4.2.3 比拟放大方法微生物工程在实验室里用小试试验设备进行科学实验，如何在大型的生产规模设备里重视，是比拟放大所面临的最基本问题。也是微生物工程迫切需要解决的问题。比拟放大方法的研究不仅可提示微生物代谢调控机制，反应的动力学、力学及传递现象的深入了解，而且可确定微生物发酵工艺条件和操作条件，加强模型理论的研究。实验室的小型试验中间试验规模大型生产规模这个生产顺序仍是新产品、新品种投入生产的必经之路。因此，比拟放大方法在微生物工程中显得就非常之重要。当前，比拟放大方法是所谓的半数学模型法，定全的数学模型法

30、用于比拟放大尚存在困难，也是今后研究的重点课题之一。1.1.4.2.4 染菌放活的研究微生物工程中由于各种发酵工艺的菌种、培养基、发酵条件、发酵周期及产物性质不同，受污染的危害性亦不同。染菌是微生物工程的致使伤，轻者影响产率、产物种产量的质量；严重者造成“倒罐”现象，破坏生产计划，浪费原材料。放活染菌的研究主要集中在：污染菌的性质、污染的途径、污染的时间、污染的程度和所产生的后果以及原因分析和避免污染的措施。尤其是准确、快速的检测方法是主要研究内容之一。必须指出，上述诸领域与课题仍不能概括微生物工程的所有重大问题，还有许多方面，诸如处理污水、净化环境、防止菌种衰退的措施，酶合成的代谢调节等，都

31、对微生物工程十分重要，而且近年来也迅速得以进展。由于微生物是生命活动的基本单位，又是生命的缩影，它不仅体现生命的多样性和统一性，更体现生命活动的复杂性。我们对微生物的认识，必须建立在创新思维的基础上，着力探索它们之间的关系以及活动规律与人类所面临的诸多问题之间的关系。为此，我们给出如下二个有关生物工程的重大问题之图式，激励大家去思考和研究。 生物工程之间的相互关系1-2 微生物工程与微生物工程发展简史许多科学家认为，可以把微生物工程的发展划分为四个阶段：从人类开始从事酿造酒、醋的时期，是以自然发酵为主的微生物工程时期；19世纪末到20世纪30年代，主要建立纯培养技术；20世纪40年代到50年代

32、，主要是建立深层培养技术为主的微生物工程时期，这个时期由于好气性发酵工程的建立，1947年诞生了生化工程；20世纪5060年代以来，由于DNA重组技术、细胞融合技术的发展进入现代微生物工程时期，微生物工程的发展史和微生物工程学科的建立与发展，大概是符合这一历史进程的。现代微生物工程已发展到很高的水平，但它的发展遵循科学发展的普遍规律，我们有必要简要重温微生物及微生物工程发展的历史，有助于我们加深对微生物工程学科的形成及历史条件的认识。微生物及微生物工程发展的历史大概可划分为如下几个阶段：1.2.1自然发酵传统的微生物发酵技术微生物发酵技术有关悠久的历史，早在自然科学发源以前，我国劳动人民在数千

33、年以前就懂得酿酒、制酱油、食醋等。酿酒工业是历史上最古老的微生物工业，但那时人们并不知识微生物与发酵之间的关系，对发酵的机理尚不清楚，生产只能凭经验依靠口传心授，发酵过程难以控制，但实实在在地应用着微生物。例如好气性发酵应用在酒类酿造、好气性发酵应用在酿醋与制曲，这就是古典发酵之特色，这一时期，亦称为自然发酵时期。古代人的们虽不知微生物存在，却早就利用它们。古代制造奶酪的技术就涉及到奶类的发酵。几千年前中国和日本的酱油就是由发酵过的豆类制成的，在公元前6000年左右建筑的古埃及金字塔中就曾发现保存有面包，而面包的制造就涉及到酵母发酵。果酒的起源极为久远，中国的米酒可追溯到公元前2300年的夏禹

34、时代，据记载在公元前2000年，啤酒已盛行。1.2.2纯培养技术的建立第一代微生物发酵技术十七世纪，荷兰学者到文虎克（A.V. Leeuwen Hoek,1632-1723年）用设计较好地显微镜，第一通过显微镜观察到用肉眼看不见的微生物，包括细菌、酵母等，认识到微生物的存在，揭开了微生物的秘密。随着微生物的发现，1850-1880年，法国学者巴斯德（Louis Pasteur,18221895年）通过巴氏瓶实验发现了发酵原理，认识到发酵是由微生物的活动引起的，并证明酒精发酵是由活酵母所产生，各种不同的发酵产物是由各自不同的微生物所产生。随着微生物纯培养分离技术的初步确定，开创了人为控制微生物的

