菌种的选育与保藏

1、第九节第九节 工业微生物菌种保藏技术工业微生物菌种保藏技术 在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1) 经长期保藏后菌种存活健在；(2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。一、微生物菌种保藏一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面

2、、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥 由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。用特点及现有条件等进行综合考虑。 对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。法的失败而导致菌种的丧失。国际重要菌种保藏

3、机构国际重要菌种保藏机构中国菌种保藏单位中国菌种保藏单位二、工业微生物菌种保藏技术二、工业微生物菌种保藏技术 (1)超低温或在液氮中冷冻保藏； (2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。菌种保藏方法菌种保藏方法 暂时保藏法暂时保藏法 斜面传代法斜面传代法 穿刺法穿刺法 长期保藏法长期保藏法 液体石蜡法液体石蜡法 甘油管法甘油管法 砂管保藏法砂管保藏法 砂土管保藏法砂土管保藏法 滤纸片保藏法滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法液氮冷冻法 2.12.1 冷冻保藏冷冻保藏 冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷

4、冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类冷冻保藏种类 一、普通冷冻保藏技术(-20)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80)三、液氮冷冻保藏技术 普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20)(-20)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶

5、口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。二、超低温冷冻保藏技术二、超低温冷冻保藏技术(-60(-60一一-80)-80)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。 如果待

6、保藏菌种生长在斜面上，则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。三、液氮冷冻保藏技术三、液氮冷冻保藏技术 (一)冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 (二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶

7、。 (2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。 2控速冷冻(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1/m

8、in，直到温度达-50；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196)或 气相(-156)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。(三)复苏 1从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以加速解；3用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。2.22.2 冻干保藏冻干保藏 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为

9、有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。培养物的冻干过程培养物的冻干过程冷冻真空干燥操作流程冷冻真空干燥操作流程安培瓶安培瓶配制保护剂配制保护剂灭菌灭菌菌种菌种培养培养制备菌悬液制备菌悬液分装安培瓶分装安培瓶洗净烘干洗净烘干装标签装标签加棉塞加棉塞预冻预冻真空干燥真空干燥测定水分测定水分熔封管口熔封管口检查真空度检查真空度包藏包藏( (三三) )冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生1保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。较低

10、的保藏温度(-20-70)对于培养物的长期稳定更好。2复苏：(1)在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。(3)在安瓿中加入0.51ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。2.32.3传代保藏传代保藏将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验

11、室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。2.3 传代培养法实验原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于 厌氧细菌）培养好后，置4C冰箱中存放，定期 进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延长保存期。操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C冰箱中包藏。 保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存24个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。 此法优点

12、是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。2、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保存。 此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏12年，普通细菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4冰箱存放。矿物油中浸没保藏矿物油中浸没保藏将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。浸没保藏的操作

13、要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株23年也应做一次存活试验。2.4 载体法实验原理：使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。操作方法（砂土管保藏法） （1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。倒去

14、盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。（）土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10 x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2-3次)，最后烘干。2.42.4 基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞

15、生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。不同菌种保藏方法比较不同菌种保藏方法比较2.5 2.5 微生物活力和稳定性测定微生物活力和稳定性测定 所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌

16、种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。 加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。 成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括：在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。三、三、 菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮 在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的变异是大量的

17、，而进化性的变异却是个别的。在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退（degeneration）。 在长期接触菌种的实际工作人员中，都有这样的体会，即如果对菌种工作长期放任自流，不搞纯化、复壮（rejuve-nation）和育种，则菌种就会对你进行“惩罚”，反映到生产上就会出现持续的低产、不稳产。这说明菌种的生产性状也是不进则退的。菌种衰退的表现对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。其他原有

18、的典型性状变得不典型时，也是衰退。最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。生长速度缓慢，产孢子越来越少。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。 菌种衰退的实质菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变过程。开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体

19、存在着。复壮的概念狭义的复壮仅是一种消极的措施，它指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施；而广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。所以，这实际上是一种利用自发突变（正变）不断从生产中进行选种的工作。 二、菌种的衰退与复壮二、菌种的衰退与复壮1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。重新获得具有原有典型性状的菌种。2）有意识

20、地利用微生物会发生自发突变的特性，在）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种日常的菌种 维护工作中不断筛选维护工作中不断筛选“正变正变”个体。个体。大量群体中的自发突变菌种的复壮：a）纯种分离；）纯种分离；b）通过寄主体进行复壮；）通过寄主体进行复壮；菌种衰退的特点：实践中关于防止菌种衰退和进行复壮的经验 （一）衰退的防止 1控制传代次数 2创造良好的培养条件。在实践中，有人发现如创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退。 如改变培养基成分、改变培养温度等。3利用不同类型的细胞进行接种传代 。用灭过菌的棉团进行孢子接种，不同孢子的接种尝试。4采用有效的菌种保藏方法

