分子与基因工程-生物技术-复习题

1、1、简述rRNA在肽链合成中的作用？功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，形成肽链2、分别说出5种以上RNA的功能？mRNA：信使RNA是转录产物，可翻译成多肽链。tRNA：转运RNA，是用来翻译过程中运输氨基酸。rRNA:核糖体RNA，构建核糖体的成分。hRNA：小发卡结构RNA，是生成mRNA的前体RNA，也是在DNA干扰中起作用。micRNA:反义RNA,对基因的表达起调节作用。3、基因工程载体的必备条件是什么，列举三种以上的常用载体。必备条件：a具有对受体细胞的可转移性b具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点c具有较高的外源DNA的装载能力d具有多种单一的核酸内切酶

2、识别切割位点e具有合适的筛选标记常用载体：噬菌体，质粒，病毒DNA，噬菌粒4、什么是报告基因，举例说明报告基因在分子生物学研究中的二种以上的用途？报告基因: 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 应用： -D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。

3、荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高301000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点。5、请列举三种以上检测基因表达的方法? 抗药性筛选、营养缺陷型筛选、显色筛选6、以色氨酸操纵元为例说明衰减子如何控制基因转录？在trp mRNA 5'端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区,研究发现,当mRNA合成起始以后,除非培养基中完全没有色氨酸,转录总是在这个区域终止,产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子,终止trp基因转录.因为转录终止发生在这一区域,并且这种终止是被调节的,这个区域就被称为弱化子.Trp操纵子转录

4、终止的调控是通过弱化作用实现的。当培养基中色氨酸的浓度很低时,负载有色氨酸的tRNATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处）,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,所以转录可继续进行,直到将trp操纵子中的结构基因全部转录7、Southern blotting 和Northern blotting 的实验原理、目的及主要实验步骤。S：目的：是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。原理：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DN

5、A片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单练DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。步骤：待测核酸样品的制备待测DNA样品的电泳分离凝胶中核酸的（碱）变性southern印迹southern杂交杂交结果检测N：目的：主要用于分析检测特异性RNA。原理：Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。步骤：RNA混合物进行琼脂糖凝胶电泳分离得到的RNA转膜与放射性标

6、记的探针杂交 结果分析。8、 “生物进化过程中，最早出现的生物大分子是RNA，而不是DNA和蛋白质，即在进化某个阶段有一个RNA世界”这一观点已被普遍接受，谈谈对这一观点的认识。最早出现的简单生命体中的生物大分子，应是既具有信息载体功能又具有酶的催化功能，因此，最早的生物大分子。进化之初是"RNA的世界"，RNA可以一身二任，既能保存信息，又能提供酶活性，因此仅有RNA也足以把早期的进化引向新的阶段。9、为实现外源基因在原核生物中高效表达，应考虑哪些因素？启动子（启动子要有可控性，用启动能力强的启动子）终止子（用终止作用强的终止子）核糖体结合位点（用含有与启动子来源相同的核

7、糖体序列结合位点）密码子（解决密码子的偏爱性）质粒拷贝数（重组质粒的扩增要可控）10. 描述DNA滚环复制过程及其特征。环状DNA可以采取上述典型的DNA复制方式进行复制，即从复制起点开始，双向同时进行，形成样中间物，故又称""型复制，最后两个复制方向相遇而终止复制。但有些环状DNA采用另个一种方式，即滚环复制。例如许多病毒DNA的复制、F因子在接合(conufgation)转移时其DNA的复制，以及许多基因扩增时都采用这种方式。在以这种机制进行的复制中，亲代双链DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5'端游离出来。这样，DNA聚合酶便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在

8、3'-OH端。当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5'端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为5'端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3'-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸，因而称为滚环复制。由于只有一条DNA链是完整的，因而在DNA解链时不会产生拓扑学上的问题，即未解链的双螺旋区不会产生超螺旋。当5'-端从环上解下来后不久，即与单链结合蛋白结合，以后可移动的引发体便在其上形成，以引发RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶催化合成冈崎片段。这个过程与前述的DNA滞后链的合成一样。

9、最后由DNA聚合酶切除RNA引物，并填充间隙构成完整的DNA链。5'端所以能从环上不断解链，主要是由于DNA聚合酶及引发体构成的复制体中的螺旋酶不停的向前移动所致。在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。这么长的DNA链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态特点(1)以亲本链（+链）为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形RF1；(2)以成环滚环复制产生多个子代RF；(3)以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环。1

