微生物遗传育种的研究进展

1、 微生物遗传育种的研究进展摘要: 微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造去除不良性状，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。本文对微生物遗传育种技术，包括自然育种、诱变育种、代谢控制育种、基因工程育种等进行了介绍，并对育种技术的发展做了展望。关键词： 微生物；自然育种；诱变育种；代谢控制育种；基因工程育种微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物朝人们所希望的方向加以引导或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状 ，获得所需要的高产优质和低能的菌种。为达到这一目的必须改变微生物的遗传性能1。现代生物技术特别是发酵工程技术的最终产品，一般都是经过工

2、业微生物这一 “工厂” 生产得到的，已经取得了举世瞩目的经济效益和社会效益。据统计，1979 年世界工业酶产量为 53000 吨，1985 年酶制剂的总产量为10万吨，作为商品出售的酶制剂有200余种，到1990 年总产值约为10 亿美。就生物技术而言，1991年美国、德国、法国和英国的总销售额依次为 400，200，150，6.4 亿美元。对工业微生物菌种的优化选育是提高产量和质量的一条有效途径。以突变和筛选为中心的传统育种技术在工业微生物发展到现在规模的过程中始终起着重要作用。70 年代以来，重组DNA技术和原生质体融合技术开始用于菌种选育。各种外源基因在原核生物、真核细胞的克隆和表达研究

3、取得了重大成果，使工业微生物育种技术进入了真正意义的分子水平育种时代2。1 菌种选育的具体目标 ( 1) 提高产量。生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵过程首位的目标。 ( 2) 提高产物的纯度。减少副产物; 提高有效组分;减少色素等杂质。 ( 3) 改变菌种性状。改善发酵过程, 包括: 改变和扩大菌种所利用的原料结构; 改善菌种生长速度; 提高斜面孢子化程度; 改善菌丝体形状, 采用菌球菌丝体发酵;少用消泡剂或使菌种耐合成消泡剂; 改善对氧的摄取条件, 降低需氧量及能耗; 耐不良环境: 抗噬菌体的侵染,耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的代谢产物; 改善细胞透性, 提高产物的分泌能力等。 ( 4

4、) 菌种的遗传性状。特别是生产性状稳定。( 5) 改变生物合成途径。以获得新产品。2 获取优良菌种的有效途径广义上说, 菌种改良可描述为采用任何科学技术手段( 物理、化学、生物学、工程学方法以及它们的各种组合)处理微生物菌种, 从中分离得到能显示所要求表型的变异菌种。菌种改良的基本途径: 突变和选择; 基因重组( 遗传重组) 和基因工程( 遗传工程) 。2.1 自然选育 不经人工处理,利用微生物在一定条件下可产生自发突变的原理 , 通过分离筛选排除衰退菌落 , 从中选择维持原有生产水平的菌株的方法 , 称为自然随机选育。自然突变由 2 种原因引起 : 多因素低剂量效应和互变异构效应。自然突变可

5、能会产生 2 种不同的结果 , 一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降 另一种是对生产有益的突变。利用自发突变可以分离高生产能力的菌种再用于生产,同时也可以利用自发突变而出现的菌种性状的变化 ，去选育优良的菌株。 随着富集筛选技术的不断完善和改进，自然育种技术的效率有所提高，如含有突变基因 naE、mutD、 mutT、mutM、mutH、mutI 等的大肠杆菌突变率相对较高。酒精发酵是最早把微生物遗传学原理应用于微生物育种实践而提高发酵产物水平的一个成功实例3。自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种， 防止菌种退化，提高产量的目的，但发生自然突变的几率特别低，一般为 10-610

6、-10/BP。这样低的突变率导致自然选育耗时长，工作量大，影响了育种工作效率，在这种情况下，出现了诱变育种技术，因此 , 在生产实践中,自然选育的主要目的是用来纯化、复壮和稳定菌种3。2.2 诱变育种凡能诱发生物基因突变 , 并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质 , 称为诱变剂。主要包括物理诱变剂和化学诱变剂 , 现在还有生物诱变剂。诱变剂是自 1927 年用 X 射线诱发果蝇遗传性状变异而引起科学工作者注意的 , 此后陆续发现了许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用 。近年来 , 随着基因工程技术的不断发展 , 蛋白质工程中点突变的重要技术 ，基因诱变在菌种选育中得以应

