生物技术制药第二版总结

1、生物技术制药第一章 绪论要求：1、熟悉生物技术制药的基本概念2、熟悉生物技术药物的特点3、了解生物技术领域及生物制药产业的发展现状1、生物技术制药:就是利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程技术、等来研究和开发药物，用来诊断、治疗和预防疾病的发生。2、生物技术药物（biopharmaceutics）是利用生物体、生物组织、细胞或其他组分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的基本原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。特性 药理学特性1、药理活性高2、治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠3、

2、毒副作用小，营养价值高4、生理副作用常有发生理化与生物学特性1、生物材料中含量低，杂质多，分离提取工艺复杂2、生物活性物质结构复杂、稳定性差3、生物材料易染菌、腐败4、生物技术药物制剂有特殊要求3、传统生物技术的技术特征是酿造技术4、近代生物技术的技术特点是微生物发酵技术5、现代生物技术的技术特征是以基因工程为首要标志6、生物医药产业的特点：生物医药产业投资大、风险高、周期长。收益高第二章 基因工程制药基因工程的概念。基因工程的原理和技术。基因工程制药6大步骤掌握：基因工程、载体的概念；基因工程的原理；常用载体和表达系统的类型。2、熟悉：基因工程制药的基本流程；目的基因制备、链接的方法；重组基

3、因导入宿主的方法；重组子筛选和鉴定的方法；质粒不稳定的原因、分析方法和提高稳定性的方法。3、了解：生物技术药物的下游分离和纯化技术。复习1. 基因工程药物制备的一般过程。2. 基因工程常用的载体有哪些？各有什么特点？3. 获得目的基因常用的四种方法是（ ）、 （ ）、 （ ）和（ ）。ü 1、基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代ü 2、原理：1、提高外源基因的剂量分子遗传学原理2、筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，

4、如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等分子生物学原理 3、修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、mRNA非编码区、密码子等分子生物学原理 4、基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产生化工程学原理 3、理论方面的三个重要的发现1、生物遗传物质DNA的发现 2、DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立 3、遗传信息传递方式的确立4、技术上三个重要成果1、基因工程的工具酶 DNA连接酶 限制性内切酶 逆转录酶思考：被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。逆转录酶是以RNA为模板指导三磷

5、酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶特点：逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性： 以单链RNA为模板， 催化合成cDNA单链 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。2.基因工程载体3.基因的体外重组技术5、重组子转化的成功标志着基因工程的诞生。 6、基因工程的操作流程1、分：分离目的基因2、切：对目的基因和载体适当切割3、接：目的基因与载体连接4、转：重组DNA转入受体细胞5、筛：筛选出含有重组体的受体细胞6、表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物l 7、 基因工程制药的基本过程获得目的基因

6、构建运输载体 组建表达系统 表达系统培养 产物分离纯化l 8、目的基因的获得（一）从基因组中直接分离目的基因 1、密度梯度离心法2、单链酶法3、分子杂交法4、酶切法直接分离目的基因（二）PCR直接扩增目的基因 聚合酶链式反应 高温变性 低温退火 适温延伸（三）反转录法合成目的基因 构建cDNA文库 调取基因（四）化学合成目的基因 从反应机理上分为：1、磷酸二酯法2、磷酸三酯法3、亚磷酸三酯法4、自动化合成法9、运载体的构建ü 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。ü 常用载体来源分类：1、质粒载体 质粒（plasmid）:是附加到细胞

7、中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子。人工质粒载体必须包括三部分：一个DNA复制起始区，两个遗传标记基因和一些限制性内切酶位点。 2、噬菌体载体 噬菌体：（1）噬菌体宿主为E.coli 2）有溶原、溶菌两种生活方式： 溶原方式：DNA整合到宿主DNA进行复制； 溶菌方式：可释放出DNA进行壳蛋白包装增殖。 优点 1）对外源基因的容量较大（可达20多个kb）（2）重组体DNA可在体外包裹成噬菌体颗粒，具有更高的侵染宿主能力，要比质粒转化细菌的效率高得多，所以噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。（3）宿主范围窄，更安全（4）可利用包装限制性（对DNA分子大小