10、1一个基因如何产生两种不同类型的 mRNA分子？ 一个基因可以有两种方式产生一种以上的mRNA.第一种是：一个转录初级产物含有一个以上的多聚腺苷化位点，就能产生一种以上的具有不同3末端mRNA。第二种是：如果一个初级产物含有几个外显子，发生不同的剪接就会产生多种mRNA.。12在一个克隆基因的分析中发现：一个含有转录位点上游3.8kb DNA的克隆，其 mRNA直接转录活性比仅含有3.1kb上游 DNA克隆的转录活性大50倍。这表明了什么？ 在转录位点上游3.83.1kb之间有一个增强子。13.列举原核生物同真核生物转录的差异。真核生物中编码蛋白质的基因

11、通常是间断的、不连续的,由于转录时内含子和外显子是一起转录的,因而转录产生的信使RNA必须经过加工,将内含子转录部分剪切掉,将外显子转录部分拼接起来,才能成为有功能的成熟的信使RNA.而原核生物的基因由于不含有外显子和内含子,因此,转录产生的信使RNA不需要剪切、拼接等加工过程.原核生物基因的转录和翻译通常是在同一时间同一地点进行的,即在转录未完成之前翻译便开始进行.如大肠杆菌乳糖分解代谢过程中,三个结构基因的转录和翻译就是同时在细胞质中进行的.真核生物由于有细胞核,核膜将核质与细胞质分隔开来,因此,转录是在细胞核中进行的,翻译则是在细胞质中进行的.可见,真核生物基因的转录和翻译具有时间和空间

12、上的分隔.上述真核生物基因转录后的剪切、拼接和转移等过程,都需要有调控序列的调控,这种调控作用是原核生物所没有的.14简述乳糖操纵子的结构和功能。乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶,此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I.阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时,I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处,乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶.所以,乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控.CAP的正

13、性调节：在启动子上游有CAP结合位点,当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时,cAMP浓度升高,与CAP结合,使CAP发生变构,CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点,激活RNA聚合酶活性,促进结构基因转录,调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录,对乳糖操纵子实行正调控,加速合成分解乳糖的三种酶.协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制,互相协调、互相制约.15. 简述遗传密码的兼并性和摆动假设。遗传密码普遍存在与生物界中，由一种以上的密码子编码同一个氨基酸的现象称为遗传密码的兼并性。遗传密码的摆动性，密码子与反密码子配对，

14、有时会出现不遵从碱基配对规律的情况，称为遗传密码的摆动现象。这一现象更常见于密码子的第三位碱基对反密码子的第一位碱基，二者虽不严格互补，也能相互辨认。tRNA分子组成的特点是有较多稀有碱基，其中次黄嘌呤(inosine, I)常出现于反密码子第一位，也是最常见的摆动现象。16. 何谓真核生物断裂基因？说明其结构并论述其转录表达的过程及调控。真核生物的断裂基因由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成。能编码蛋白质的基因称为外显子，不能编码蛋白质的基因称为内含子。转录表达的过程：第一步合成原始转录产物（过程包括转录的启动、延伸和终止）；第二步转录产物的后加工，使无生物活性的原始转录产物转

15、变成有生物功能的成熟RNA。第三布核糖体结合到mRNA上，由tRNA携带氨基酸合成多肽链调控：转录水平调控：顺式作用元件与反式作用因子相结合进行调控转录后调控：5端加帽子，3端加PolyA尾。mRNA的选择剪接。RNA干扰现象翻译水平调控：5端帽子结构的甲基化，翻译起始因子的调控17. 试述DNA克隆的基本流程，并列举两种阳性克隆筛选的方法。过程：一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。筛选方法：1蓝白斑筛选野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合

16、物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，使菌落呈现蓝色。重组后的大肠杆菌不能产生-半乳糖苷酶，因此不会产生5-溴-4-靛蓝，菌落成白色。2抗药性筛选:将抗药性基因与目的基因一同接入到载体中，然后转入受体细胞。在培养基中加入相应的药性物质，能生长的菌株就是含有目的基因的菌落，不含目的基因的菌株不能生长。18. 简述位点特异性重组的机理位点特异性重组（site-specific recombination）是遗传重组的一类。这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组也只发生在同源的短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化，重组的蛋

