一种丝状真菌活细胞生物量测定方法的研究

1、药物生物技术Pharmaceutical Biotechnology2006,13(1:040044一种丝状真菌活细胞生物量测定方法的研究3刘伯宁,乔长晟,贾士儒3(天津科技大学生化工程研究室,天津300222摘要研究了一种基于测定脱氢酶活(D HA的生化方法,用以测定真菌活细胞生物量和评价菌丝活力。四唑盐(T TC在活细胞体内经脱氢酶还原生成红色甲臜(TF。以氢化可的松生产菌株Abasidia coerulea为模式菌,通过优化染色时间(60min、温度(45、p H值8.0,提高了该方法的灵敏度。活细胞湿重与吸光度线形相关(r2=0.98,验证了该方法的有效性。另外,使用优化后的方法,所测

2、脱氢酶比活力可以用来准确评价菌丝体活力。关键词丝状真菌;活力;四唑盐;脱氢酶活;蓝色犁头酶中图分类号:Q55文献标识码:A文章编号:100528915(20060120040205丝状真菌在微生物制药领域有着广泛的应用。但是,目前缺乏有效的方法测定其活细胞生物量和评价菌丝体活力。丝状真菌在液体培养过程中,菌丝易缠绕形成菌丝球,造成培养液不均一。以氢化可的松生产菌株蓝色犁头霉(A basi di a coerulea, Ac为例,培养过程中菌丝球形态变化较大。传统的活菌计数法如:血球板计数法、平皿菌落计数法和M PN法等,均不适用于测定其活细胞生物量。目前,发酵过程中生物量的测定,多采用菌体干重

3、或湿重法。菌体重量可以体现发酵液中生物质的多少,但不能反映菌丝生理状态,衰老程度,甚至不能区分细胞死活。微生物发酵工业要求生产菌株有足够的活细胞生物量(或转化活性,才能实现产物的大量积累。这样,菌体重量作为发酵过程的控制参数,意义有限。建立一种能够快速测定真菌活细胞生物量,有效评价菌丝体活性的检测方法,对于更好的控制发酵过程显得十分重要。从真菌生理代谢的角度出发,物质代谢和能量代谢密切相关。能量代谢的关键是细胞中有机物氧化分解产生氢,经呼吸链氧化释放能量。脱氢酶是呼吸链的主干酶系,它们可以把基质氧化脱下的氢,交给呼吸链传递释放出能量,用于生物合成和维持细胞的生命活动。因此测定真菌体内脱氢酶活,

4、可以表征菌丝的生理活性,反映被测样品中的活细胞生物量。测定细胞内脱氢酶活通常使用四唑盐系列化合物(T TC、M T T、IN T和XT T。无色T TC(2, 3,52氯化三苯基四唑作为人造受氢体,它在细胞呼吸过程中接受氢,还原成三苯基甲臜(TF。后者以红色晶体的形式存在于细胞内,采用有机溶剂(如甲苯、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮或乙醇等进行萃取。萃取液测定吸光度后,根据标准曲线计算TF生成量,进而求出T TC2脱氢酶活性(T TC2 D HA1。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种蓝色犁头霉(Abasidia coerulea AS365,本研究室保藏菌种。1.1.2培养基斜面培养基:PDA培养

5、基液体培养基(g/L:葡萄糖15,酵母膏2.7,玉米浆10,硫酸铵6,p H值6.46.71.1.3菌体的培养与收集活化后的蓝色犁头霉菌株AS365,制成浓度为107108/ml的孢子悬浮液,以5%的接种量接种到装液量为50ml的250ml锥形瓶中。28,160r/m培养24h,培养液0.08M Pa真空抽滤10min,无菌水洗涤3次收集菌体。取上述收集的部分菌体,121灭菌20min,灭活菌体用滤纸吸去水分后备用。1.1.4仪器日本岛津UV22401PC型分光光043收稿日期:2005206210修回日期:2005209205作者简介:刘伯宁,1978年生,男,河北省人,在读硕士研究生3通讯