8、的限制）对重组子分子进行正选择，利于重组子的筛选3、病毒载体4、人工染色体载体用途分类：1、克隆载体 能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。常见:质粒、噬菌体2、 表达载体 使插入的外源DNA序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。具有复制子，筛选标记，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子，起始密码子和核糖体结合位点，转录终止子结构 3、 穿梭载体 这类载体中含有来源不同的复制子结构，既具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,故能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体

9、直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达10、基因表达载体的构建1、用一定的_限制酶_切割质粒，使其出现一个切口，露出_黏性末端2. 用_同一种限制酶_切断目的基因，使其产生_相同的黏性末端3. .将切下的目的基因片段插入质粒的_切口_处，再加入适量DNA连接酶_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 11、 重组工程菌的构建、筛选与鉴定l 1、目的基因与载体DNA的链接1）黏性末端连接法2）钝性末端连接法3）钝性末端连接人工合成的接头4）同聚物末端连接法l 2、将重组体导入宿主细胞（1）转化2）转导3）转染l 3、重组子的筛选与鉴定（1）抗药性检测筛选法（2）显色检测 异丙基硫代半乳糖苷

10、（IPTG）可诱导LacZ基因片段编码-半乳糖苷酶氨基端片段,与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补，又称互补。当培养基中有IPTG时，使含此质粒的菌在X-gal培养基上形成蓝色菌落。（3）限制酶切图谱检测（4）PCR扩增检测（5）原位杂交检测（6）外源蛋白质功能检测12、表达系统的构建与基因表达1、最佳的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易分离纯化。2、宿主细胞常用两大类： 原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。ü 质粒的不稳定性原因1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质

11、粒的子代菌的现象。（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失而导致工程菌性能的改变。ü 质粒稳定性的分析方法1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数A；（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数B；（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出质粒的稳定性。提高质粒稳定性的方法1）分阶段培养法（2）在培养基中加入抗生素，形成选择性压力（3）通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施第三章 动物细胞工程制药1、动物细胞培养技术 培养方法和

12、培养条件 细胞的冻存与复苏2、动物细胞融合技术 动物细胞融合的过程和方法3、单克隆抗体技术 单克隆抗体的概念；单抗制备的原理和方法4、 动物细胞的大规模培养1、培养的方法1、原代培养2、传代培养2、营养条件 1、动物细胞的培养基的种类和组成 ：培养基的基本要求 促生长因子 激素 营养成分渗透压pH 无毒、无污染 培养基的基本要求 1）营养成分：  氨基酸 单糖 维生素 无机离子与微量元素2）促生长因子及激素各种激素、生长因子的功能：维持细胞的功能保持细胞的状态（分化或未分化） 3） 渗透压 4）pH大多数细胞适宜 pH为7.27.4，培养基应具一定的缓冲能力 5）无毒、无污

13、染 3、血清的主要成分和作用 主要成分 ：血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等 主要作用：  1、 提供基本营养物质 2、提供激素和各种生长因子 3、提供结合蛋白4、对培养中的细胞起到某些保护作用4、动物细胞合成培养基种类：1、MEM ： 仅含12 种必需氨基酸、谷氨酰胺，8 种维生素及必要的无机盐，由于成分简单，易于添加某种特殊成分适于某些特殊细胞培养。2、DMEM： 在 MEM 培养基的基础上研制的。 与 MEM 比较增加了各种成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L） 高糖型有利于