17、白不是rec 系统而是int 等，如噬菌体l 的定点插入。重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去、不合成。两个DNA分子并不进行对等的交换，有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子上（插入重组）。19. 简述乳糖操纵子中各种结构元件及其所起的作用。调节基因，产生阻遏蛋白启动子，使RNA聚合酶结合到DNA链上并且完成起始反应操纵基因，控制一个邻近基因或基因群的表达结构基因y，z，a。分别编码产生-半乳糖苷酶，半乳糖苷透过酶，半乳糖甘转乙酰酶20. 简述鸟枪法测序的基本原理和过程。原理：将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来。过程：(1).使用限制性内切酶将带有

18、目的基因的DNA链切成若干小段。(2).再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中,并使其表达。(3).如果在某个细胞中得到了目的产物,就说明整合到该细胞中的DNA片段就是所需要的DNA片段。21. 作为载体应该具备哪些基本条件？作为运载体必须具有三个条件：在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；有一定的标记基因，便于进行筛选。22. 简述哺乳动物外源基因转入受体细胞的方法。磷酸钙共沉淀法，电击转化法，脂质体介导法，显微注射法，血影细胞介导法23. 试论述现阶段生产人

19、胰岛素的方法答：基因工程法制人的胰岛素1 A链和B链分别表达法2 A连和B链同时表达法3 人胰岛素原表达法4 分泌型重组人胰岛素表达法5 以酵母为受体分泌表达人胰岛素，胰岛素基因前端可加一个信号肽编码序列，这个信号肽引导合成的胰岛素分泌到周围的培养基中，简化了纯化过程，最后通过酶学反应使之变成人胰岛素。（P375 基因工程+讲义）24. 试述细菌适应于外界营养环境的分子调控机制？答：1 如乳糖操纵子的C的正调节，当环境中葡萄糖存在时，细菌直接利用葡萄糖，细菌的水平低，且CAP以二聚体形式存在；当环境中葡萄糖缺乏时，CAMP升高结合CAP，其CAPCAMP复合物乳糖启动子上游，诱导DNA90度弯

20、曲，增强RNA聚合酶结合启动子的能力，使转录增强倍从而分泌酶加速乳糖分解为葡萄糖，供细胞进行利用。2 如色氨酸操纵子的阻遏系统，若外界色氨酸量充足，则它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区的DNA紧密结合，使色氨酸表达受阻；若外界的色氨酸供应不足时，则辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区解离，色氨酸操纵子去阻遏，开始表达色氨酸。（P264）25. 试说明基因组DNA产生重复序列的可能机制。答：1 复制滑动扩增2 滚环扩增3 不等交换 4 碱基置换突变等26. 简述原核生物的RNA聚合酶各亚基的功能。答：亚基与RNA聚合酶的四聚体核心(2')的形成有关;亚基含有核苷三磷酸的结合位点;'

21、;亚基含有与DNA模板的结合位点;而Sigma因子只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系，一旦转录开始，因子就被释放，而链的延伸则由四聚体核心酶(core enzyme)催化。27. 简述色氨酸衰减子结构及其调控方式。答：阻遏作用trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白结合于trp操纵基因特异序列，阻止转录起始，但阻遏蛋白的DNA结合活性受trp调控，再有高浓度trp存在时，阻遏蛋白色氨酸复合物与色氨酸操纵子紧密结合，可以阻止转录。当trp水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录。trp生物合成途径被激活。

22、弱化作用：trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的，大肠杆菌trp操纵子前导区的碱基序列包括4个片段，能以两种不同的方式进行碱基配对，当trp浓度很低时，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度很慢，这时的前导区结构是2-3配对，不行成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行。当trp浓度很高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子再4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以配对，行成终止结构，转录停止28. 简述影响翻译水平高低的因素有哪些？答：1、SD序列（核糖体结合位点）被封闭2、小RNA作用于目标mRNA,使其降解或不能翻译3、缺少某种氨基酸时,tRNA空载

23、4、密码子偏爱性29. 简述原核生物反式作用因子的结构域特征。第六章ppt反式作用因子含有两种不同的结构域a.dna结合结构域1螺旋-反转-螺旋2锌指3基域（通常以二聚体结合于dna上0、）b.转录激活结构域（功能域）1酸性激活域2谷酰胺丰富域3脯氨酸丰富域阻遏域：专一性的直接阻遏的结构域30. 简述型限制性内切酶的命名方式及特征。ppt11章属名+种名+株名型限制性核酸内切酶的特点是： 一般能识别和切割 48 个碱基对的核苷酸序列； 大多数识别序列具有回文结构； 没有甲基化修饰酶功能。型限制性核酸内切酶的切割方式有三种： 切割产生 5 ' 突出的粘性末端； 切割产生 3 '

