FGF家族生物信息学分析及FGF91620亚家族在罗非鱼性腺发育中的可能作用

1、FGF家族生物信息学分析及FGF91620亚家族在罗非鱼性腺发育中的可能作用 独创性声明学位论文题目:鲤塞迭生堑焦壑堂堂金盘区曼窆丝垩塞箧查芝韭鱼性膣发直生煎要能笠用本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者: 签字日期: 枷年月丌日嗨互学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院

2、筹可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:口不保密,口保密期限至 年 月止.导师签名:学位论文作者签名:、皆互陀夺签字日期:如,埤口月日 签字日期:泓彬年多月日,理学硕士学位论文/,家族生物信息学分析及/亚家族在罗非鱼性腺发育中的可能作用动物学专业硕士研究生 曾圣指导教师王德寿教授本研究受国家自然科学基金重点项目 、国家自然科学基金项目、 、国家重点基础研究发展规划、教育部博士点基金 、国家高科技研究发展计划项目、教育部创新团队、西南大学优博项目、 资助。西南大学生命科学学院二零一二

3、年五月一苓一一,平直月中国?重庆 / : , ,; 西:; .。.,:一.?目录摘要?.?.第章文献综述.、家族成员?.、家族成员的结构。、家族进化。、家族基因功能./亚家族./亚家族?./亚家族?. / /亚家族. /亚家族./亚家族?./亚家族?.、本研究的立项依据和目的意义第章尼罗罗非鱼家族成员的分离及生物信息学分析、前言?.、材料与方法?.五种丽鱼科鱼类基因组本地数据库的构建?.尼罗罗非鱼家族成员基因序列的分离?.尼罗罗非鱼家族成员系统进化分析?。.尼罗罗非鱼与人类基因共线性分析、实验结果?.尼罗罗非鱼家族序列分析.尼罗罗非鱼家族系统进化分析?.尼罗罗非鱼粥基因家族共线性分析.尼罗罗非

4、鱼家族基因性腺转录组分析?、讨论?.第章尼罗罗非鱼/亚家族成员的分子克隆及功能的初步研究?.、前言?.、材料与方法?.实验动物.试剂、耗材和仪器?.有关试剂的配制.药物处理?.尼罗罗非鱼以及两个同源基因的克隆?.系统发生和共线性分析.尼罗罗非鱼、表达模式分析.性腺发育过程中和的表达以及性逆转对其表达的影响?.原位杂交,、实验结果?.序列及系统发生分析?.共线性分析?.组织表达模式分析?.尼罗罗非鱼性腺发育过程中和 的表达.药物处理诱导性逆转对和表达的影响?.和粥门在性腺表达的细胞类型?、讨论?.:结论参考文献?.致谢在读期间所发表的文章?。专利申请情况.在读期间参加科研情况?.俑娶家族生物信息

5、学分析及/亚家族在罗非鱼性腺发育中的可能作用曾圣动物学专业硕士研究生:指导教师:王德寿教授摘要成纤维细胞生长因子 ,是一类小型分泌多肽生长因子,被证明参与到各种各样重要的生物学进程中,如生长、发育、性别决定与分化、细胞分化、增殖、迁移、凋亡等。迄今为止,哺乳动物中已分离到的成员有个粥,.刀,人类是小鼠的直系同源基因斑马鱼中有个,而在其他物种还没有详细完整的报道。目前对的功能特别是在性别决定与分化过程中作用的研究主要集中于哺乳动物,而鱼类中只有少量报道,为了研究家族成员在鱼类性别决定与分化以及性腺发育过程中的潜在作用,我们从基因组水平以及转录组水平对新近完成基因组测序的尼罗罗非鱼的家族成员进行了

6、系统分析,并对/亚家族在性腺发育中的可能作用进行了探讨。本研究通过同源搜索比对,结合基因组与转录组数据在尼罗罗非鱼中分离到了个成员。其中个删、为首次发现。根据分离到的尼罗罗非鱼序列,还在三棘刺鱼、青鳓、红鳍东方纯、黑青斑河豚以及新近完成基因组测序的另外种丽鱼科鱼类一伯氏朴丽鱼、布氏新亮丽鲷、奈里朴丽鱼和斑马宫丽鱼的基因组中分离到.个成员。结果表明在已知硬骨鱼基因组中都不存在的同源基因,而上述种丽鱼科鱼类拥有数目最多的成员。新分离到的成员中,仅存在于种丽鱼科鱼类基因组中;仅存在于鲈形目鱼类中:仅存在于种丽鱼科鱼类及红鳍东方纯中;在红鳍东方刍屯和斑马鱼中不存在;在三棘刺鱼、红鳍东方鱼屯以及青鳓中不

