刺激植物响应蛋白基因Epl1的载体构建及酵母转化

1、刺激植物响应蛋白基因Epn的载体构建及酵母转化作者：遇文靖刘志华王志英古丽吉米拉米吉提黄颖刁桂萍来源：安徽农业科学2014年第19期(1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040;2.黑龙江省森林保护研究所，黑龙江哈尔滨150040)摘要目的1构建刺激植物响应蛋白1中11基因的真核表达载体，筛选多拷贝酵母转化子。方法以深绿木霉(Tricliodcrniaatroviridc)ACCC30153的cdna为模板进行pcr获得Epll基因片段，并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置，获得重组表达载体，并将pPIC9KEpll转入毕赤酵母(Pidiiapastoris)GS115中，并用

2、不同中终浓度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株。结果对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性；在含有终浓度为2mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子GSII51M，经pcr鉴定1株转化子呈阳性。结论1网基因的载体构建及多拷贝酵母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础。关键词深绿木霉ACCC30153;刺激植物响应蛋白；毕赤酵母中图分类号S.763文献标识码A文章编号0517-6611(2014)19-06163-03VectorConsfructionoftheElicitingPlantResponseProteinGeneI中11and

3、YeastTransformationYUWenjing.DIA。Guipingelal(HeilongjiangForestryProtectionInstitute,Harbin.Heilongjiang150040)AbstractObjectiveToconstructeukaryonexpressionvectoroftheelicitingplantresponseproteingeneLp"undStienmulticopyyeasttransformant.MethodBasedonthecDNAfrombiocontrolagentatroviridestrainA

4、CCC30153,theI'pllgenesegmentwasobtainedbyFCR8ndconsiiuctedintovectorpPiC9KioobtainIliereconibiiuinivectorpPICQKEpll.TherecombinanLvectorwaslizn哥巾11alinMP.pashisTrainG4115.andlliemulLicopyyeasLtransformantswasscreenedbyGeneticin418withdifferentfinalconcentration.ResultPCRanddoubledigestdetectioni

5、dentifiedthatpPIC9K底窗obtained;thesevenmulticopyyeasttransformantswereobtainedontheYPDmediumcontainingwithfinalconcentrationof2mg/ml,andonestrainwaspositivebyPCRdetection.ConclusionThevectorconstructionofEpllgeneandscreeningofhighexpressingyeasttransformpriwideUieh屯herikiencyexpressionstrainforsepara

6、tingandpuriftingI'pllandestablishabasisforthefurtherfunctionalresearchofelicitingplantresponseproieiiiEpll.KeywordsIriclioderniaairovirideACCC30153;Elicitingplantresponseprotein;Ppastoris基金项目哈尔滨市科技局青年科技创新人才项目(2013RFQXJ02)资助；中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572014BA08)。作者简介遇文文!(1984-),女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向：森林保护

7、。*通讯作者，副教授，从事森林保护研究。收稿日期2014。605刺激植物响应蛋白Epl1(Elicitingplantresponseprotein1)是一种小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白，属于ceratepl她mln家族。对来源于绿色木霉(T.vircns)刺激植物响应蛋白SMI1和深绿木霉()的刺激植物响应蛋白Epl1研究表明，2个蛋白均对植物无任何毒性，还具有促进植物生长提高植物对病害的免疫作用2。王允等3将棘抱木霉(T,asperellum)T4菌株的hpH4(Epl1)基因转化到毕赤酵母(P.pastoris)中，用重组蛋白Eplt4处理大豆叶片，接种大豆灰斑病(Cercosporid

8、iumsofinum)12h后，感病区域(0.75%)明显低于未用EplT4处理的大豆叶片(5.17%)。DjonoVt/等研究表明，深绿木霉(Tatrovlide)atcc74058菌株的Epl1蛋白能在不同碳源诱导下检测到，而且在立枯丝核菌(Rliizocloniasolani)细胞壁诱导和立枯丝核菌对峙培养条件下均高表达4。Freitas等对来源于绿色木霉刺激植物响应蛋白SM1研究发现，用缺失SM1基因的木霉处理感染炭疽病的玉米叶片，叶片病斑明显多于野生型木霉处理过的感病叶片，证明SM1基因能够诱导植物产生系统抗性(ISR)5。上述研究都证实了刺激植物响应蛋白是木霉诱导抗性机制所需要的。