24、突出的粘性末端； 切割产生平头末端31.试述利用原核表达载体进行外源基因表达的基本思路及方法步骤。(百度百科)获得目的基因，（1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。（2）通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。（2）PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用

25、下连接入载体获得含重组表达质粒的表达菌种（1） 将连接产物转化大肠杆菌DH5，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。（3） 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。32. 试述真核生物基因表达调控的多层次性。ppt第七章染色体水平的调控 组蛋白对基因活性的影响，组蛋白的乙酰化-去乙酰化，非组蛋白的调节，核基质的调控作用，基因丢失，基因扩增，基因重排dna水平 dna甲基化转录水平 rna聚合酶的活性，顺式作用元件，反

26、式作用因子转录后水平 5短加帽和polyA尾的调控意义，mrna的选择剪接，mrna运输的控制，rna干涉翻译水平 5'端UTR结构与翻译起始的调节，5帽子结构的甲基化，翻译起始因子的调控蛋白质加工和降解水平 新生肽链的水解，肽链中氨基酸的共价修饰，通过信号肽分拣、运输、定位33.说明启动子突变会导致基因表达发生变化的可能情况？启动子突变可能会提高、降低或不影响基因的表达量。1启动子突变提高基因的表达量。例子就是TERT promoter突变与人类癌症的关系。TERT启动子的突变在多种癌症中都广泛存在，超过一半的膀胱癌患者都携带这种突变。在对黑色素瘤的研究过程中发现TERT启动子的突变

27、可以使TERT基因的转录水平提高2-4倍。2启动子突变降低基因的表达量。例子就是在一项对HD（亨廷顿氏病 Huntington's Disease）基因的启动子研究中,当把HD基因转录起始位点上游126到141这一段DNA删除后，HD基因的表达量显著下降。3.启动子突变不影响基因的表达量。启动子里的突变是很多的，而且不同个体间的差异是很大的，从没有突变到3000+突变都有。但是大部分个体间的基因表达谱差异却不是很大，所以应该说大部分启动子内部的突变对基因表达的影响是微乎其微的。34.简述基因工程的应用。1生物反应器 通过基因工程可以大量生产所需要的生活活性物质，这个反应器的工厂可以是微

28、生物，可以是动物细胞或转基因动物，也可以是转基因植物。2、遗传改良 植物方面可以培育出抗虫、抗病、增进品质的作物新品种；动物方面可以提高其生长、生殖或抗逆性等性能；微生物方面可以获得增强性能的生物杀虫剂、抗病剂、新型抗生素、土壤改良剂和环境净化剂等。3、基因治疗 将健康基因移植到相关组织或细胞可使遗传患者的症状减缓甚至消失。35.简述DNA损伤后的修复类型有哪些？1、错配修复 一旦在DNA复制过程中发生错配，细胞能通过准确的错配修复系统识别新合成链中的错配并加以校正，DNA分子链中的错配几乎完全能被修复。2、切除修复 切除修复分为碱基切除修复和核苷酸切除修复两类，切除修复功能广泛存在于原核生物

29、和真核生物中，也是人类的主要修复方式,啮齿动物 (如仓鼠、小鼠)先天缺乏切除修复的功能。3、重组修复 机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复制在修复，即先跳过该损伤部位，在新合成的链中留下一个对应于损伤序列的缺口，该缺口由DNA重组来修复：先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至链缺口处，然后再用新合成的序列补上母链空缺。4、DNA的直接修复 是把损伤的碱基回复到原来状态的一种修复，不需要切除碱基或核苷酸。5、SOS反应 细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。SOS反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制及溶原性细菌

30、释放噬菌体等，细胞癌变也与SOS反应有关。36.阐述蓝白斑筛选的原理及其应用。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌

31、落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基酸端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。应用于基因工程中重组子的筛选。37.列举基因工程中常用的工具酶有哪些？ 限制性核酸内切酶：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用；DNA连接酶：修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键；连接多个平头双链DNA分子；DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶38. 简述用于高等哺乳动物细胞基因转移的方法。哺乳动