35、时代。通过应用这些原理，使发酵的腐败现象大大减少。十九世纪90年代德国学者毕希纳（Eduard Buehner,18601917年）将酵母细胞麻碎，得到酵素养汁仍将使糖液发酵产生酒精，并将这种具有发酵能力的物质称为酒化酶（zymase）。到世纪开始不久，又是法国学者柯赫（Robert Koch,18431910年）首先使用固体培养基，培养细菌的纯培养物，由此建立了比较完整地微生物纯培养技术。后来，又采用杀菌操作技术，发明了简便的密闭式发酵缸，发酵管理工程技术得到改进，发酵效率逐步提高。利用微生物分解代谢进行现代工业规模的酒类、酒清、丙酮、丁醇、甘油的生产，使用使得微生物工业逐渐加入了近代化学工

36、业的行业。因此可以认为，微生物纯分离培养技术的建立，是微生物工程发酵技术发展的第一个转折时期。这一时期的产品有酵母酒精，丙酮、丁醇、有机酸、酶制剂等，就是一些嫌气性发酵和表面固体发酵产生的初级代谢产物。1.2.3深层培养技术的建立第二代（近代）微生物发酵技术第二代微生物发酵技术的产品开始出现于20世纪40年代。1928年由英国学者弗莱明（Fleming）发现的青霉素，在1940年由弗洛里（Florey）及钱恩（chain）等的实验，它可以抑制许多细菌的生长，到1945年大规模地投入生产，解决第二次世界大战中对抗细菌感染药物的燃眉之急。同时引用了摇瓶进行实验室通风培养以及空气纤维过滤的高效灭菌，

37、导致40年代好气性发酵通气搅拌工程技术的建立，即深层培养技术的建立，随后链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等等好气发酵的次级代谢产物相继投产，抗生素、工业的兴起，不仅使用权微生物应用到医药工业方面，同时大大促进微生物工业的发展，开创了好气发酵工程。抗生素工业的发展很快促进了其它产物发酵的发展。最突出是20世纪50年代氨基酸的发酵工业及20世纪60年代酶制剂工业的发展及石油发酵。这时期的特点是：产品类型多，包括初级代谢产物：氨基酸、酶制剂、酸制剂、有机酸等；次级代谢产物：抗生素、多糖等分子量较基质更为复杂；生物转化产物：甾体化合物等；酶反就产物：6氨基青霉烷酸等；详见表1-1。技术要求高主要

38、是发酵过程要求在纯种或无菌条件下进行大多数属于好气性发酵，在发酵时要通入无菌空气。作为食品或药品的产品，其质量要求非常严格。规模庞大，从发酵缸看，搅拌通气罐大至500m3，作为这一时期的技术最高的单细胞蛋白工厂的气升式发酵罐的容积已超过2000m3。技术发展速度快，作为发酵工业，提高产品质量和产量的关键菌种，通过“代谢控制发酵技术”后经过人工诱变，获得代谢改变的突变菌株，其活力及性能获得惊人的提高，同时，在代谢途径控制下的发酵，选择性大量生产人的所需的产品。此项工程技术已用了核工业苷酸类物质，有机酸和部分抗生素的发酵生产。近代分生物学、分子遗传学研究的进展更促进该 项工程技术和工程理论的发展。

39、此外在新产品、新技术、新工艺、新设备不断更新，使其这一时期可以认为是常规微生物发酵工业的鼎盛时期。因此，代谢控制发酵工程技术的建立深层培养技术，是微生物工程发酵技术发展的第三个转折时期。表1-1 重要的近代微生物技术产品产业化年代年 代产 品公元前40002000年公元前1000年公元前600年公元前11世纪公元前12世纪公元前17世纪公元前18世纪1880192019201940194019501950196019601970197019801980果汁酿酒、醋、酱、原始啤酒、面包发酵、奶酪酱油用霉制疡人痘接种蒸馏酒精人工栽培食用菌牛痘接种乳酸、面包酵母、甘油、丙酮、丁醇、淀粉酶、转化酶柠檬

