中国药品检验标准操作规程ppt课件

1、中国药品检验规范操作规程2019年版 高效液相色谱法11、对仪器的普通要求l 所用仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处置系统组成 ，仪器应按现行国家技术监视局“液相色谱仪检定规程定期检定并符合有关规定。1.1 色谱柱l最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶 。反相色谱系统运用非极性添充剂 ，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等也有运用。正相色谱系统运用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱运用离子交换填充剂；分子排阻色谱运用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分别通常运用手性填充剂。 l

2、填充剂的性能如载体的外形、粒径、孔径、外表积、键合基团的外表覆盖度、含碳量和键合类型等以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保管行为和分别效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm1nm=10以下的填料，分析分子量大于2000的化合物那么应选择孔径在30nm以上的填料。l除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径普通在310m之间，粒径更小约2m的填充剂常用于填装微径柱内径约2mm。 l 运用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必需与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定的结果产生争议时，应以种类项下规定的色谱条件的测定结果为准。l以硅胶为载体的键合

3、固定相的运用温度通常不超越40，为改善分别效果可适当提高色谱柱的运用温度，但不宜超越60。 l流动相的PH值应控制在28之间。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解零落。当色谱系统中需运用PH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高外表覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需运用PH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻维护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。1.2 检测器l最常用的检测器为紫外检测器，包括

4、二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。l. 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其呼应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的构造有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对一切的化合物均有呼应；蒸发光散色检测器对构造类似的化合物，其呼应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。l紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的呼应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器呼应值与待测溶液的浓度通常呈指数关系，故进展计算时，普

5、通需经对数转换。l不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应符合紫外可见分光光度法2019年版二部附录 A项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应思索有机相中有机溶剂的截止运用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许运用含不挥发盐组分的流动相。 1.3 流动相l反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统，如经试用不适宜时，再选用其他溶剂系统。应尽能够少用含有缓冲液的流动相，必需运用时，应尽能够选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易坚持伸展形状，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，

6、流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否那么C18链的随机卷曲将导致组分保管值变化，呵斥色谱系统不稳定。 l各种类项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改动外，其他如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改动，以顺应供试品并到达系统适用性实验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者小于或等于50%相对于本身的改动量不超越30%且相对于总量的改动量不超越10%为限，如30%相对改动量的数值超越总量的10%时，那么改动量以总量的10%为限。 l对于必需运用特定牌号的填充剂方能满足分别要求的种类，可在该种

7、类项下注明。2、系统适用性实验l色谱系统的适用性实验通常包括实际板数、分别度、反复性和拖尾因子等四个参数。其中，分别度和反复性尤为重要。 l按各种类项下要求对色谱系统进展适用性实验，即用规定的对照品溶液或系统适用性实验溶液在规定的色谱系统进展实验，必要时，可对色谱系统进展调整，以符合要求。2.1 色谱柱的实际板数(n)。 l用于评价色谱柱的分别效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用实际板数作为衡量柱效能的目的时，应指明测定物质，普通为待测组分或内标物质的实际板数。l在规定的条件下，注入供试品溶液或各种类项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保管时间t

8、 R以分钟或长度计，下同，但应取一样单位和峰宽W半峰高宽Wh/2 ，按n16(t R/W)2或n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的实际板数。2.2 分别度R l用于评价待测组分与相邻共存物或难分别物质之间的分别程度，是衡量色谱系统效能的关键目的。可以经过测定待测物质与知杂质的分别度，也可以经过测定待测组分与某一添加的目的性成分内标物质或其他难分别物质的分别度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，经过测定待测组分与某一降解产物的分别度，对色谱系统进展评价与控制。 l无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分别度。除另有规定外，待测组分与相邻共

9、存物之间的分别度应大于1.5。 2.3 反复性 l用于评价延续进样后，色谱系统呼应值的反复性能。采用外标法时，通常取各种类项下的对照品溶液，延续进样5次，除另有规定外，其峰面积丈量值的相对规范偏向应不大于2.0；采用内标法时，通常配制相当于80、100和120的对照品溶液，参与规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对规范偏向也应不大于2.0。 2.4 拖尾因子T l用于评价色谱峰的对称性。为保证分别效果和丈量精度，应检查待测峰的拖尾因子能否符合各种类项下的规定。拖尾因子计算公式为：l TW0.05h/2d1l式中, W0.05h 为5%峰高处的峰宽；

10、d1为5%峰高出峰顶点至峰前沿之间的间隔。l除另有规定外，峰高法定量时T应在0.951.05之间。l峰面积法测定时，假设拖尾严重，将影响峰面积的准确丈量。必要时，应在各种类项下对拖尾因子做出规定。3、测定法 3.1 内标法 按各种类项下的规定，精细称量取对照品和内标物质，分别配成溶液，精细量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。丈量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子 校正因子AS/CS/(AR/CR) 式中 ,AS 为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。l 再取各种类项下含有内标物质的

11、供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，丈量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量： l 含量CXAX/(ASCS)l 式中,Ax为供试品峰面积或峰高； CX为供试品的 浓度；AS为内标物质的峰面积或峰高；CS为内标物质的浓度；为较正因子。l 采用内标法，可防止因样品前处置及进样体积误差对测定结果的影响。 3.2 外标法l按各种类项下的规定，精细称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精细取一定量，注入仪器，记录色谱图，丈量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积或峰高，按下式计算含量：l 含量CXCR(AX/AR)l 式中各符号意义同上。l由于微量注射器不易准确控制进样量，当采

12、用外标法测定供试品中某成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。3.3 加校正因子的主成分本身对照法 l测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分本身对照法。在建立方法时，按各种类项下的规定，精细称量取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述3.1法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各种类项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作较正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保管时间定位，其数值一并载入各种类项下。 l 测定杂质含量时，按各种类项下规定的杂质限制，将供试品溶液稀释成与杂质限制相当的溶液作为对照溶液，进样，调理仪器灵敏度以噪音程