32、物细胞的物理转化法：利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。（磷酸钙共沉淀法；电击转化法；脂质体介导法；显微注射法；血影细胞介导法）哺乳动物细胞的病毒转染法:以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。39. 论述原核生物基因表达调控的机制。 遗传信息有序地传递到蛋白质或功能RNA分子的过程就称为基因表达。对该过程的调节就称为基因表达调控。操纵子调控：（1）乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶，透酶，半乳糖甘转乙酰转移酶，此外还有一个操纵子0、一个启动序列P

33、及一个调节基因I，在P序列上游还有一个-CAP结合位点，由P序列，0序列，CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区，三个编码基因由同一个调控区调节。乳糖操纵子调节机制可分为三个方面：(a)阻遏蛋白的负性调节：在没有诱导物存在时，阻遏蛋白与0序列结合，阻遏RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。当有诱导物存在时，异乳糖作为一种诱导剂结合阻遏蛋白，改变了它的构象，使它序列解离，RNA聚合酶与P序列结合转录起始。（b）CAP的正性调节：分解代谢物基因激活蛋白CRP分子内有DNA结合区及CAP结合位点。没有葡萄糖时，cAMP浓度较高，结合cAMP的CRP结合在乳糖启动序列附近的CA位点结合，激活RNA

34、转录活性。当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CA结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。（c）协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负控调控与CRP的正调控两种机制，相互协调，相互制约。色氨酸操纵子：（a）阻遏作用trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白结合于trp操纵基因特异序列，组织转录起始。但阻遏蛋白的DNA结合活性受Trp调控，在有高浓度Trp存在时，阻遏蛋白-色氨酸复合物与色氨酸操纵子紧密结合，可以阻止转录。当Trp水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，Trp生物合成途径被激活。（b）弱化

35、作用trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的。大肠杆菌trp操纵子前导区的碱基序列包括4个片段，能以两种不同的方式进行碱基配对，当Trp浓度很低时，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度很慢，这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行。当Trp浓度很高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体久到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以配对形成终止结构，转录终止。40. 论述PCR反应的原理、过程及应用。PCR为多聚酶链式反应，其基本原理就是在高温下使双链DNA变性，然后经低温退火使引物变性后的DNA单链结合，经中温延伸，形成位于

36、两引物之间的目的DNA，经过若干次循环可产生许多倍的目的DNA片段。过程：1.94 预变性，3min2.94变性 30s退火 55 30s72延伸 60s3.72延伸 10min4 .保温 10应用 ： 1.目的基因的克隆2. 基因的体外突变3 .DNA和RNA的微量分析4. DNA的序列测定5. 基因突变分析41. 转录涉及模板链和编码链的分离，解释在转录中单链 DNA是怎样被保护的。 SSB单链结合蛋白，其功能在于被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制完成后才离开，重新进入循环被解链酶分离的两条单链迅速与单链结合蛋白（SSB）结合，

37、以保持单链结构的稳定，避免双链结构重新形成，同时保持单链的完整性防止单链DNA被细胞内的极酸酶水解。42. 简述真核、原核生物基因组的差异。1原核生物基因组很小，一般只有一条染色体，真核生物基因组庞大2原核生物DNA分子的绝大部分一般是用来编码蛋白质的，只有非常小的一部分不能转录，这与真核DNA的冗余现象不同 3原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往以集中在在基因组的一个或几个特定的部位，形成功能单位或转录单位，它们可被一起转录为含有多个mRNA的分子，叫多顺反子。而真核生物中没有这种结构只有单顺反子。4原核生物基因组中含有重叠基因，真核生物基因组中含有大量重叠基因5真核生物基

38、因组不连续，又内含子，外显子，二原核生物没有。43. 为什么需要RNA引物来引发DNA的复制DNA的复制需要RNA引物，这是由DNA聚合酶和RNA聚合酶的特性决定的。DNA聚合酶不能从头合成DNA，既不能催化2个游离核苷酸之间的磷酸二之键的形成，而只能通过3-oH末端添加新的核苷酸来延长已存在的多核苷酸链，而引物酶，从头合成新链的能力，能在单链模板上合成与之互补的RNA引物（510个核苷酸再由DNA聚合酶从引物的3-OH末端形成DNA链的合成）44、简述遗传密码的特点。1、密码子的连续性。翻译始于RNA的5端起始密码子，一个密码子接一个密码子连续阅读直到3端终止密码子，密码子间无间断也无交叉，

