高中生物《第五章 第三节 血红蛋白的提取和分离》课件6 新人教版选修1

1、 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 样品的处理样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的

2、装填。1. 1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路： 选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。2. 2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类的蛋白质。类的蛋白质。 一、血红蛋白的提取和分离一、血红蛋白的提取和分离3 3、提

3、取分离方法、提取分离方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 （一）（一） 凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2. 2.凝胶：凝胶： 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如葡聚糖或琼（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道。通道。 根据被分离物质的根据被分离物质的蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量的大小，的大小，利用具有利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行的凝胶，来进行分离。分离。1. 1.概念：概念：3.3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，当相对分子量不同的蛋白

4、质通过凝胶时，相对相对分子量较小的蛋白质分子量较小的蛋白质容易容易进入凝胶内部的通道，进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢; ;相对分子量相对分子量较大较大的蛋白质的蛋白质无法进入凝胶内部的无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。度较快。依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。分离蛋白质分离蛋白质（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念: : 在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸或强碱酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶

5、液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。2.2.作用作用: : 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。 NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内使用的范围内使用的缓冲液。缓冲液。 4.4.

6、提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是:_ ,:_ , 利用缓冲液利用缓冲液模拟细胞内的模拟细胞内的PHPH环境环境，保证，保证 血红蛋白的正常结构和功能血红蛋白的正常结构和功能，便于观察，便于观察( (红色红色) )和科和科 学研究学研究( (活性活性) )磷酸缓冲液磷酸缓冲液3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制: :其目的是其目的是:带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在有可解离的基团，在一定的一定的PHPH下，这些基团会带下，这些基团会

7、带上正上正 电或负电。电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷带电荷相反相反的电极移动。的电极移动。分离样品中各种分子分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。从而实现样品中各种分子的分离。影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素决定决定运动方向运动方向形成形成库仑力库仑力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子

8、大小琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 1 1、测定蛋白质分子量、测定蛋白质分子量: :常用常用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺和和交联剂交联剂N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚

9、甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。2. 2.原理：原理： SDSSDS能使能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链肽链，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有原有的电荷量的电荷量。因而。因而掩盖了不同种掩盖了不同种蛋

10、白质间的蛋白质间的电荷差电荷差别，别，使使电泳迁移率完全取决于分子的大小电泳迁移率完全取决于分子的大小。3. SDS3. SDS作用机理作用机理: :用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测定蛋白质的分子量时，可选用一组白质的分子量时，可选用一组已知分子量已知分子量的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测定，可以测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子量、市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋

11、白试剂出次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。售。 二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。分离血红蛋白。血血液液血浆血浆水水 分分固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（9090）两个两个肽链肽链两个两个一肽链一肽链四个亚铁血红素基团

12、四个亚铁血红素基团2.提问：提问：血液有哪些成分？血液有哪些成分？ 1. 1.提问：提问：用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA，用猪、牛、羊的用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行便于进行DNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白两个两个肽链肽链两个两个一肽链一肽链四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红

13、素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子一分子O2或一分子或一分子CO2，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤: :去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化. .1 1、采集血样、采集血样2 2、低速短时间离心、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细（速度越高和时间越长，会使白细 胞等一同沉淀，达不到分离的效果）胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：、盐水洗涤：下层

14、暗红色的红细胞下层暗红色的红细胞+ +五倍体积的五倍体积的0.90.9 的的NaClNaCl溶液洗涤，搅拌溶液洗涤，搅拌10min10min5 5、低速、低速短时间短时间离心：离心：6 6、重复、重复3 3、4 4、5 5步骤三次步骤三次 上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。目的目的: :操作：操作：洗涤次数过少洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。无法除去血浆蛋白。加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，加加40体积的甲苯体积的甲苯（溶解细胞膜）（溶解细胞膜）置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器搅拌搅拌10min（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）红细胞破裂，释放出血红蛋

15、白红细胞破裂，释放出血红蛋白(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的速的速度度离心离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1层（最上层）：层（最上层）：甲苯层甲苯层（无色透明）；（无色透明）；第第2层（中上层）：层（中上层）：脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；（白色薄层固体）；第第3层（中下层）：层（中下层）：血红蛋白的水溶液层血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；（红色透明液体）；第第4层（最下层）：层（最下层）：杂质沉淀层杂质沉淀层

16、（暗红色）。（暗红色）。分离分离：滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，分液漏斗中静置：分出下层的分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液红色透明液体体。甲苯层甲苯层（无色透明）无色透明） 白色薄层固体白色薄层固体 红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色） 试管中溶液层次试管中溶液层次(4)(4)透透 析：析：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液的血红蛋白溶液装入透装入透析袋中，将透析袋放入盛有析袋中，将透析袋放入盛有300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲的磷酸缓冲液液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析12h12

17、h目的：目的：除去样品中分子量较小的杂质和离子。除去样品中分子量较小的杂质和离子。或用于更换样品的缓冲液。或用于更换样品的缓冲液。20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作: :（1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端磨平。两端磨平。底塞的制作：底塞的制作： 打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：玻璃管的注意事项：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底

18、面，否则难以铺实尼龙网，还上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。B B、代表意义、代表意义：“G”G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围及分离范围。 75 75表示凝

19、胶的得水值，即每克凝胶膨表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨 胀时吸水胀时吸水7.57.5克。克。凝胶的前处理：凝胶的前处理： 配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液： 计算并称取一定量的凝胶浸泡于计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液蒸馏水或洗脱液中中 充分溶胀后，配成充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：、固定：将色谱柱装置固定在支架上。将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：、装填：将将凝胶悬浮液一次性凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀注意：注意：1、装填

20、时尽量紧密：、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡：洗涤平衡：连接缓冲液洗脱瓶，在连接缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的高的操作压下，用操作压下，用300ml300ml的的20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤充分洗涤平衡平衡12h12h。注意：注意：1 1、液面不要低于凝胶表面，否则、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响分离

21、效果可能有气泡混入，影响分离效果2 2、不能发生洗脱液流干，露出凝、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象胶颗粒的现象。（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱调节缓冲液面：调节缓冲液面： 打开下端出口，使打开下端出口，使缓冲液下降到与凝胶面缓冲液下降到与凝胶面平齐，关闭出口平齐，关闭出口滴加透析样品滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的样品加到色谱柱的顶端顶端， 注意：注意： 1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。 2 2、贴壁加样、贴壁加样 3 3、吸管管口贴着管壁环绕移动加样、吸管管口贴着管壁环绕移动加样样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：打开下端出口，使样品

22、渗入凝胶床内，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内， 样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口洗脱：洗脱：加入加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，的磷酸缓冲液到适当高度， 连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：待待红色的蛋白质接近色谱柱底端红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出时，用试管收集流出 液，每液，每5ml5ml收集一试管，连续收集收集一试管，连续收集。（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成

23、功）注意：注意：正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。思考下面的问题：思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和范围内，维持结构和功能正常。功能正常。 1 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？冲液处理的目的是什么？ 2 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？这一

24、特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察观察颜色颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序包括：血红蛋白提取和分离的程序包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品的处理：样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、 离心等操作收集到离心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，样品的粗分

25、离样品的粗分离: :透析透析去除分子量较小的杂质去除分子量较小的杂质样品的纯化：样品的纯化：凝胶色谱法凝胶色谱法除去除去相对分子质量较大相对分子质量较大 的的杂质蛋白杂质蛋白纯度鉴定纯度鉴定: :聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。3.方法步骤：（略）方法步骤：（略） 观察处理的血液样品离心后观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。 此外，离心速度过高和时间过长，会使此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞白细胞和