6、作者:贾士儒,Tel:022*,E2mail:shrjia度计。1.2方法1.2.1TTC工作液的配制称取25mg烘干的TTC置于25ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,作为TTC母液(1mg/ml备用。将TTC母液稀释成浓度为10,20,30,40,50,60g/ml TTC工作液。1.2.2TF标准曲线的制定取1ml不同浓度的T TC工作液(对照为1ml蒸馏水,加入1ml20% Na2S2新配溶液,摇匀。反应1h后,各管分别加入8ml丙酮溶解TF。反应液在485nm处,测定吸光度,绘制标准曲线,并求出TF摩尔消光系数。1.2.3公式计算在最适条件下,每秒钟使1mol 的T TC转化为TF所需

7、的酶量定义为一个Kat单位(=1012p Kat。每克菌体湿重所含的T TC脱氢酶量为T TC脱氢酶比活力(Specific D HA。D H A=(×V×109/(E×60D HA:脱氢酶活(p Kat:T TC还原反应初速度(A/minV:TF萃取液体积(mlE:TF摩尔消光系数L/(molocmS peci f ic D H A=D H A/w Specific D HA:脱氢酶比活力(p Kat/gD HA:脱氢酶活(p Katw:菌体湿重(g1.2.4测定方法的优化称取0.1g湿菌体,加入3ml0.5%T TC2PBS(p H值7.5染色液,恒温水浴染色

8、一定时间,迅速加入0.5ml甲醛3终止酶促反应。离心收集菌体,经无菌水洗涤后,转移至比色管中,加入80%丙酮溶液3室温萃取2h。萃取液485nm下比色,记录吸光度。按方法1.3. 2,计算菌体脱氢酶活(D HA。1.2.5测定方法的验证分别称取湿菌体0.02,0.04,0.06,0.08,0.1g,依次加入高温灭活的菌体,使每个样品总重为0.1g,使用优化后的D HA法(结果2.6,测定吸收度。考察吸光度值与活菌湿重之间的线形关系。每个梯度做5个平行样,并计算平行样间相对偏差,考察该方法的精确性。1.2.6蓝色犁头霉不同生长时期脱氢酶比活力变化活化后的蓝色犁头霉菌株AS365,制成浓度为5&#

9、215;106/ml的孢子悬浮液,照方法1.1.3培养菌体。每6h测定菌体干重,绘制生长曲线。并同步测量菌丝体脱氢酶比活力。2结果2.1TF最大吸收波长的确定T TC经还原后形成的显色物质为红色晶体甲臜(TF,它可以被有机溶剂从细胞中萃取出来。80%丙酮与其他有机溶剂相比,对TF萃取效果好,而且利于颜色稳定3。本文使用过量Na2S还原T TC生成的TF,溶于80%丙酮后,在375 600nm处测定吸收度。由图1可知,TF最大吸收峰位于485nm处。因此将确定TF的检测波长为485nm 。Fig1The determination of TL absorption maximum wavelen

10、gth for measurement of T TC2D HA2.2工作曲线的制定按方法1.2.1绘制TF标准曲线(见图2,线形回归得到下式:y=0.0204x,r2=0.9978其中y为OD485,x为相应TTC工作液浓度。由此可知,在相当于1060g/ml TTC浓度范围内,吸光度与产物TF浓度符合朗比定律。并依此计算出 :Fig2The standard curve of TF for measurement of T TC2 D HA吸光系数a=A485/(bc=20.4L/(gocmb:吸收池光程1cmc:T TC浓度(g/L14刘伯宁等:一种丝状真菌活细胞生物量测定方法的研究摩尔

11、消光系数E =Moa =334.8×20.4=6829.92L/(molocm M :T TC 分子质量334.82.3显色时间的确定使用p H 值7.5的0.5%T TC 2PBS 染色液,在30恒温下染色不同时间(结果见图3。在4h 内,萃取液吸光度随染色时间延长而变大。其反应速率在2h 内维持不变(0.0219,0.0222,0.0216,0.0217A485/min 。2h 后反应速率开始下降。本文确定染色时间为60min 。这样,既保证所测得的反应速度为酶促反应初速度,又能使萃取液达到一定的吸光度,以减少试验误差 。Fig 3Determination of incubat