39、即起始密码子决定了所有后续密码子的位置2、密码子的兼并性。遗传密码子最突出的特征之一是64种密码子中的61种分别编码20种氨基酸，这意味着很多氨基酸是由超过1种以上的密码子编码的，这种现象被称为密码子的兼并性。3、密码子的通用性。密码子的通用性指蛋白质合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。4、密码子的摆动性。TRNA的反密码需要通过碱基互补与RNA上的遗传密码反向配对结合，摆动性指出反密码子与密码子之间不严格遵守常见的碱基配对现象。45、真核生物基因表达调控有哪些方面?按性质可分为1第一类，瞬时调控或可逆调控，是细胞对环境变化（如底物浓度，激素浓度）的应答2第二类，发育调控或不可逆调控，细胞

40、的分裂，生长，分化，发育，形态构成。按时间可分为染色体水平，DNA水平，转录水平，转录后水平，翻译水平，翻译后水平（1）染色体水平：组蛋白的乙酰化-去乙酰化、非组蛋白的调节、核基质的调控作用、基因的丢失（不可逆）、基因扩增（增加基因的拷贝数）、基因重排。（2）DNA水平：DNA甲基化（甲基化程度高，对基因转录抑制的调控能力越强）、去甲基化（基因转录激活）（3）转录水平：RNA聚合酶（启动子，调节序列和调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用，蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性。）、特异DNA序列（顺式作用元件：启动子、增强子、沉默子、绝缘子）、调节蛋白（反式作用因子：基本转录因子、转录调节因

41、子、共调节因子）（4）转录后水平：5端加帽和3端多聚腺苷酸化的调控、mRNA的选择剪接、mRNA运输的控制、RNAi现象。（5）翻译水平：5端UTR（非翻译区）结构与翻译起始的调节、翻译起始因子的调控。（6）翻译后水平：新生肽链的水解（酶解）、肽链中氨基酸的共价修饰（磷酸化、甲基化、酰基化）、通过信号肽分拣，运输，定位。46.有哪些检测基因表达的方法? 可直接检测目的蛋白 western blot 绿色荧光蛋白可间接检测目的mRNA是否存在，northern blot RT-PCR转录水平检测 RT-PCR real-time PCR, northern blot直接检测 报告基因 融合荧光蛋

42、白47.述为实现外源基因在原核生物中高效表达应考虑的因素。（1）外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率：启动子的强弱 核糖体接合位点的有效性 SD序列和起始密码ATG的间距 密码子组成 表达产物的稳定性 细胞代谢负荷 工程菌的培养条件48.简述真核细胞中翻译终止的过程。(P143)真核生物字只需要一个终止因子eRF需要GTP,它识别所有的终止密码。终止密码UAG UAA UGA可引起蛋白质合成终止。在终止因子的参与下，核糖体上的转肽酶将合成完毕的肽链水解释出肽链延伸过程中当终止密码子UAA UGA UAG出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结

43、合水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键。接着新生的肽链和tRNA从核糖体释放，核糖体大小亚基解开，蛋白质合成结束翻译终止。49.简述大肠杆菌乳糖操纵子的主要结构和表达调控机制(P255-P256)乳糖操控子是大肠杆菌中控制半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因lacZ(编码半乳糖苷酶)、lacY(编码通透酶)和lacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。1、无乳糖时，调节基因lacI 编码阻遏蛋白，与操纵基因O 结合后抑制结构基因转录,不产生代谢乳糖的酶。2、只有乳糖存在时,乳糖可与lac阻遏蛋白结合，而使阻遏蛋白不与操纵基因结合，诱导结构基因转录，代

44、谢乳糖的酶产生以代谢乳糖。3、葡萄糖和乳糖同时存在时，葡萄糖的降解产物能降低cAMP含量，影响CAP与启动基因结合，抑制结构基因转录，抑制代谢乳糖的酶产生。补充：CAP：降解物基因活性蛋白，又称cAMP受体蛋白，这个蛋白先与cAMP结合，再与启动基因结合。它与启动基因结合时能促进RNA聚合酶与启动基因结合，促进结构基因转录50.试述cDNA文库的构建过程及应用。过程：1 cDNA克隆：选用目的基因含量丰富的组织细胞，提取总RNA根据3末端polyA尾长度不一，用亲和层析法获取较纯的mRNA2、第一股cDNA合成：以分离纯化的mRNA为模板，以Oligo(dT) 为引物在反转录酶的作用下，沿模板