21、 ，有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种生产性状的衰退 。（二）菌种的复壮 1纯种分离 。通过纯种分离，可把退化菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。 方法2通过宿主体内生长进行复壮 。对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种至相应的昆虫或动、植物宿主体内的措施来提高它们的致病性。 3淘汰已衰退的个体 ，如低温抗性筛选。工业发酵染菌的防治工业发酵染菌的防治第一节第一节 工业发酵染菌的危害工业发酵染菌的危害纯种培养要求必须防止杂菌污染纯种培养要求必须防止杂菌污染为防止染菌，采取了一系列措施：为防止染菌，采取了一系列措施： 密闭式发酵

22、罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作；密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作；染菌无法彻底避免；据报道染菌无法彻底避免；据报道国外抗生素发酵染菌率为国外抗生素发酵染菌率为25%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为菌率为2，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体，谷氨酸噬菌体感染率为感染率为12染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。一、 染菌对各种发酵的影响：染菌对各种发酵的影响： 青霉素：产青霉素酶的杂菌青霉素：产青霉素酶的杂菌疫

23、苗：全部废弃疫苗：全部废弃柠檬酸：主要防止前期染菌柠檬酸：主要防止前期染菌谷氨酸：噬菌体危害大谷氨酸：噬菌体危害大肌苷、肌苷酸：易染菌肌苷、肌苷酸：易染菌二、染杂菌种类对发酵的影响二、染杂菌种类对发酵的影响 青霉素发酵污染细短产气杆菌比污染粗大杆菌危害大，链霉素青霉素发酵污染细短产气杆菌比污染粗大杆菌危害大，链霉素发酵污染细短杆菌和假单孢杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌危害大，发酵污染细短杆菌和假单孢杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌危害大，四环素怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌四环素怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌三、不同染菌时期对发酵的影响：三、不同染菌时期对发酵的影响：（1）种子培养期染菌：易染菌

24、、应灭菌后除去，并对种子罐、管道进）种子培养期染菌：易染菌、应灭菌后除去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。行检查和彻底灭菌。（2）发酵前期染菌：易染菌、应特别防止，可重新灭菌，补充营养，）发酵前期染菌：易染菌、应特别防止，可重新灭菌，补充营养，重新接种发酵。重新接种发酵。（3）发酵中期染菌：）发酵中期染菌：发酵中期染菌，挽救处理困难，危害性大；发酵中期染菌，挽救处理困难，危害性大；抗生素发酵：抗生素发酵： 将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，低流加糖量等措施制杂菌繁殖，同时采取低通风

25、，低流加糖量等措施柠檬酸发酵：柠檬酸发酵： 污染细菌：加大通风量，加速产酸，降低污染细菌：加大通风量，加速产酸，降低pH，抑制细菌生长；，抑制细菌生长； 污染酵母污染酵母 ：加：加0.025-0.035g/L硫酸铜；硫酸铜； 污染黄曲霉；加入另一罐将近成熟的醪液，使污染黄曲霉；加入另一罐将近成熟的醪液，使pH下降，黄曲霉下降，黄曲霉自溶自溶 污染青霉：青霉能在低污染青霉：青霉能在低pH环境下生长，可考虑提前放罐。环境下生长，可考虑提前放罐。（4）发酵后期染菌）发酵后期染菌 可考虑提前放罐。可考虑提前放罐。 四、染菌程度对发酵的影响四、染菌程度对发酵的影响 染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越

26、多，对发染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，对发酵的危害越大。酵的危害越大。染少量杂菌，有时可以容忍；染少量杂菌，有时可以容忍；前期和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。前期和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。 五、染菌对产物提取和产品质量的影响五、染菌对产物提取和产品质量的影响 菌体自溶，发酵液发粘、发臭，过滤困难菌体自溶，发酵液发粘、发臭，过滤困难一、种子培养和发酵的异常现象一、种子培养和发酵的异常现象 1、种子培养异常、种子培养异常（1）菌体生长缓慢：原料质量、菌体老化、供氧不足、温度、酸碱）菌体生长缓慢：原料质量、菌体老化、供氧不足、温度、酸碱度，种子冷藏时间长或接种量过低。度，种

27、子冷藏时间长或接种量过低。（2）菌丝结团：菌丝团中央结实，内部菌丝的营养吸收和呼吸受到）菌丝结团：菌丝团中央结实，内部菌丝的营养吸收和呼吸受到影响，不能正常生长。原因多而且复杂。影响，不能正常生长。原因多而且复杂。（3）代谢不正常：接种物质量和培养基质量、培养环境查，接种量）代谢不正常：接种物质量和培养基质量、培养环境查，接种量小、杂菌污染等有关小、杂菌污染等有关第二节 染菌的检查、分析和防治2、发酵异常、发酵异常（1）菌体生长差：种子质量的影响；导致代谢缓慢。）菌体生长差：种子质量的影响；导致代谢缓慢。（2）pH不正常：培养基质量、灭菌效果、补糖等影响；不正常：培养基质量、灭菌效果、补糖等影