9、笔者从深绿木霉ACCC30153菌株中分离出一个刺激植物响应蛋白印H基因，将其ORF的cDNA构建到高效毕赤酵母真核表达载体上，并用电转化方法将Epll基因转化到毕赤酵母GS115中，通过遗传霉素筛选获得转基因毕赤酵母菌株，以期为后续大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定良好基础。1材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与载体。深绿木霉（T,airoviride）ACCC30153菌株，由中国农业微生物保藏管理中心提供；毕赤酵母（Rpasioris）GS115菌株、真核表达载体菌株TOPMFpPIC9K和大肠杆菌TOP10菌株，均由哈尔滨工业大学生物实验室提供。1.1.2 主要试剂。内切酶E

10、cqRI,NotI,SacI及T4dna连接酶，购自Promega公司；因p欣DNAPolyme邱目，购自上海生工公司；DNAMarkerDL2000，购自北京泛基诺生物技术公司；酵母基因组dna提取试剂盒，购自天为时代公司；Gencticin（G418）,购自Invitrogen公司；（NH4）2so4,购自Amresco公司。1.2 方法1.2.1 深绿木霉1中11基因高效毕赤酵母真核表达载体构建。在深绿木霉Epl1的ORF序列两端引入EcoRI和Kot酶切位点，进行pcr扩增并回收目的片段。采用EcoRI和NotI双酶切，将目白片段连入pPIC9K载体，获得9K1中11重组质粒，并对重组

11、质粒进行PCR和双酶切检测。根据Epn基因序列和酵母表达载体的多克隆位点设计并合成的引物序列如下：上游引物Ep1y：了ATCGGAATTCGATACGGTCTCCTACGACAC¥（划线部分为EcoRI酶切位点）；下游引物Ep2y：5：CGATGCGGCCGCGAGGCCGCAGTTGCTCACGGC3：（划线为NotI酶切位点）。1.2.2 毕赤酵母转化及其转化子的筛选。采用电转法将重组质粒转化到感受态酵母细胞中，涂于RDBIn（?L''L山梨醇，10g/L琼脂粉，100ml/L10Nextrose,100ml/LI酵母氮源碱，2ml/L500冶iotin,10ml

12、/L100）50含L谷氨酸，L蛋氨酸，L赖氨酸，L亮氨酸和L异亮氨酸的氨基酸）平板，30c培养。挑取单菌落摇菌，然后分别取10科菌液点在含遗传霉素0、0.5、0.75、1.0、1.75和2.0mg/mlYPD平板上培养，挑取含高浓度遗传霉素G418的YPD平板上的转化子，于BMGY培养基中30C振荡培养，提取酵母基因组DNA,并进行PCR检测6。2结果与分析2.1 刺激植物响应蛋白BpU基因真核表达载体的构建对所构建的深绿木霉11Pli基因真核表达载体进行了PCR和双酶切验证。用载体构建引物可从转化子中扩增出大小为400500bp左右的目的片段（图1）,初步验证了目的基因已经于载体pPIC9K

13、链接成功。用EcoRI和NotI进行双酶切同样可获得目的基因条带（图2）,说明Hpll基因已经正确连入载体pPIC9K中。注：M为DNAmarkerDL2000;1-4为PCR产物。图1重组质粒pPIC9KEpll的pcr检测注：M为DNAmarkerDL2000;13为重组载体pPtC9KI'.pll双酶切产物；4为空载体pPIC9K双酶切产物。图2重组质粒pP1C9K卜;pll双酶切检测2.2 高效毕赤酵母转化子的筛选及鉴定通过电转化将重组质粒转入毕赤酵母GS115感受态细胞，用不含组氨酸的RDB基本培养基对转化子进行筛选，以未转化酵母菌株GS115作为对照（图3）。从RDB转化平

14、板上选取50个重组子分别接种到含有不同终浓度遗传霉素G418的YPD培养基上，30c培养5do图4表明，在不添加G418的YPD平板上所有转化子均继续生长；在含有终浓度为0、0.5、0.75和1.0mg/mlG418的YPD平板上少量转化子不生长；在含有终浓度为1.75mg/mlG418的YPD平板上少量转化子生长；而在含有终浓度为2.0mg/llllG418的YPD平板上仅有1株转化子生长。PCR检测结果可从终浓度为2.0mg/mlG418的YPD平板上的转化子中扩增出大小约为869bp的目的片段（包含452bp载体长度），与重组载体pPIC9KEpll的目的条带一致，呈阳性；而对照空载体转