45、的35方向合成。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA，也可用随机引物法，以68个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）3、第二股cDNA的合成：自身引导法置换合成法外加引物合成法4、cDNA与载体连接和导入宿主细胞：cDNA加头或衔接尾，使产生的黏性末端与载体相应的黏性末端互补，形成重组DNA。应用：1.以成熟mRNA 为模板合成的cDNA无内含子，大大减小其长度，便于操作2.真核生物细胞表达mRNA 的量比人类基因组少很多，因此减少了筛选目的基因的工作量3.某一特定功能基因在mRNA 中拷贝量大于基因组，利于获得较多模板。4.可从全长cDNA序

46、列中直接找到编码区，推测氨基酸顺序，分析性质和功能。5.基因克隆后可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白51.原核生物基因组的特点（P33）（1）结构简练（2）存在转录单元（3）有重叠基因52. 反转录转座子与反转录病毒区别。反转录转座子是指通过RNA实现转座的遗传元件。反转录病毒是由一列反转录转座子构成含RNA基因组的侵染颗粒。53.原核生物转录与真核生物转录区别比较点原核生物真核生物转录与翻译几乎同时进行转录在胞核，翻译在胞浆RNA聚合酶一种RNA聚合酶1，2，3起始点识别-35区，-10区TATA盒等顺势作用元件转录终止依赖或不依赖于p因子AATAAAA修饰点转录产物多顺反子单顺反子转录后修

47、饰无或很少复杂54. 简述增强子特点。P89A.远距离效用 一般位于上游-200bp处，但可增强远处启动子的转录，即使相距十多个千碱基对也能发挥作用。B.无方向性 无论位于靶基因的上游，下游或内部都可发挥增强转录的作用。C.顺势调节 只调节位于同一染色体上的靶基因，而对其他染色体上的基因没有作用。D.无物种和基因的特异性 可以连接到异元蛋白基因上发挥作用。E.具有组织特异性 SV40增强子在3T3细胞中比多瘤病毒的增强子要弱，但在HeLa细胞中SV40的增强子比多瘤病毒的要强5倍。增强子的效应需特定的蛋白质因子参与。F有相位性 其作用与DNA的构想有关。G有的增强子可以对外部信号产生反应 如如

48、热休克基因在高温下才表达，金属硫蛋白基因在镉和锌的存在下才表达。某些增强子可以被固醇类激素所激活。55. 简述DNA复制的几种类型及各自特征。P47.48共性：DNA双链的复制大都半保留方式，绝大多数复制是以复制叉的形式进行的。A.线性DNA双链的复制DNA复制需RNA引物提供3-OH才能起始。从一个或多个复制起始进行双向（少数为单向，如腺病毒）复制产生复制叉，每个复制起始完成的复制片段称为复制子。线性DNA复制子末端的复制需·特殊机制：a将线性复制子转变成环状或多聚分子b在DNA末端形成发夹结构，使该分子没有游离的末端。B.环状DNA双链的复制a.型 在原核生物中发现的一种DNA复

49、制机制。复制是在环形DNA分子某一点(复制起始点)上开始的。当复制围绕着染色体的两个方向进行时，所形成的复制泡状物延续生长。这种复制是把一个环形染色体转化成两个子代染色体的方法。b.滚环形 噬菌体中常见。以亲本链(+链)为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形RF1;以成环滚环复制产生多个子代RF;以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环。c.环（D-loop）型 单向复制的特殊方式。双螺旋的两条链并不同时进行复制，重链先开始复制，稍后轻链再开始复制，当复制沿轻链开始时，重链上产生了D环，随环形轻链复制的进行，D环增大，轻链后亦开始复制，最后两条链完成复制形成两条新的DNA双螺旋

50、。56. 葡萄糖是如何影响涉及糖代谢的操纵子（葡萄糖敏感型操纵子）的表达？在缺乏葡萄糖时，cAMP的水平升高，CAP蛋白同每一个葡萄糖敏感操纵子中启动子内的CAP位点结合，转录作用协同起始。如果有葡萄糖，cAMP的水平下降，CAP蛋白不再结合，转录的速率协同下降。57. 构建基因表达载体常用的组件有哪些？启动子（RNA聚合酶的识别部位和结合部位），终止子（终止基因转录过程），以及遗传标记基因（检测受体细胞中是否含有目的基因）、结构基因（负责编码目标蛋白） 、复制原点（保证目的基因在受体细胞中自我复制遗传及表达）58. 简述原核生物中反式作用因子的结构域特征。反式作用因子含有两种不同的