14、细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难低肿瘤细胞。3、IMDM： 含有 42 种成分，与 DMEM 比较增加了许多非必须氨基酸及一些维生素，增加了羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），葡萄糖含量为高糖型。 适合细胞密度较低、细胞生长困难的情况，如细胞融合之后杂交细胞的筛选培养，DNA 转染后转化细胞的筛选培养。   4、 RPMI1640： 其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。是目前应用最为广泛的培养基之一。5、动物细胞的种质保存 细胞的冻存与复苏 冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。 1. 细胞冻存 2

15、.细胞复苏 ：在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）ü 冻存和复苏的原则：慢冻快融 原因： 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞损伤甚至死亡。 甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-50度冷冻速率：慢冻（？）复苏速率：快融（？）冷冻保护剂：515甘油或二甲基亚砜（D

16、MSO） （？）冷冻保存温度：196 （液氮）l 为什么要加冷冻保护剂对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉等。 6、动物细胞融合技术基本过程 1）细胞准备，分贴壁和悬浮细胞两种。前者可直接将两亲本细胞混合培养，后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。（2）细胞融

17、合，加促融因子于将行融合的细胞之中，诱导融合。（3）杂种细胞选择，利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，而让杂种细胞存活。（4）杂种细胞克隆，对选出的杂种细胞进行克隆（选择与纯化），经过培养，就能获得所需要的无性繁殖系。促融剂：1、病毒诱导：某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，2、PEG诱导3、物理学方法电诱导细胞融合7、单克隆抗体（monoclonal Antibody，McAb）通过B细胞杂交瘤技术， 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。单克隆抗体的大量制备：（1）体外培养法：（2

18、）动物体内诱生法：单克隆抗体的特性：1、高度均一性：纯度很高的均一性抗体 2、高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 3、大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖传代8、动物细胞大规模培养：悬浮培养、贴壁培养、假悬浮培养（微载体培养、微囊化培养）等第四章 植物细胞工程制药基本概念：植物细胞工程；植物细胞的全能性；细胞融合植物细胞培养技术：培养材料、培养方法；植物细胞培养的影响因素植物原生质体培养技术：原生质体获得、纯化和培养的方法植物细胞融合技术：细胞融合的过程、方法和杂种细胞的筛选1、植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离休条件下进

19、行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、制造新品种，加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术。2、植物细胞的全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都有直接发育成一个完整植株的能力。3、全能性最早在植物细胞中发现。4、植物细胞培养技术：植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培养主要用于形成组织和再生成植株植物细胞培养主要生成次生代谢产物 基本技术：1、植物材料的准备2、培养基制备3、培养方法的选择5、植物细胞的获得（1）外植体直接分离法:机械切割、组织破碎直接从植物外植体中分离外植体：如根、茎、叶、花、花

20、粉等（2）原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生获得植物细胞。3）愈伤组织分离法：从愈伤组织制备小细胞团或单细胞悬液愈伤组织：在一定条件下，从外植体的切口部位长出的脱分化的薄壁细胞团。6、常用培养基MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，KM-8p主要用于原生质体培养，其特点是有机成分较复杂White的无机盐含量较低，适于生根培养7、生长素：用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化8、组织培养中常用的有：吲哚乙酸 (IAA)：第一个被发现和人工合成的的激素二氯苯氧乙酸 (2,4-D)；萘乙酸 (NAA)；吲

21、哚-3-丁酸 (IBA)；萘氧乙酸 (NOA)；对氯苯氧乙酸 (P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长培养影响9、植物细胞生长代谢特点：（1）需大量无机盐（2）需多种维生素和植物生长激素（3）无机氮源，硝酸盐、铵盐为主（4）以蔗糖为碳源10、无机元素的功能： 参与调节胞内外的pH、渗透压、氧化还原电位等 参与多种酶的辅酶和激活因子的合成 P是DNA、RNA、ATP等生物活性物质的组成部分，也影响多种次级代谢产物的合成11、植物生长物质 1、植物生长调节剂 2、植物生长激素：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯。借生长激素调控生长分化，以及细胞培养