28、响；是所有代谢反应的综合反映。是所有代谢反应的综合反映。（3）溶解氧异常）溶解氧异常 染菌：染好氧菌，染厌氧菌染菌：染好氧菌，染厌氧菌（4）泡沫过多）泡沫过多 泡沫的消长不符合规律；培养基灭菌时温度过高或泡沫的消长不符合规律；培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖变成氨基糖会引起泡沫。时间过长，葡萄糖变成氨基糖会引起泡沫。（5）菌体浓度过高或过低）菌体浓度过高或过低 罐温长时间偏高；溶氧不足；营养条件差；种子质罐温长时间偏高；溶氧不足；营养条件差；种子质量差；菌体自溶。量差；菌体自溶。二、染菌的检查与判断二、染菌的检查与判断1、染菌的检查、染菌的检查（1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）

29、显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）（2）平板划线培养或斜面培养检查法；）平板划线培养或斜面培养检查法； 平板制好后，应先保温平板制好后，应先保温24小时，确定无菌小时，确定无菌（3）肉汤培养基检查法（酚红变色）肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）2、以上、以上3种检查法的不足种检查法的不足 以上以上3种检查法未发现染菌，还不能肯种检查法未发现染菌，还不能肯定未被染菌；定未被染菌； 原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染菌情况（大的染菌情况（1个个/ml）3、发酵过程的异常现象来判断染菌、发酵过程的异常现象来判断染菌（1）溶解氧水平异常显示染菌（

30、谷氨酸）溶解氧水平异常显示染菌（谷氨酸）（2）排气中）排气中CO2异常显示染菌异常显示染菌CO2的含量变化是有规律的；的含量变化是有规律的；染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌体，含量增加；染噬菌体，糖耗减慢，糖耗减慢， CO2含量减少。含量减少。三、发酵染菌率和染菌原因分析三、发酵染菌率和染菌原因分析（一）、发酵的染菌率（一）、发酵的染菌率发酵染菌批数发酵染菌批数总投料批数总投料批数总染菌率总染菌率 100 染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性质、质、发酵周期、生产环境条件设备和管

31、理技术发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水平等有关。水平等有关。（二）、染菌原因分析（二）、染菌原因分析（1）染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于）染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于未然。未然。（2）主要染菌原因：种子带菌，无菌空气带菌，）主要染菌原因：种子带菌，无菌空气带菌，设备渗漏，灭菌不彻底，操作管理不当。设备渗漏，灭菌不彻底，操作管理不当。（3）染菌的杂菌种类分析：）染菌的杂菌种类分析： 杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角）杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角） 杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设备杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设备渗漏，管理操作等）渗漏，管理操作等） 杂菌

32、是真菌杂菌是真菌（4）染菌的规模分析）染菌的规模分析 大批量发酵罐染菌：种子、空气；大批量发酵罐染菌：种子、空气； 前期：种子带菌，灭菌问题；前期：种子带菌，灭菌问题； 中后期：空气带菌；中后期：空气带菌； 部分发酵罐染菌：部分发酵罐染菌： 个别发酵罐连续染菌：设备渗漏个别发酵罐连续染菌：设备渗漏（5）染菌的时间分析）染菌的时间分析种子培养阶段：种子，灭菌，操作；种子培养阶段：种子，灭菌，操作；发酵前期：种子，灭菌，操作；发酵前期：种子，灭菌，操作；发酵后期：空气，补料，设备渗漏，泡沫发酵后期：空气，补料，设备渗漏，泡沫四、染菌途径及预防四、染菌途径及预防1、种子带菌的防止、种子带菌的防止（1

33、）培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压；）培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压；（2）菌种在转接过程中受污染：操作不当，管理不严；（缓冲间）菌种在转接过程中受污染：操作不当，管理不严；（缓冲间）（3）菌种在培养或保存过程中受污染）菌种在培养或保存过程中受污染（试管塞，查看的时候要注意）（试管塞，查看的时候要注意）2、无菌空气带菌及其防止：、无菌空气带菌及其防止： 流程设计，介质灭菌流程设计，介质灭菌3、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治（1）原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，）原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易

34、杀灭；可升温前搅拌和易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；可升温前搅拌和加淀粉酶。加淀粉酶。（2）实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升）实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。温时，应打开排气等阀门放气。（3）连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭）连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底。菌温度，导致灭菌不彻底。（4）设备和管道存在）设备和管道存在“死角死角” 死角：由于操作、设备结构、安装或人为造成的死角：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的定应该到达的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。要求。常见的设备、管道常见的设备、管道“死角死角” 发酵罐的发酵罐的“死角死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢罐底脓疱状积垢。管道安装不当形成的死角4、设备渗漏引起的染菌及其防止、设备渗漏引起的染菌及其防止 （1）发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