51、结构域：1.DNA结合域：a.螺旋-转角-螺旋b.锌指结构c.亮氨酸拉链d.螺旋-突环-螺旋2.转录激活域：a、酸性激活域b、谷酰胺丰富域c、脯氨酸丰富域59. 哺乳动物中，从母亲与父亲遗传而来的基因是差异表达的，这种现象的理论基础是什么？答：在精子或卵子发生过程中一些基因被关闭或者甲基化。IGF-II在卵母细胞中被甲基化，因此遗传于母本的等位基因在后代中不表达。来源于父本的等位基因没有甲基化，客观存在能够表达。其他一些基因只在精母细胞中被甲基化，对这种基因而言，来源于母本的等位基因能表达。60. 简述基因工程中获取目的基因的方法。答：1、从基因文库中获取；2、PCR扩增；3、化学方法人工合成

52、。1、从基因文库中获取需要构建基因文库，构建的方法有：（1）构建基因组文库：直接分离法（2）构建部分基因文库如cDNA文库：逆转录法2、PCR扩增是针对目的基因序列未知的情况，可采用PCR扩增。3、人工合成有两种：（1）逆转录法；（2）化学方法人工合成；针对目的基因序列已知且较小的情况。61. 试述如何将将所获得的目的基因插入到表达载体中，并阐述确定获得阳性重组DNA的方法。答：1（1）先用限制性核酸内切酶切割载体，将载体环切开，然后再用DNA连接酶把所截取的目的基因连接。（2）直接选择法:抗药性标记选择，标志补救，分子杂交法。免疫学方法：化学分析法，酶联免疫检测分析62. 试述人类基因组计划

53、的科学意义。答：1 确定了人类基因组中约25万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，以及研究基因的产物及其功能。2 了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。3 从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组成，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。4 研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。5 发现与DNA复

54、制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。6 研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。7 确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可指导人类有效地利用病毒载

55、体进行基因治疗。8 研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。63. 简述原核生物DNA复制的基本过程。DNA的复制分为三个阶段，即复制的起始，延伸和终止。DNA复制时需要在特定的位点起始，即复制的起始位点，在原核生物中，复制的起始位点通常只有一个。DNA复制的起始包括预引发和引发两个阶段。在预引发阶段，DNA解旋解链，形成复制叉，引发体组装，引发阶段，在引发酶的催化下以DNA链为模板合成一段短的RNA引物。复

56、制时DNA链的延伸由DNA聚合酶催化，以亲代DNA链为模板，引发体移动，从53方向聚合子代DNA链。当子链延伸达到终止位点时，DNA复制就终止了，切除RNA引物，填补缺口，在DNA连接酶的催化下将相邻的冈崎片段连接起来形成完整的DNA长链。64. 列出真核生物 m RNA与原核生物m RNA的区别。1真核生物的mRNA前体在细胞核内合成，合成后需经加工后才成熟为mRNA，从细胞核输入胞浆，起始蛋白质合成；原核生物的mRNA常在合成尚未结束时已开始翻译。2真核生物mRNA含有m7Gppp形式的“帽子”，有由poly(A)形成的“尾巴”，为单顺反子，只含一条多肽链的遗传信息，合成蛋白质时

57、只有一个合成的启动点，一个合成的终点，而原核生物的mRNA为多顺反子，含有蛋白质合成多个启动点和终止点，且不带有类似“帽子”和“尾巴”的结构，3在5端方向启动信号的上游存在富含嘌呤的SD区段。真核生物的mRNA则无此区段。4真核生物的mRNA代谢较慢，哺乳类动物的mRNA的半衰期为46h,而细菌的mRNA半衰期仅在13min此外，真核生物的mRNA前体常含有插入序列，即内含子，需要在加工时切除。65. 简述真核生物DNA水平上的基因表达调控DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，它包括基因的丢失、扩增、重排和易位等形式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变他们的活性。通过形成开放型活性染色质，DNA容易与RNA聚合酶和其他转录调控因子相结合，启动基因的转录。两栖类动物卵母细胞中的灯刷型染色质是染色体充分伸展，活跃转录的状态。基因扩增是某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因活性调控的一种方式，基因重排是指将一个基因 从远离启动子的地方移动到距它很近的位点从而启动转录，是调节基因活性的一种方式。66. 真核生物中端粒的结构特征及其生物学意