22、时，获得最大量的次生代谢产物12、植物培养物的生长取决于生长素和分裂素的比例：高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂 ，低浓度生长素和高浓度分裂素刺激细胞生长13、诱导子：刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的物质, 可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力,引起代谢通量和反应速率的改变, 提高次生代谢产物的产量。 非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等,稀土及重金属盐类生物诱导子：微生物类，如真菌孢子，菌丝体、 真菌培养物滤液等14、碳源：细胞培养过程中不进行光合作用，需提供糖做碳源（2-5%）。15、维生素：肌醇（胚状体和芽的生长），B族维生素（B1根的生长）16、有机物：甘氨酸或水解络蛋白，酵母提

23、取物等。17、植物细胞的培养方法1.单细胞的培养：（1）看护培养法：2）微室培养法 3）平板培养法 4）条件培养法条件培养基指培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基2. 单倍体细胞的培养（花药培养）指将植物单倍体细胞培养成单倍体植株的过程。一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象3.愈伤组织培养4.毛状根诱导和培养 毛状根具有如下特点：激素自养，不必加外源激素；次级代谢产物含量高且稳定；增殖速度快。18、植物原生质体培养技术除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体。1、原生质体材料来源： 1、植物叶片取材容易比较容易用酶解法分离2、 植物根尖组织可由各种植物的种子萌发后取

24、得3、 植物花粉产生单倍体原生质体4、愈伤组织、悬浮培养的细胞细胞壁容易解离2、分离1、机械法先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球形，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可以释放出完整的原生质体。2、酶解法细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等3、纯化 1） 离心沉淀法原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于底部。2）漂浮法原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。3）界面法原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度，形成不连续密度梯度，通过离心使

25、原生质体和破损细胞处于不同液相中。4、培养1）液体浅层培养 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。2） 液体固体双层培养 在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。3）固体平板培养琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约30融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。4）琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。 培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透

26、压以利于其进一步的生长和发育。19、植物细胞融合技术细胞融合(cell fusion)概念：又称细胞杂交：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。1、融合的程序：1、原生质体分离的分离、纯化2、融合方法选择3、杂种细胞的筛选4、愈伤组织形成器官分化植株再生5、杂种植物的鉴定2、融合的方法：1、盐类融合法2、高Ca2+和高pH值融合3、 聚乙二醇（PEG）融合法4、 PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法5、 电融合法3、原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同

27、核体。20、杂种细胞的选择和鉴定1） 融合体的类型自体融合：发生在亲本原生质体自身异体融合：1、谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体2、部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少量染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株3、异胞质体细胞杂种：胞质是双亲的，一亲本细胞核被排斥4、嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物2、选择的方法1、互补选择法(遗传或抗性)2、可见标记法3、生长特性选择法4、物理特性选择法5、其他方法6、荧光染料法：异硫氰酸荧光素（F

28、ITC）和异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出绿色和红色3）细胞杂种的鉴定：杂种植物形态特征、特性鉴定杂种植物的核型分析同工酶分析分子标记鉴定第五章 发酵工程制药发酵工程的概念2、菌种的获得与选育3、发酵的基本过程和工艺控制发酵工程的概念 菌种及其选育、自然育种、诱变育种、原生质体融合、基因工程育种 发酵的基本过程、发酵的工艺控制、发酵产物的提取1、发酵工程(fermentation engineering)： 微生物工程利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术，是生物技术的基础工程。2、生产菌种的选育：1、自然选育：自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9 2、自发突变与

29、定向育种 3、诱变育种：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。物理诱变剂：紫外线 化学诱变剂 使用最多、最有效的是烷化剂。 4、原生质体融合 5、DNA重组3、发酵产物提取的方法：1、吸附法2、沉淀法 3、溶剂萃取法4、离子交换法4、菌种保藏1、斜面低温法：短期保存2、石蜡油封存法：中期保存3、沙土管：产孢子和芽孢的4、麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用5、甘油悬液法：基因工程菌6、冻干保藏 ：最广泛使用的方法。大部分菌种可以在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输7、液氮法：最为有效，保藏15年以上，8、宿主保藏法：活细胞内寄生的