15、化子的PCR条带大小约为452bp,与载体pPIC9K的PCR条带一致（图5）。以上结果表明，已成功获得1株高效表达的毕赤酵母转化菌株6sll5Hpll。注：A为转入重组pPIC9KEpll载体的毕赤酵母；B为未转化酵母菌株GS115。图3毕赤酵母转化3结论与讨论刺激植物响应蛋白Epii是来源于生物防治菌木霉(Tricliodernn$pp.)的诱导植物系统防御响应的小分子疏水蛋白，能够刺激植物生长并提高其免疫能力。由于我们很难从木霉中直接分离大量天然的Epii蛋白，因此Epii重组蛋白的表达是研究的首选方向。目前而言，一种是利用大肠杆菌原核表达载体进行重组表达。大肠杆菌表达的重组蛋白优势在于

16、重组菌株构建容易，重组蛋白产量高，发酵条件即经济又可控制，唯一的缺点是重组蛋白往往形成包涵体，无活性，必须经过复性后才能后续应用。现已成功在大肠杆菌中表达的蛋白及酶类有：哈茨木霉(T.harzitinuni)内切几丁质酶Chit33和(：|懈27,以及深绿木霉(TaTOvMde)P1的内切几丁质酶ech30均在大肠杆菌中成功表达8。另外棘抱木霉(T.aisperellum)T203促进植物生长的氨基环丙烷-竣酸脱氨酶ACCD在大肠杆菌PAIterI-：X1中表达出有活性的酶9,此外还包括李氏木霉(T.recsci)RulC30的除匕马'，血我试等多种具有活性的酶类及蛋白类：io：。另一

17、种是利用巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)高效表达系统进行酵母表达。毕赤酵母表达系统的优势在于可以在廉价的非选择性培养基中生长，具有旺盛的生长力，对发酵过程中产生的乙醇具有耐受性，有较好的发酵基础，非常有利于实现高密度发酵培养。现已经成功在毕赤酵母中表达的具有活性的酶及蛋白类有：绿色木霉(Tvircns)诱导子Smlii及哈茨木霉(T.haTzianuiTi)T34的角质酶Thcuti等口2。有关刺激植物响应蛋白的研究已有报道，但其分子作用机制仍不十分清楚。试验将深绿木霉刺激植物响应蛋白注：A为G4i8终浓度为0mg/ml;B为G4i8终浓度为0.5mg/ml;C为G4i8终浓度为0.75

18、mg/ml;D为G4i8终浓度为i.0mg/ml;E为G4i8终浓度为i.75mg/ml;F为G4i8终浓度为2.0mg/ml。图4多拷贝酵母转化子的筛选注：i为重组菌株GS115Epll基因组DNA的PCR产物；2为MarkerDL2000;3为空载体转化子GS115pPIC9K基因组DNA的PCR产物；4为载体pPIC9K的PCR产物；5为重组质粒pPIC9KEpU的PCR产物对照。图5重组菌株G5I1S的PCR检测Epll基因克隆到分泌性表达载体pPIC9K上，可以使酵母转化子合成的重组Epl1蛋白直接分泌到培养基中，这种设计可大大简化后期重组Epl1的提取工艺，便于得到高活性Epl1产

19、品。将阳性重组质粒pPtC9K1中11转化到毕赤酵母菌株GS115中获得多克隆拷贝的重组基因工程菌株GS115Epll,为Epll基因编码蛋白的大量生产、纯化、蛋白结构和功能研究提供了理论基础。参考文献1 DJONOVTC/S,VARGASWA,KOLOMIETSMV,etal.AproteinaceouselicilorSmlfromiliebeneHcialfmigusIricliodermavirensisrequiredforinducedsystemicresistanceinmaizeJ.PlantPhysiology,2007,145:875-889,2 SEIDLV,MARCH

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21、msofinuminfectionsofsoybeanleavesJ.ApplBiochemBiotechnol,2013,169:722-737.4 DJONOVTC/S,POZOMJ,DANGOTTLJ,etal.Sm1,aProteinaceouselicitorsecre向byHie疝m】i旧)Hi嗯gvirensinducesplant加心块responsesandsystemicresistanceJ.MolPlantMicrobeInteract,2006,19:838853,5 FREITASRS,STEINDORFFAS,RAMADAMH,etal.Cloningandcha

22、racterizationofaproteinelC。'，ni1事ene-fruiTienohudcmndhdt71cmumJ.BiotechnolLett,2014,36:783-7况6胡神.重组chi46在毕赤酵母中的表达及抗病原菌初步研究C.哈尔滨：东北林业大学，2007.7 BOORh,SIMOLINh,cottazS,aLlkkiologousexpressionandsitediiededmutagenesisstudiesoftOWTHdlode门皿同切MUlTl的加，Chit33andChit42,inEsclicriclliucoliJ.ProteinExpressi

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