40、酸、葡萄糖酸、蛋白酶、核黄素、山梨糖青霉素、短杆菌肽、链霉素、金霉素、新霉素、两性霉素、衣康酸、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶谷氨酸、赖氨酸、土霉素、四环素、新生霉素、红霉素、制霉菌素、卡那霉素、丝环氨酸、庆黄霉素、曲酸、柠檬酸、葡萄糖酸、过氧化氢酶、甾体氧化产物、赤霉素、葡聚糖、单细胞蛋白、水杨酸葡萄糖酸、糖化酶、氨基酰化酶、脂肪酶、乳糖酶、头孢霉素、林可霉素、利福霉素、万古霉素、核糖霉素、杀稻瘟菌素、多氧霉素、泰勒霉素、缬氨酸、甾提氧化物、核苷酸、生物杀虫剂、黄原胶、石油发酵、污水处理、能源开发、细菌冶炼、单细胞蛋白博来霉素、阿霉素、杀念珠菌素、交沙霉素、西梭霉素、有效霉素、门冬氨酸、苏氨酸、凝

41、乳酶、右旋糖苷酶、维生素C、木糖醇、苹果酸、长链二元酸、普鲁兰多糖阿维霉素、苯丙氨酸、环氧乙烷、丙烯酰胺、聚羟基丁酸酯、酶抑制剂1.2.4微生物工程第三代微生物发酵技术这一代生物技术产品的特点是运用了现代生物技术DNA重组技术、细胞融合技术等的成果进行生产的产品。1953年，美国学者华特生（watson）和科里克(Crick)发现了DNA的双细旋结构，为DNA的重组奠定了基础。1974年美国的波依耳(Boyer)和科恩(Cohen)首次在实验室中实现了基因转移，为基因工程的理论和实际应用奠定基础。基因工程是按人的意志把非源基因（结构基因片段）在体外与截体DNA（质粒、噬菌体等）嵌合后导入宿生细

42、胞，使之形成能复制和表达非源基因的克隆(clone)，以获得基因产物（多肽或蛋白质），这是生命科学发展史上的一次飞跃，进入了定向改造生物种性的新时代。因此，这种改造微生物品术的建立，是微生物工程发酵技术发展的第四个转折时期。目前，DNA重组技术已广泛应用微生物、动物、植物和人类的多种生理活性蛋白。科研人员研究出大量目的基因分离，克隆载体和克隆子的筛选和鉴定的方法，构建出高产量的基因工程菌，使微生物产生出外源蛋白，并形成产品，如胰岛素、生长激素、细胞因子等。现代微生物工程其产品虽不多，但其潜力巨大，是21世纪的高新技术产业。用现代微生物工程技术改造已有的发酵工业，如氨基的工业、酶制剂工业、有机酸

43、工业、抗生素工业中的菌种改造上其潜力是很大的。有关已研究开发的现代微生物工程产品见表1-2。表1-2 已上市和一些正在研究开发的基因工程产品行 业产 品医药产品（包括兽用产品）食品及饲料添加剂农业化工及能源原料环境保护胰岛素（insulin）；生长激素（growth hormone），包括人和其他哺乳动物生长激素及其相关因子生长激素释放因子（growth hormone releasing factor）；干扰素（interferon，IFN），包括白细胞干扰素（IFN），成纤维细胞干扰素（IFN），免疫干扰素（IFN）；淋巴细胞活素（lymphokin），包括白细胞介素2（interleuk

44、in-2，IL-2），包括白细胞介素3（interleukin-3，IL-3），巨噬细胞激活因子（macrophage activating factor，MAF），B-细胞生长因子（B-cell growth factor）；血纤维蛋白溶解剂（fibrinolytics），包括组织血纤维蛋白溶酶原激活因子（tissue plasminogen activator ，TPA），链激酶（streptokinase，SK），尿激酶（urokinase，UK）；疫苗（vaccine），包括腺病毒（adenovirus），霍乱（cholera），巨细胞病毒（cytomalovirus，CMV），脑炎病

45、毒（encephalitis），甲型肝炎病毒（hepatitis A），乙型肝炎病毒（hepatitis b），疱疹病毒（herpes），流感病毒A和B（influenza A and B），副流感病毒（parainfluenza），疟疾（malaria），狂犬病毒（rabies），骨髓灰质炎（polinmyelitics），动物腹泻（animal scours），口蹄疫（foot and mouth dease），人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV），呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus），轮状病毒（rotav