30、微生物5、 发酵过程的影响因素及控制一）菌体浓度的影响及控制 菌体浓度反应菌体细胞数和胜利特性结构越复杂的生物，分裂所需时间越长发酵中菌液需控制在合理浓度中，过高，营养消耗过快，有毒废物积累，改变菌体代谢途径，影响溶氧；过低，产率下降二） 培养基的影响及其控制1.碳源：葡萄糖速效碳源，生长菌体，淀粉等迟效碳源，发酵次级代谢产物2.氮源：氨基酸，玉米浆等速效氮源，生长菌体，豆饼等迟效氮源，发酵次级代谢产物氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。3.磷酸盐和微量元素：微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根抗生素对磷酸盐

31、浓度很敏感，生长浓度：0.32-300 mol/L，生产浓度：1.0 mol/L4.补料：补基质和前体，中途补料，丰富培养基，避免菌体过早衰老，控制PH，改善通气等通常在生长旺盛期后期，发酵液泡沫位下降，这时耗氧大，溶氧水平接近临界点，补料少量多次6、影响发酵温度变化的因素(1)生物热：微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。(2)搅拌热(3)蒸发热：通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热(4)辐射热：发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。7、.温度的选择与控制(1)最适温度的选择：嗜冷菌适应于026生长，嗜温菌适应于1543 生长，嗜热菌适应

32、于3765 生长，嗜高温菌适应于65 以上生长最适生长温度，最适生产（发酵）温度发酵前期 要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度中期菌量 已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，发酵后期， 产物合成能力降低，提高温度，刺激产物合成到放罐。8、pH的影响及其控制菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升9、发酵过程pH变化的原因 1）糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢：当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升

33、。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降10、发酵过程pH的调节1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.56.8.在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等.通过补料调节pH .当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 11、溶氧的影响及其控制溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。供氧不足，代谢异常，通气，搅拌 12、发酵过程的溶氧变化发酵初期，生产菌大量繁殖，需氧，溶氧下降过了生长阶段，需氧减少，溶氧上升发酵中后

34、期，分批发酵的溶氧不变生产后期，菌体衰老，溶氧上升13、CO2的影响及控制：降低通气搅拌，则增加CO2在发酵液中溶解度14、发酵过程泡沫的形成与控制发酵过程起泡的利弊：气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的消泡：机械消泡，消泡剂消泡：天然油脂，聚醚类消泡剂，高碳醇，硅酮类15、染菌的防治发酵前期最易染菌，且危害最大。原因 ： 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。染菌措施 ： 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。第

35、六章 酶工程制药酶与酶工程的概念固定化酶和细胞的制备酶工程技术 酶分子的定点改造 、 酶分子的定向进化 、 酶的化学修饰 、 抗体酶技术1、酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。2、固定化酶（immobilized enzyme）的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，

36、也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系3、固定化酶的特点（1）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。4、固定化酶的制备原则：（1）不改变酶的性质（2）酶结合牢固，性质稳定，易于与底物分离（3）能够实现生产的自动化，成本合理5、固定化酶载体材料：A.高分子载体 .天然高分子材料 壳聚糖，海藻酸钠 合成有机高分子材 聚苯乙烯B.无机载体 玻璃，硅凝胶，铝等C.复合载体：磁性高分子微球:内

37、部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末。6、固定化方法的选择固定化酶应用的安全性 固定化酶在操作中的稳定性 固定化的成本7、新型的酶固定化方法：光偶联法， 等离子体法， 无载体固定化酶8、固定化细胞的方法：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法.9、固定化酶的性质1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。2）酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。热稳定性提高：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高PH，蛋白酶等稳定性提高 3）酶学特性的变化：A、底物专一性：