13、度可接受为限或进样量以柱子不过载为限，使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的1025或其峰面积能准确积分【通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对规范偏向RSD应小于10%；含量在0.5%2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%】。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保管时间的2倍，丈量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。3.4 不加校正因子的主成分本身对照法 l测定杂质含量时，假设没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的

14、主成分本身对照法。同上述3.3法配制对照溶液并调理检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间除另有规定外，应为主成分保管时间的2倍，丈量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。l假设供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分别，那么按规定先记录供试品溶液的色谱图，再记录等体积纯溶剂的色谱图。色谱图上杂质峰的总面积包括溶剂峰，减去色谱图上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。3.5 面积归一法l按各种类项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。丈量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总

15、峰面积的百分率。l用于杂质检查时，由于峰面积归一化法测定误差大，因此，通常只用于粗略调查供试品中的杂质含量。除另有规定外，普通不宜用于微量杂质的检查。4、本卷须知l4.1 流动相的制备与保管l用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外-可见分光光度法进展溶剂检查，应符合要求；水应为新颖制备的高纯水，可用超纯水器制得或用重蒸水。凡规定pH值的流动相，应运用精细pH计进展调理，除另有规定外，偏向普通不超越0.2pH单位。配制好的流动相应经过适宜的0.45m或0.22m)滤膜滤过，以除去杂质微粒。流动相用前必需脱气，否那么容易在系统内逸出气泡，影响泵的任务、色谱柱的分别效率、检测器的灵敏度以及基线稳定性

16、等。l流动相普通储存于玻璃、聚四氟乙烯等容器内，不能储存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙腈等可浸出塑料外表的增塑剂，导致流动相受污染。储存溶剂一定要盖严，以防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相引起pH值变化，对分别或分析结果带来误差。磷酸盐、醋酸盐缓冲液容易发霉蜕变，应尽量新颖配制运用。如确需储存，可在冰箱内冷藏，并在3天内运用，用前应重新滤过。4.2 溶剂的配制与保管l除另有规定外，采用规定溶剂配制对照品溶液和供试品溶液，定量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别配制两份。供试品溶液在注入液相色谱仪前，普通应经适宜的0.45m或0.22m)滤膜滤过，以减少对色谱系统产

17、生污染或影响色谱分别。应根据实验要求和供试品的稳定性，设置待测溶液的储存条件如温度、遮光等。4.3 色谱柱的运用与保管l根据实验要求和流动相的pH值范围，参照色谱柱阐明书，选用适宜的色谱柱。安装色谱柱时应使流动相流路的方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致。除另有规定外，不宜反向运用，否那么会导致色谱柱柱效明显降低，无法恢复。进样前，色谱柱运用流动相充分冲洗平衡。经色谱系统适用性实验测试，应符合要求。l色谱柱在运用过程中，应防止压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的忽然变化或者机械震动都会影响柱内定相的填充情况；柱压的忽然升高或降低也会激动柱内填料，因此在调理流动相流速时应该缓慢进展。l实验终

18、了后，可按色谱柱的运用阐明书，对色谱柱进展冲洗和保管。l普通来讲，对于反相色谱柱，如运用缓冲液或含盐溶液作为流动相，在实验终了后，运用10倍柱体积如150mm柱长，约15ml的低浓度的甲醇/乙腈-水溶液10%20%冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出，再用较高浓度的甲醇/乙腈-水溶液50%冲洗，最后用高浓度的甲醇/乙腈-水溶液80% 100%冲洗，使色谱柱中的强吸附物质冲洗出来。l如色谱柱需长期保管，反相柱可以储存于甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于经脱水处置后的正己烷中，离子交换柱可以储存于含5%甲醇或含0.05%叠氮化纳的水中，并将色谱柱两端密封，以免枯燥，室温保管。4.4 流动相的调整l为满足

19、色谱柱系统适用性要求，实验中有时需求调整流动相组分的比例。在调整流动相组分比例时，以组分比例较低者小于或等于50%相对改动量不超越30%且绝对改动量不超越10%为限，如30%相对改动量的数值超越10%时，那么改动量以10%为限。下面举例阐明。4.4.1 二元流动相系统l例1 两组分比例为50：50 按上述原那么，50%的最大相对该变量为15%，已超越了绝对改动量允许的范围，故该流动相比例调理的范围是10%，即40：60至60:40。l例2 两组分比例为2:98 按上述原那么，2%的最大相对改动量为0.6%，故该流动相比例调理的范围是1.4:98.6至2.6:97.4。4.4.2 三元流动相系统

20、l例3 三组分比例为60:35:5 按上述原那么，可每次调理流动相系统中比例较低的两个组分。l对于35%的组分，其最大相对改动量为10.5%，已超越了绝对该变量允许的范围，故该组分比例调理的范围是10%，即25% 45%，那么流动相系统比例的调理范围是50:45:5至70:25:5。l对于5%的组分，其最大相对改动量为1.5%，该组分比例调理的范围是1.5%，即3.5% 6.5%，那么流动相系统比例的调理范围是58.5:35:6.5至61.5:35:3.5。4.5 杂质检查时色谱参数的设置l在进展杂质检查时，选择适宜的检测灵敏度和设定适宜的积分参数非常重要。国内药质量量规范中，通常制备与杂质限制相当浓度的对照溶液，用以调理检测灵敏度，使对照溶液的主成分色谱峰高达满量程的10% 25%，再进展供试品溶液的测定，以峰面积计算单个杂质量和总杂质量。l目前国内色谱数据处置系统大致有积分仪和色谱任务站两种类型，对于传统的积分仪，由