7、用，使生物诱变剂也受到很大重视 , 并取得了可喜发展 。 现根据诱变剂的不同 ，介绍诱变育种方法的研究进展 。2.2.1物理诱变 物理诱变通常使用物理辐射中的各种射线 , 包括紫外线 、X 射线 、射线 、射线 、射线 、快中子、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙射线等。 近年来, 随着重离子束的获得, 离子辐照诱变育种也成为诱变育种的 1 种新方法4 。2.2.2化学诱变 使用化学物质处理微生物使其性状发生改变的方法称为化学诱变方法 。 化学诱变的作用机制与物理诱变剂有很大区别 , 其作用机制都是与 DNA起化学作用。化学诱变剂往往具有专一性 , 它们对基因的某部位发生作用，对其余部位则无

8、影响 ，突变主要为基因突变 ，并且主要是碱基的改变，其中尤以转换为多数。各种具有诱变作用的化学物质和碱基接触起化学反应 ，通过 DNA 的复制使碱基发生改变而起到诱变作用。通常使用的化学诱变剂包括4大类：烷化剂 、碱基类似物 、移码突变剂以及其他种类等5 。2.2.3其它诱变方法 2.2.3.1离子注入生物体诱变离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明。已经证实离子注入诱变, 可以获得高突变率, 扩大突变谱,为筛选优良的突变型菌株提供广阔的空间，同时, 离子束也可以作为介质进行外源目的基因转移和转导。目前, 利用离子注入已经获得转基因植物; 转含有耐辐射异常球菌基因组 D N A 的

9、E1 co l i 菌株。我国离子应用研究已有17项成果, 其中 7 种高产、优质、抗病虫农作物新品种和6个微生物新菌株已经推广应用于农业和工 业生产中, 累计创效益17 亿元以上。因此离子注入法在作物和微生物诱变育种方面受到广泛关注6。2.2.3.2航天诱变航天诱变是近些年发展迅速的一种新型的微生物诱变育种技术，太空环境的特有条件有可能引起生物体发生遗传性变异，这些特有条件包括超高真空、超洁净、微重力、强辐射，并且与地面条件有很大差异，另外，还有强烈的紫外线照射等。太空环境是太空科学研究的一个特殊的重要领域。突变频率高、突变谱广、变异幅度大是空间变异最大的特点，并且突变后的变异性状稳定，从而

10、使育种周期缩短、生物安全性提高。1957 -1988年已经进行空间生命科学研究的卫星有109个，几乎每次都搭载微生物材料。近些年微生物航天诱变的研究进展迅速，已涉及微生物形态学、细胞学、生理生化和分子生物学等诸多领域7。2.2.3.3激光的概念及诱变机理激光诱变育种是20世纪70年代兴起的一种诱变技术, 国内外利用激光诱变微生物已做了不少研究工作。激光是一种量子流, 光微粒。依据其波长不同可分为:260380nm的紫外激光, 如N2激光;440700nm的可见光激光, 如He-Ne激光;900447.2×103nm的红外激光, 如CO2激光。激光辐射通过产生热效应、压力效应、光效应和

11、电磁场效应及其综合作用对生物体进行作用, 直接或间接影响生物有机体, 引起DNA或RNA改变, 导致酶激活或钝化,引起细胞分裂和细胞代谢活动改变。其中, 人们普遍认为起主要作用的是光效应和电磁场效应8。2.3代谢控制育种代谢控制育种兴起于20世纪50年代末， 以 1957年谷氨酸代谢控制发酵成功为标志，并促使发酵工业进入代谢控制发酵时期。近年来代谢工程取得了迅猛发展，尤其是基因组学、 应用分子生物学和分析技术的发展，使得导入定向改造的基因及随后的在细胞水平上分析导入外源基因后的结果成为可能。快速代谢控制育种的活力在于以诱变育种为基础， 获得各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使