38、对底物的专一性下降。 B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。 C、最适温度：一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。 D、米氏常数(Km) ：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。 E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。10、酶工程研究新技术一、酶分子的定点改造：有目的的改变酶的特定活性位点或基因，产生具有新性状的酶。定点突变是酶分子定点改造的常规手段，广泛用于改善酶的性能。定点突变是有目的的在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸。定点突变的方法：（1）引物介导的定点突变（2）PCR介导的定

39、点突变（3）盒式突变二、酶分子的定向进化酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。特点：适应面广；目的性强；效果显著。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+定向选择。三、酶的化学修饰： 通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。目的： 提高酶的生物活性 增强在不良环境中的稳定性 降低或消除其免疫原性方法：（1）酶的表面化学修饰 ： 可降

40、低酶的免疫原性，提高酶的稳定性；或使酶固定到某一载体上。（2） 酶分子内部修饰（3）结合定点突变的化学修饰 ：制备化学修饰突变酶，从而得到一些新颖的酶制剂。修饰酶的特性：热稳定性提高 抗各类失活因子能力提高 抗原性消除 体内半衰期延长 最适pH改变 酶学性质变化（Vmax不变，Km变大 对组织分布能力改变11、抗体酶技术：能与过渡态结合的抗体也具有酶的性质抗体酶是酶还是抗体 ？抗体是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中,能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。其本质是一类免疫球蛋白。抗体酶是酶的高效催化能力和抗体的高度选择性巧妙结的产物，本质上是一类具有催

41、化活力的免疫球蛋（Ig）其实抗体酶是一种特殊的抗体，它有着催化特性，可谓是酶和抗体性质的兼得。所以又被称为催化抗体。抗体酶的制备：诱导法， 基因工程法， 拷贝法，化学修饰法 酶传感器：它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机物或无机物反应,形成一种能被电极响应的物质第7章 药物生物技术新进展新产品新疫苗1、多肽疫苗2、基因疫苗核酸药物1.核酶2.反义核酸药物3.RNAi药物1、抗体工程制药 主体：细胞工程技术和基因工程技术2、理想的抗体药物的性质：1、高特异性和高亲和力2、对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排斥反应游离抗体不激活补体3、一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在

42、无血清培养基中进行大规模培养4、抗体符合生物制品标准3、抗体治疗存在的问题：1、异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果2、靶部位摄取的量太低3、效应功能弱4、在体内被清除速度快4、基因工程抗体的概念：利用DNA重组技术和蛋白质工程技术对编码抗体分子的基因按照不同需要进行加工改造和重新装配，再转染到合适的受体细胞中所表达的抗体分子。特点：1、减少或消除排斥反应2、分子小，穿透力强，易到达病灶核心部位3、抗体功能多样化4、可采用多种表达系统，成本低 研究内容 抗体人源化：构建抗体库从中筛选新的单抗 种类：1 人一鼠嵌合抗体：一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区(V区）与人抗体的恒定区（C区）融合而得

43、到的抗体。第一代2 鼠单抗可变区的人源化改型抗体第二代3 小分子抗体 1)Fab 完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。2)Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。 单链抗体（ScFv）的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌 3)单域抗体 即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。 4)最小识别单位 约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。4 双特异抗体和多价抗体

44、双链抗体 （Diabody）乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。 特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,抗体融合蛋白主要分两种形式： Fc融合蛋白 抗原结合融合蛋白1) 免疫粘附素2、免疫毒素噬菌体抗体库技术定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。特点 模拟天然全套抗体库 避开了人工免疫和杂交瘤技术 可获得高亲和力的人源化抗体转基因技术制药转基因动物（transgenic

