生物制剂考试重点集录

1、生物制剂课件及考试重点集录ByAugustine药剂学在生物技术药物研发中的任务1、生物技术药物的特点（1）与内源性物质接近，活性高、毒性低；（2）稳定性差，对酶敏感，在消化道内易降解；（3）分子量较大，不易穿透胃肠黏膜；（4）给药途径单一；多以注射给药为主，且必须频繁给药（半衰期短）。2、生物技术药物的发展趋势研制新剂型提高稳定性和生物活性：如缓控释微球、埋植剂、脂质体、原位微球改变给药途径，即研究新的给药系统：如口服、鼻腔、肺部、直肠、透皮、眼部等途径给药提高生物利用度的方法对药物进行化学修饰或制成前体药物；应用吸收促进剂；（主要）使用酶抑制剂；采用离子电渗法皮肤给药。聚乙二醇修饰（PEG

2、修饰）优点：从以下方面延长半衰期作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生；PEG修饰后，分子质量增加，肾小球的滤过减少；产生空间屏障，保护了蛋白质不易被蛋白酶水解提高多肽、蛋白质稳定性的途径定点突变干扰素三个半胱氨酸残基化学修饰PEG修饰缓冲系统添加剂提高溶解度，防止絮凝糖，盐，多元醇冷冻干燥、喷雾干燥拟首关效应（pseudo-firstpasseffect）：鼻上皮的嗅觉区内的细胞色素P450活性甚至高于肝脏，主要由于NADPH-细胞色素P450还原酶含量较高（约高34倍），因此在此会被代谢，产生类似肝脏处的首关作用，称为拟首关效应（pseudo-firstpasseffe

3、ct）。已发现在鼻黏膜中也存在肝脏中的三类可诱导的细胞色素P450同工酶，在鼻上皮中也发现第相结合反应活性。蛋白多肽一级结构的PEST假设Roger等通过文献资料的总结发现，那些在真核细胞内快速分解的蛋白质分子结构通常含有共同的氨基酸序列，此即所谓PEST假设。该假设认为细胞内半衰期短于2小时的蛋白质的氨基酸序列具有一个或一个以上富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的区域。这些富含PEST的区域的两侧通常（但不总是）有数个带正电荷的氨基酸组。所有的PEST区域的共同点是局部高度集中的P、E、S或T，而天冬氨酸较少。PEST序列能够赋予蛋白多肽的快速分解确切机制尚未明确,然

4、而，人们发现短寿的蛋白质的分解需要的Arrhenius激活能（Ea）仅为1015kcal/mol，长寿蛋白的分解所需的Ea接近30kcal/mol。这种不同提示存在2种分解通路，各具不同的速率限定性步骤。PEST区给予蛋白一种快速降解的易感性，从而更易发生胞内蛋白水解。蛋白多肽类药物的代谢动力学特点：（一）显著的首关效应和小分子合成药物相比，蛋白多肽类药物口服具有十分明显的首关效应，由于这类药物在胃酸中的不稳定性及胃肠道和肝脏中普遍存在的蛋白水解酶，使这类药物在到达体循环前大量降解而致生物利用度极低，故绝大部分蛋白多肽类采用胃肠外给药途径，特别是静脉注射给药。（二）消除半衰期短由于这类药物体内

5、迅速降解，导致原形药物的体内存留时间甚短，通常半衰期仅为数分钟或0.51.0小时左右，如胰岛素在人体半衰期不到9分钟，静脉注射后1小时几乎所有胰岛素被清除，组织型纤溶酶原激活物（t-PA）半衰期为26-55分钟，水蛭素（hirudin）为60-100分钟。这种短半衰期迫使它们在临床应用时不得不采用静脉滴注或多次频繁给药，以维持恒定的有效血药水平。（三）表观分布容积通常较小这类药物通常水溶性较强，亲脂性较差，不易透过细胞膜和生理屏障，故多数药物的表观分布容积相当于细胞外液体积。如水蛭素在人体的表观分布容积约为0.28L/kg，相当于细胞外液体积。这类药物在血液中的浓度往往较高，而在脑组织中的浓度