12、ion time for measurement of T TC 2D HA2.4反应温度的确定四唑盐法测定微生物体内脱氢酶活的染色温度多为374,5,这既不是真菌的最适生长温度,也不是脱氢酶酶促反应的最适温度。因此有必要针对染色温度进行优化。使用p H 值7.5的0.5%T TC 2PBS 染色液,不同温度下染色60min (结果见Fig 4。对于Abasidia coerulea 体内的脱氢酶,最适酶促反应温度为45,本文以此作为最适染色温度。需要指出的是,这与Abasidia coerulea 的最适生长温度28并不相同。2.5最适缓冲盐溶液及酸度的确定酶促反应体系的酸度、缓冲溶液本身性

13、质以及缓冲容量,对于酶活测定过程影响很大。D HA 法中常使用两种缓冲盐溶液Tris 2HCl 24和PBS 6。使用不同P H 值的PBS 、Tris 2HCl 缓冲液配制T TC 染色液,在45恒温下染色60min ,测定菌体脱氢酶活(结果见图5 。Fig 4The effect of temperature on measurement of T TC 2D HAFig 5The effect of p H on measurement of T TC 2D HAT TC 2D HA 酶促反应的最适反应环境为p H8.0的PBS 缓冲盐液溶液。当反应体系p H 值低于7.0时,酶活显著降

14、低,不利于测定。p H 值在7.58.5时,脱氢酶活可以维持较高水平。另外,不同缓冲盐溶液本身的性质对酶活测定也有影响,同样p H 值的PBS 缓冲液染色效果优于Tris 2HCl 缓冲液。因此T TC 染色液有必要使用p H 值8.0的PBS 缓冲液配制。2.6优化后的D HA 法以蓝色犁头霉为模式菌优化后的D HA 法如下:称取湿重为0.1g 的菌体,置于10ml 离心管中。加入3ml 0.5%T TC 2PBS (p H8.0染色液,45恒温水浴染色60min ,迅速加入0.5ml 甲醛终止酶促反应。离心收集菌体,弃去上清液。菌体经无菌水洗涤后,转移至比色管中,加入80%丙酮溶液25ml

15、 ,室温萃取2h 。萃取液485nm 处测定吸光度。对照图6.以吸光度表征样品中活细胞生物量,并计算菌体脱氢酶比活。以此作为评价真菌菌丝、菌丝球活力的指标。24药物生物技术第13卷第1期Fig6Validation of the T TC2D HA assay2.7验证试验应用本文2.6所述的方法,测定含活细胞量不同的活菌、死菌混合物,染色后的吸光度。图6显示,优化后的D HA法,活菌湿重在0.020.1g的范围内,吸光度与活菌湿重线形关系良好(r2= 0.98,吸光度能够很好的反映被测样品中的活细胞生物量。同时,平行样相对偏差较小(<15%,满足测定微生物生物量的试验要求。2.8梨头霉

16、不同生长时期胞内脱氢酶比活力的变化脱氢酶比活力高的菌体代谢旺盛,生命力强。图7.表明,Abasidia coerulea处于对数生长期(1830h和刚进入稳定期(3642h时,细胞代谢旺盛,体内脱氢酶比活力较高。稳定期后期(4872h干重法测得数据显示,菌体生物量虽能维持较高水平。但此时脱氢酶比活力急剧下降,细胞开始大量衰亡。此时,菌体干重已不能准确反映培养液中的活细胞生物量。Fig7The Specific D HA of varied culture2time A.C通过D HA法与传统的真菌生物量测定方法2干重法的比较。可以看出,菌体干重只能体现培养液中生物质总量的多少(包括衰老、死亡的