45、animal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。培育1 目标基因克隆和体外重组 2 外源基因的导入3 外源DNA整合、转录及表达的分子检测 4 转基因动物品系或品种的建立 转基因动物技术路线 ：1、外源目的基因的制备2、外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞3、选择获得携有目的基因的细胞4、选择合适的体外培养系统和宿主动物4、转基因细胞胚胎发育及鉴定5、筛选所得的转基因动物品系外源基因的转移：1、显微注射法2、逆转录病毒载体感染3、胚胎干细胞介导法4、精子载体介导法5、YAC介导的基因转移6、

46、细胞核移植 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。精子与外源DNA结合的机理： 精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。后来Rottman对此方法进行了改进，将外源DNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与DNA相互作用形成脂质体DNA复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。 转基因动物的应用：1）生物制药(乳腺生物反应器)；（2）建立人类疾病的动物模型；（3）生产可移植用的动物器官。动物乳腺生物反应器一般把目的片段在器

47、官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。基因芯片基因芯片(gene chip)又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA micro-array)。基因是载有生物体遗传信息的基本单位，存在于细胞的染色体上；将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯

48、片。原理：基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。1、芯片制备1）合成探针2）探针在载体表面的固定 探针在载体表面的固定可分为两大类方法：合成后点样，多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸。原位合成（在片合成）有三种途径：，原位光刻合成，点样法，分子印章原位合成法（东南大学发明）。 3、杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。 蛋白质芯片（protein

49、 chip），又称蛋白质微阵列(protein microarray)，是用于蛋白质功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、机械点样或共价结合的等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵。芯片实验室是将样品制备、生化反应和检测分析的全过程集约化，并缩微到一张芯片上自动完成，形成的所谓微型全分析系统（micro total analysis systen,-TAS）,或称“缩微芯片实验室”（lab-on-a-chip）。生物芯片的应用：1、寻找和发现新基因2、基因表达分析3、DNA序列测定与序列间比较4、突变体和多态性的检测基

50、因治疗 基因治疗：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。基因疗法：1、重建基因调控系统2、替代异常基因3、封闭致病基因4、剪去致病基因5、修复受损基因6、增强基因效能基因干预基因干预(gene interference)：指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。基因干预的种类：1核酶： 裂解特异的靶mRNA 2反义RNA： 封闭基因表达 3 RNA干涉技术肿瘤治疗中基因的选择：1. 能改变肿瘤细胞的恶性表型的基因    肿瘤细胞主要有癌基因的突变

51、、扩增、过度表达，对此可采用反义核酸或核酶；抑癌基因的突变、失活等，可采用野生型的正常基因作为治疗基因，用正常基因剔除或替换缺陷基因。2.能提高肿瘤细胞的免疫原性的基因3.肿瘤药物增敏基因 常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因,基因载体的选择 ：有病毒载体和非病毒体两类，多用病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒载体。基因治疗中体细胞的选择：1、免疫细胞2、骨骼肌细胞 3、血管平滑肌细胞1、成纤维细胞：    成纤维细胞位于全身并具有较强的自我更新能力。优点有：易于获得；容易体外培养和扩增；分裂中的成纤维细胞易与逆转录病毒一起稳定转导，并能

52、较稳定的表达外源目的基因；携带外源基因后能稳定地回植体内并进行表达等。主要缺点是在体内由于细胞凋亡而引起的基因表达失活。 2、造血干细胞    造血干细胞是基因治疗遗传病、自身免疫性疾病及癌症常用的靶细胞。理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因 ,持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。这是今后努力研究的方向。基因组学与新药研究基因组（genome）：生物体单倍体细胞所有基因的总和。基因组学（genomics）：DNA测序、基因及非编码区定位及绘图。人类基因组计划（human genome project）人类基因组测序、基因定位、破译人类全部遗传信息。20 世纪90年代初期, 美国生物学家提出并实施了人类基因组计划( human genome project, HGP),2003年4月14日,美国人类基因组研究项目首席科学家Collins F 博士在华盛顿隆重宣布: 人类基因组序列图绘制成功