46、iria），水痘-带状疱疹病毒（varicellazoster），黄热病毒（yellow fever）等；菌苗，如白日咳杆菌（Bordetella pertussis），破伤风杆菌（Clostridium tetani），致腹泻大肠杆菌（E.coli enterotoxin strain），流感噬血杆菌（Haemophilus influenzae），麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae），结核杆菌（M. tuberculosis），伤寒杆菌（Salmonella typhi），淋病奈瑟球菌（Neisseria gonorrhoeae），脑膜炎奈瑟球菌（N. meningit

47、idis），A组链球菌（Streptococcus group A），B组链球菌（S. group A），肺炎链球菌（S. pneumoniae），志贺菌属（Shigella），霍乱弧菌（Vibrio cholerae）等；胸腺素（thymosia）；白蛋白（albumin）；血因子（blood factor）；红细胞生成素（erythropoietin，EPO）；促血小板生长素（thrombopoietin）；集落刺激因子（colony dtimulating factor，CSF）粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating facor，G-CSF）和粒

48、细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating facor，GM-CSF）；激素类避孕疫苗 如降血钙素（calcitonin）；表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）；肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor ，TNF）；-1胰蛋白酶抑制剂（-1 antitrypsin）；心钠素（atrial natruetic peptide，ANP）；单克隆抗体（monoclonal antibodies，MABs）；生物传感器、基因芯片（gene chip）；利用基因工程菌生产的抗生素、氨基酸、甾体激素、维生素等氨

49、基酸（如天门冬氨酸、笨丙氨酸、苏氨酸、色氨酸）生物杀虫剂，包括病毒杀虫剂、细菌杀虫剂、真菌杀虫剂；防治植物病害微生物；生物除草剂，包括真菌（锈菌、镰刀菌、炭疽菌属）、线虫、病毒等。用可再生物质（biomass）生产甲烷、甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、多元醇、有机酸等；藻类产生的碳水化合物、蛋白质等物质；生物多聚物质，如黄原胶、黑色素、足丝粘性蛋白、生物合成橡胶、生物可降解塑料（聚羟基烷酯PHA、甲基侧链聚羟基丁酯PHB、乙基侧链聚羟基戊酯PHV）高效生物降解和/或解毒微生物1-3 微生物工程应用微生物工程是将微生物学、生物学、分子生物学、细胞生物学、化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物的生

50、长和代谢活动来生产各种有用物质的一般工程技术。微生物工程是生物工程的重要组成部分，是生物工程产业化的重要环节。目前，微生物工程在基因工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术的强力支持下，从分子水平改良微生物品种和性能、产生许多新品种、新产品、为生物工程赋予新的生命力，进一步扩大微生物生物工程应用范围，它不仅对工农业生产、人类社会产生深远的意义，而且潜存着巨大的发展空间和经济效益，以致改变人们的一些生活习惯。微生物工程在食品工业中的应用这是微生物工程的发源地和最早应用于之领域，至今其产量和产值似占据生物工程之首位。它的产品包括以下诸多方面：食品加工：以各种原料生产的单细胞蛋白（SCP）酵母等。含醇饮

51、料：以糖类物质（如水果汁等）和淀粉类物质为主要原料酿造或加工的葡萄酒、果酒、黄酒、白酒、啤酒、白兰地、威士忌、伏特加、金酒、朗姆酒等。发酵乳制品：奶酒、乳酪、酸奶等。调味品和发酵食品：味精、肌苷酸、鸟苷酸和以豆类和谷类等生产的酱、酱油、醋、豆腐乳、豆豉、馅糖、泡菜等。甜味剂：葡萄糖、麦芽糖、甘露糖醇、甜味肽、甜蛋白等。食品添加剂：面包酵母、赖氨酸、柠檬酸、色素、右旋糖酐葡聚糖和茁霉多糖（增稠剂），葡萄糖氧化酶和Vc（食品保鲜剂），乳链菌肽（食品防腐剂），匹马霉素（食品保护剂）等。食品检验：食品免疫检验方法可检测含量极低的微量残留物、真菌毒素、抗生素、激素、细菌毒素等。微生物工程在医药工业中的应

52、用医药工业领域是微生物工程应用最广泛，成绩最显著、发展最迅速、潜力亦最大的领域，其产值占20%。因为微生物工程可以从各方面改进医药的生产，开发新的药品，改善医疗手段，提高人类的生活健康医疗水平，并且也可以从中获得巨大的经济效益。抗生素抗生素迄今已发现约6000余种，其中绝大多数是由微生物产生，已形成工业化的产品、产值已超过50亿美元，产量超过10万吨。常用药品包括医用和兽用的（包括半合成抗生素）有的百余种。抗细菌抗生素：杆菌素（bacitracin）、头孢菌素（cephalosporin）、氯霉素（chloramphenicol，抗斑疹伤寒）、金霉素（chlortetracycline，抗G+