12、有用产物选择性地大量生成积累，打破了微生物调节这一障碍。从微生物育种史中可以看出，经典的诱变育种是最主要的育种手段，也是最基础的手段，但它具有一定盲目性，代谢控制育种的崛起标志着育种发展到理性阶段，作为微生物育种最为活跃的领域而得到广泛的应用，它与杂交育种结合在一起，反映了当代微生物育种的主要趋势。代谢育种在工业上应用非常广泛。代谢控制育种提供了大量工业发酵生产菌种，使得了氨基酸、核苷酸、抗生素等次级代谢产物产量成倍地提高， 大大促进了相关产业的发展9。2.4基因工程育种基因工程育种是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的重要技术而发展起来的一门新兴应用科学。基因工程技术的全

13、部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。近年来出现的运用基因工程进行定向育种的新技术主要有如下几种。2.4.1 基因的定点突变 定点突变(site-specific mutagenesis或site-directedmutagenesis)是指在目的DNA片断(例如：一个基因)的指定位点引入特定的碱基对的技术，其包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以PCR为基础的定点突变。基于PCR的定点突变技术由于其突变效率高、操作简单、耗时短、成本低廉等优点而倍受关注。因此，近十年来，定点突变技术获得了长足的发展，并且在此

14、基础上又发展了很多新技术。例如：重叠延伸PCR法(Overlap Extension PCR 简称EO-PCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重叠延伸PCR(One-stepOverlap Extension PCR，简称OOE-PCR)、单管大引物PCR(Single-tube Megaprimer PCR)、快速定点诱变法、多位点环状诱变法和TAMS(Targeted Amplification ofMutant Strand)定点诱变技术。在这些技术中，单管大引物PCR和TAMS定点诱变技术最为简单和适用，并得到广泛的应用10。2.4.2 易错PCRDNA聚合酶在

15、进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错PCR(Error-prone PCR，简称EP-PCR)。此方法其操作过程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反应体系中，利用Mn2+替代天然的辅助因子Mg2+，使Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，通常约为0.1%。另外，还可以在该反应体系中加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率最大提高至20%。从易错PCR的操作过程可以看

16、到，此法与传统诱变育种技术之间的最大差别就在于，前者是基因水平上的随机突变操作，而后者则是细胞水平上的随机诱变技术11。2.4.3 DAN重排DNA重排(DNA shuffling)技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，由Stemmer于1993年首先提出。DNA重排的基本原理是首先将同源基因(单一基因的突变体或基因家族)切成随机大小的DAN片段，然后进行PCR重聚。那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板，经过多次PCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因12。2.4.4 基因组重排 基因组重排(genome shuffling)技术是受D

17、NA重排的启发，于21世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。首先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选表型得到较大改进的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术(即将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生)，即递归原生质体融合(recursive protoplast fusion)的方法。与DNA重排技术相比，该法的最大特点是不必了解菌株的遗传背景，在细胞水平上

18、即可进行定向进化13。3展望随着分子生物学等各项新技术的快速发展，微生物分子育种领域已经得到了快速进展，人类已经可以按照自己意愿对微生物进行改造，使其能更好地为人类造福。工业微生物遗传育种在基因工程、细胞工程、蛋白质工程和酶工程等现代生物技术的基础上，创造出了许多设计巧妙、科技含量高、目的性强、劳动强度低、效果显著的育种方法，为人类获得稳定性好、高产、新种类的工程菌株，开发新药和工业产品，提高产品的产量和质量都提供了有力的保障。相信微生物遗传育种学将得到更加全面发展，将为生产实践提供更多的优良菌株，在各领域发挥更加重要的作用14。参考文献1 施巧琴, 吴松刚.工业微生物育种学 M . 第 2

19、版. 北京: 科学出版社, 2003.2 戴四法，黎观红，吴石金. 现代工业微生物育种技术研究进展J. 微生物学杂志 2000，20(2) ：4850.3 张彭湃.微生物菌种选育技术的发展与研究进展J.生物学教学，2005，30(9) ：35.4 申玉香 , 汪志君 , 方维明 1 紫外诱变及苯黄隆抗性处理选育低双乙酰啤酒酵母 J . 酿酒科技 , 2007, ( 5 ) :39 - 41。5 程 明，崔承彬，李长伟，田从魁，杜智敏.化学诱变技术在微生物育种研究中的应用J.Journal of International Pharmaceutical Research .2009,36(6),412-417.6 宫春波，离子注入微生物诱变育种研究进展J，生物技术，2003,