6、较低。（四）非线性动力学性质蛋白多肽类药物的吸收、结合和消除均可能涉及非线性饱和动力学。125I-rhTNFaDa（肿瘤坏死因子）小鼠iv25、67.5和152mg.kg-1的125I-rhTNFaDa后曲线下面积分别为41、180和526mg.L-1.h-1，清除率分别为0.66、0.41和0.31L/h·kg，说明随剂量增加，125I-rhTNFaDa显示非线性药动学。rh-sc-uPA猕猴静脉注射重组单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（rh-sc-uPA）后：t1/2和MRT随剂量增加而延长，药-时曲线下面积明显大于剂量的增加，全身清除率（CLs）随剂量增加而减慢，提示研究剂量范围内可

7、能涉及多个酶反应，为剂量依赖性非线性动力学过程。聚乙二醇修饰1、PEG与蛋白质、多肽分子的非必须基团共价结合，作为一种屏障掩蔽蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免抗体产生，同时可以改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性，减少药物的酶解。2、PEG优点本身免疫原性极低聚醚结构骨架很难被哺乳动物降解PEG与蛋白质偶联，分子质量增大，不易被肾脏代谢反义寡核苷酸反义寡核苷酸类药物是人工合成的并经化学修饰的寡核苷酸片段，通过自身特定序列与靶mRNA结合，在基因水平上干扰治病蛋白的产生。反义药物能与特定的基因杂交，在基因水平上干扰致病蛋白的产生，即干扰遗传信息由核酸向蛋白质的传递。层析的原理层析技术是一组相

8、关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。层析的分类按固定相基质的形式：柱层析、纸层析和薄层层析根据流动相的形式：液相层析、气相层析根据原理：离子交换、亲和层析、分配层析、吸附层析、疏水层析、凝胶过滤层析前蛋白质处理主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。亲和层析：

9、依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。优点：1.纯化过程简单、迅速2.分离效率高3.实验条件温和缺点：1.针对某一分离对象就

10、需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件2.配基的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤基本原理：生物专一吸附(bioselectiveadsorption)1.具有专一性亲和力的生物分子对：酶底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅酶因子）特异性抗原抗体激素受体DNA互补的DNA或RNA凝集素和糖蛋白2.基本过程：固相化(Immobilise)配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。载体的选择应具备的特性：1.有丰富的可供活化的化学基团，并在温和条件下能与配基共价结合。2.惰性的，非专一性吸

11、附无或足够小。3.多孔网状结构。4.良好的机械性能，具有好的液体流动性。5.有较好的物理和化学稳定性。可供选择的载体：琼脂糖商品名：Sepharose型号：2B，4B，6B型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%特点：亲水性强，理化性质稳定，网孔大，非专一性吸附小，只能以湿态保存，经不起有机溶剂处理。聚丙烯酰胺凝胶商品名：Bio-Gelp型号：P-100至-300型号含义：排阻限度，X1000相当于允许进入凝胶内部蛋白质的最大分子量特点：干胶，理化性质稳定,抗微生物侵袭能力较大,适用于配基和亲和物之间亲和力比较弱的系统,应避免在pH2-11以外的溶液中长期使用.葡聚糖凝胶商品名:Sephadex

12、型号:G-100,150,200型号含义:每克干凝胶吸水量X10特点:理化性质稳定,耐热、耐碱、不耐酸,网孔小配基的选择应具备的特性：1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性2.必须具备能被修饰的功能基团以酶和底物为例来讨论配基与欲纯化的生物物质的亲和性:KLE+LEL在亲和层析中,定义分配系数Kd为:Kd=结合酶/游离酶=EL/E0-EL=L0/KL常数KL越小,配基对大分子的亲和力越高,在亲和层析中就越有价值。Keq一般为104108dm3/mol，太大洗脱回收困难，太小则难于有效吸附目标物质。配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基大分子物质：酶、抗体纯化酶的配基:底物、酶活性中心、抑制剂、

13、辅酶、辅基等；纯化抗原抗体的配基：互为配基纯化核酸的配基：DNA和RNA，蛋白质和mRNA配基的固相化固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于水的固相基质上制成固相化吸附剂过程：活化、接臂"插入剂"或"手臂"使小分子配基适当的离开载体骨架,克服载体空间位阻的影响亲和层析分离（一）装柱和平衡（二）上样、亲和吸附操作包括进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。洗脱方法有：特异性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过竞争性结合作用，脱附目标产物。特点：条件温和，有利于保护目标产物的活性和提高纯度。非特异性洗脱：通过调节洗脱液的p