53、和G）、环丝氨酸（cycloserine，抗结核菌）、红霉素（erythromycin，抗G+）、庆大霉素（gentamycin，抗G+和G）、卡那霉素（kanamycin，抗G+和G）、青紫霉素（lividomycin，抗G+和G）、柱晶白霉素（leucomycin，抗G+）、林可霉素（lincomycin，抗G+）、麦迪霉素（mydecamycin，抗G+）、新霉素（neomycin，局部使用）、新生霉素（novomycin，抗G+）、竹桃霉素（oleandomycin，抗G+）、土霉素（oxytetracycline，抗G+和G）、巴龙霉素（paramomycin，兼治阿米巴）、青霉素（

54、penicillin，抗G+）、磷霉素（phosphonomycin，抗G+和G-）、多黏菌素（polymyxin，抗G+）、核糖霉素（ribostamycin，抗G+和G）、利福霉素（rifomycin，抗结核菌）、相模湾霉素（sagamycin，抗G+和G-）、紫苏霉素（sisamycin，抗G+和G）、螺旋霉素（spriamycin，抗G+）、链霉素（streptomycin，抗结核菌）、四环素（tetracycline，抗G+和G）、托普霉素（tobramycin，抗G+和G）、短杆菌肽（tyrothricin，抗G+）、万古霉素（vancomycin，抗G+）、紫霉素（viomyci

55、n，抗结核菌）等。抗真菌抗生素：两性霉素B（amphotericin B）、杀假丝菌素（candicidin）、灰黄霉素（griseofulvin，抗皮肤真菌）、制霉菌素（nystain）等。抗原虫抗生素：烟古霉素（fumagillin）、古曲霉素（trichomycin，抗滴虫）等、抗肿瘤抗生素：放线菌素（actinomycin）、阿德力亚（阿）霉素（adriamycin）、博来霉素（bleomycin）、光神霉素（mithramycin）、丝裂霉素（mitomycin）、内瘤霉素（darkomycin）等。起免疫抑制作用的抗生素：如环孢菌素A等。半合成抗生素；某些天然抗生素在氏期的使用中会

56、诱使一些病原菌产生抗药性。为了解决抗药性，同时也为了扩大抗菌谱，采用半合成的方法，将天然抗生索的侧链去掉，再用化学法加上新的侧链如此产生的抗生素被称为半合成抗生素。研究最多的为青霉素型和头孢菌素型半合成抗生素。青霉素型半合成抗生素：如对青霉素酶稳定的甲氧苯青雷素、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯苯唑青霉素，广谱的氨苄青霉亲、羟氨苄育霉素，抗绿脓杆菌的羧苄青霉素、磺苄青霉素等。头泡菌素型半合成抗生素：头孢号噻唑霉素)、头孢号(头孢利定)、头孢号(头孢甘氨酸)、头孢号(头孢力斯)、头孢号(唑啉头孢菌素)、头孢号(环己烯胺头孢菌素)、吡硫头孢菌素、氰甲基头孢菌素；其他半合成抗生素：丁胺卡那雷素、甲烯土

57、霉素、强力霉素(去氧土雷素)、二甲胺四环素、四氢吡咯甲基四环素、去甲基金霉素、利福平、氯林肯霉素、去甲基林肯雷素、乙酰螺旋霉素等。.2氨基酸氨基酸在医药中除用作大输液外，还广泛地用于临床治疗，如精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸等可以治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病；天门冬氨酸钾盐和镁盐的混合物，可用于恢复疲劳，治疗心脏病、肝病、糖尿病；某些氨基酸的类似物如S-氨甲酰基-半胱氨酸(天门冬酰氨的类似物)、N-乙酰-L-苯丙氨酸、N-乙酰-L-缬氨酸等可以作为癌细胞的抑制剂等。现可经发酵获得的氨基酸有谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、瓜氯酸、鸟氨酸等。可用酶法获得的氨基酸有天门冬氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等。.3维生素目前可用发酵获得的维生素或合成维生素的中间产物有维生素B2(核黄素)，维生素B12(氰钻氨素)，2-酮基-古龙酸(维生素C-抗坏血酸的前体)，-类胡萝卜素(维生素A的前体)，麦角甾醇(维生素D2的