17、细胞;而D HA法测定结果(脱氢酶比活力则可以反映细胞处于不同生长时期时的生理状态、活力差异。而在实践中,后者对于指导微生物发酵过程控制更有意义。蓝色犁头霉发酵生产氢化可的松过程中,根据D HA法所测生产菌株的活力,对发酵参数进行优化收到很好的效果7。3讨论在目前常用的微生物生物量检测方法中,传统的平板计数法,耗时费力不能及时反映微生物生长情况;血球计数法误差大;自动菌数测定仪只识别颗粒,不能区分细胞死活;比浊法受培养基中固形物影响很大,而且要求菌体沉降不能太快。对于丝状真菌,由于培养过程中易形成菌丝球,所以以上方法均不适用,而干重法测定生物量,不能区分细胞的死活,难以评价菌丝球的活性。通过T

18、 TC测定脱氢酶酶活的方法,可以很好的解决这一问题。该方法不仅能够区分出死细胞与活细胞,而且处于不同生长时期的细胞,其活性的差异可以通过脱氢酶比活力体现出来。从这一点上说,D HA法较传统的湿重,干重法,更能反映菌体的真实生长情况。作为一种用于测定真菌生物量的新方法,通过四唑盐系列化合物测定脱氢酶活,可以应用于真菌孢子活性1和细菌5,酵母菌8中活细胞数量的测定。而且,T TC作为活体染色剂,能够使绝大多数真菌活细胞显色。这表明,只要针对研究对象对现有方法进行一定优化,该方法可以快速,有效的测定丝状真菌活细胞生物量,满足发酵过程中对菌株生理状态监测的要求。参考文献1Stentelaire.C,A

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20、96,16(4:400.4牛志卿,刘建荣,吴庆国,等.T TC脱氢酶活性测定方法的改进J.微生物学通报,1994,2(4:59.5魏鸿刚,李元广,刘健,等.一种快速活菌新方法的研究J.微生物学通报,2002,29(2:89.6刘华,梅兴国.T TC法测定红豆杉细胞活力J.植物生理学34刘伯宁等:一种丝状真菌活细胞生物量测定方法的研究 通讯,2001,37(6:537.7徐旭.压力对犁头霉合成氢化可的松的影响D.2005.18Lrveillr C,Carrr B,Chevrie M C,et al.A colorimet ric as2say for t he enumeration of Ca

21、ndida albicans in biological sam2 ples after amplification in a selective mediumJ.J ournal of Microbiological Met hods,1993,18:151.Studis on the Method for the Measurement of Fungal Biom assL IU Bo2ning,Q IAO Chang2sheng,J IA Shi2ru(B iochemist ry Engi neeri ng L aboratory,Ti anj i n U ni versit y o

22、f S cience&Technolog y,Ti anj i n 300222,Chi naAbstractA biochemical met hod,based on dehydrogenase activity(D HAmeasurement,has been devel2 oped for measuring viable cell biomass and assessing t he viability of ungal mycelium.In t he viable cell, a tet razium salt(T TCis reduced to a red formaz

23、an(TFusing celluar dehydrogenase.The procedure of t he colorimet ric assay is established and optimized by using hydrocortisone2producing st rain Abasidia co2 erulea as a model.The sensitivity of t he met hod has been considerably increased by determining t he opti2 mal reactio n conditions includin

24、g incubation time(60min,temperat ure(45and p H value(8.0.The validity of assay is p roved by a correlation established between A485and t he wet weight of viable myceli2 um(r2=0.98.Moveover,Applying t he optimized p rocedure t he specific D HA can be used for assessing t he viability of f ungi accura

25、telyK ey w ordsFilamentous f ungi,Viability,Tet razolium salt s,Dehydrogenase activtity,Abasidia coerulea(上接第27页Studies on Stability and Anticancer Activities of Meret rix meret rix G lycopeptide MGP0405ZHAN G Bo,WU Wu2tong,WU Jie2lian(S chool of li f e science and technolog y,Chi na Pharm aceutical U ni versit y,