14、H值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和作用，使之脱附。是较多采用的洗脱方法。上样：层析柱较短，通常10cm左右样品液的浓度不宜过高上样时流速比较慢样品缓冲液中有一定的的离子强度上样时选择适当较低的温度特异性洗脱：优点：特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。可避免蛋白质变性缺点：较常的时间、较大的洗脱条件。改善方法：选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度非特异性洗脱：与配体亲和力较小连续大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。配体结合较强时适当的pH、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性与配体结合非常牢固时使用

15、较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性吸附剂的再生和保存：再生：用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡，严重的不可逆吸附时，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶保存：加入0.01%的叠氮化钠，4°C下保存亲和膜一、原理利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜亲和层析二、应用及特点应用：如单克隆抗体的纯化、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的纯化等。特点优点：传质阻力小，达到吸附平衡时间短，配基利用率高；压降小，流速高，设备体积小，配基用量低。缺点：理论板数

16、很低，吸附和清洗效率低；膜的污染会使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降。亲和错流过滤一、原理和操作原理：ACFF又称亲和过滤或亲和超滤，是生物亲和作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术，是亲和层析的另一种变形。操作：一般包括进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。亲和层析用于蛋白质分离的实例免疫亲和层析凝集素和糖蛋白亲和层析含有辅酶的酶类的亲和层析酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析肝素为配体的亲和层析染料配体亲和层析金属螯合层析1、免疫亲和层析小鼠血清不同亚型IgG的分离1m1的A蛋白SepharoseCL-4B柱用1.5mol/L的甘氨酸-NaOH，pH8.9的缓冲液(内含3molLNa

17、Cl)平衡5m1小鼠血清同等体积的平衡液稀释后上柱洗去不吸附的蛋白质用不同pH的0.1mol/L柠檬酸洗脱2、凝集素和糖蛋白的亲和层析分离凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集素分离纯化各种糖蛋白。.用含有半乳糖的天然多糖-琼脂糖的交联产物分离天花粉凝集素用10mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0，含0.15mol/LNaCl)平衡酸处理的Sepharose6B(AT-6B)天花粉的丙酮粉制剂用平衡液抽提后，上AT-6B柱洗去不吸附的杂蛋白用0.2mo

18、l/L的半乳糖溶液洗脱花粉凝集素3、含有辅酶的酶类的亲和层析很多的酶中都含有不同类型的辅酶，最为常见的是氧化还原酶和脱氢酶含有NAD。为此用固定化的NAD可以分离不同类型的氧还酶和脱氢酶，或激酶4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析一些酶及其抑制剂间存在着非常专一的相互作用。一些酶的抑制剂被固定化以后，就可用于一些酶的分离纯化。一些固定化的酶也被应用于蛋白类型的抑制剂的分离。为了避免位阻现象，在酶类的小分子抑制剂固定化时，常要插入一些不同长度的“手臂”，如插入8-9个原子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化部分纯化的牛卵巢胰蛋白酶抑制剂溶于2mlpH4.0的乙酸缓冲液流经用同一缓冲液平衡的固定化胰蛋白酶柱平衡液

19、可洗去杂蛋白用0.1molL的HCl，pH约1.2的溶液(内含0.5molLNaCl和10mmol/LCaCl2)洗脱胰蛋白酶抑制剂金属螯合层析基于蛋白质的组氨酸咪唑基和半胱氨酸巯基能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物而进行分离的。影响离子交换选择性的因素:1、水合离子半径：半径越小，亲和力越大；2、离子化合价：高价离子易于被吸附；3、溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；4、离子强度：越低越好；5、有机溶剂：不利于吸附；6、交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；7、树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华

20、力等辅助力；凝胶层析的应用脱盐分离提纯测定高分子物质的分子量高分子溶液的浓缩蛋白质复性研究SDS-PAGE测定蛋白质分子量原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原Pr，消除了不同Pr荷电差异。加入SDS，改变了Pr的构象，SDS-Pr为长椭圆棒，各种短轴约为1.8nm。疏水

21、层析疏水作用层析（HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。最常用：正辛基-交联琼脂糖凝胶，更强的疏水作用，一些疏水性较强的蛋白质被吸附后不易解析苯基-交联琼脂糖凝胶，应用于疏水性较强的蛋白质基本操作：平衡Equilibration上样Sampleapplication洗杂Washing洗脱Elution1、层析柱的选择柱床高度通常为515cm对一个优化好的分离方案进行规模放大时，可保持柱高不变，增加柱的直径柱子（内径为1.65.0cm）适合进行HIC层析。2、缓冲液的选择往平衡的缓冲液