7、存在;在三棘刺鱼、黑青斑河豚和青鲻中不存在;而月凹则能在所有已公开基因组的鱼类中分离到。系统发生分析表明脊椎动物的家族成员可以划分为个亚家族:/、/、/、/、/、/、/。系统进化树的聚类以及精确的共线性分析表明,本研究分离到的新成员除两南大学硕十学位论文了以外为鱼类特有,都是相应的人类的同源基因。对已知的同咫/,/亚家族成员基因结构以及系统进化发生的研究,我们可以肯定/亚家族在进化历程中具有其独特性,并且其在进化的早期最早可能发生在腔肠动物海葵即与其他亚家族发生了分离。通过对孵化后天、天、天、天尼罗罗非鱼雌、雄性腺共个转录组数据进行的分析,我们发现尼罗罗非鱼个基因中有个在性腺表达。其中个存在较

8、为明显的性别差异,个成员粥,口、在雌性中的表达明显高于雄性,个成员粥砣、在雄性中的表达明显高于雌性。在哺乳动物性别决定与分化过程中具有至关重要的作用,但是/亚家族成员在硬骨鱼性腺发育中的功能还没有报道。通过和技术,我们从尼罗罗非鱼中克隆了/亚家族中的三个成员、和。系统发生、生物信息学以及共线性分析表明这三个克隆的就是和加的同源基因。我们的研究还进一步支持了硬骨鱼基因组中不存在同源基因,以及的复制仅存在于硬骨鱼类中的观点。通过进行的组织分布表明在包括精巢和卵巢在内的多个组织中表达;在脑、垂体、脾脏而不在性腺中表达;在脑、垂体、肠和卵研究了和巢中表达,而在精巢中没有表达。我们还通过.在正常以及性逆

9、转性腺发育过程中的表达模式。这两个基因在卵巢和雌激素 诱导的卵巢中的表达都远远高于在精巢和芳香化酶抑制剂以及雌激素受体抑制剂诱导的精巢中的表达,并且都在孵化后天达到最高。原位杂交显示和的阳性信号集中在二时相的卵母细胞内。这些数据表明/亚家族可能在雌性生殖细胞的发育过程中起重要作用。综上所述,我们在尼罗罗非鱼基因组中分离到个基因,其中有个为本研究新分离。这些新分离的成员在新近完成基因组测序的种丽鱼科基因组中都存在,而在其他已公开的硬骨鱼基因组中仅部分存在。转录组分析表明个尼罗罗非鱼基因中有个成员在性腺表达,它们在性别决定与分化以及性腺发育过程中的作用,还有待进一步研究。对/亚家族的表达研究表明,

10、和可能参与调控卵巢卵母细胞的的发育过程。关键词:成纤维细胞生长因子、性腺、基因组、转录组 / /:,. ,砣,丹,. ,椭.,/ /. ,、 刀. ? . , ,.他 .,; 如; 内; ; ;.:两南大学硕十学位论文:/,/,/,/,/,/ ./,代 . /,/ / , .,. .,.。 , /. 瓯 ., . ., , , 。 。 。 . ,. 加 . /. .,. 陀 ./.:,第章文献综述第章文献综述成纤维细胞生长因子 ,是一类小型分泌多肽生长因子,以与肝素的高亲和性以及与细胞表面肝素硫酸蛋白聚酶的相互作用为特征,这种相互作用对信号传导必不可少。在发育个体和成体组织中广泛表达,在体内和

11、体外都具有各种生物学活性,包括血管生成、促有丝分裂、细胞凋亡、细胞生存、细胞趋性、细胞黏附、细胞迁移、细胞分化、细胞增殖和组织损伤修复等 .,。、家族成员迄今为止,在包括人类 在内的哺乳及小鼠动物中,.基因已得到分离。由于人类是小鼠的直系同源基因,因此人类和小鼠家族成员共有个,其各成员之间的氨基酸相似性在.%之间 。然而在其他四足类中存中在多少个家族成员目前还没有明确的报道。近来在斑马鱼.,发现个新的月卯基因,使得只钮家族成员的命名扩展到。由于鱼类特有的基因组复制,斑马鱼中存在个月凹家族成员,、粥,、以及粥砣存在旁系同源基因,而在斑马鱼中不存在 ,。其他硬骨鱼类中存在多少家族成员也还没有明确报

12、道。家族成员在诸如大肠杆菌、酿酒酵母等单细胞生物中还没有被发现。目前知道的拥有基因的最原始的后生动物是线虫。经鉴定,线虫中存在个月觎基因:。果蝇 经鉴.和.,定共有个基因:、和个月卯中存在; 。海葵基因,其中有个是海葵特有 .,。尾索动物海鞘中存在个基因 .,而头索动物文昌鱼。.,中存在个基因通过系统发生重建,脊椎动物家族成员可以划分为个亚家族:/亚家族,其成员有和;/亚家族,其成员有、和;/亚家族,其成员有、和;/亚家族,其成员有、和;/亚家族,其成员有、两南大学硕学位论文和,斑马鱼也属于该亚家族;/亚家族,其成员有、和求;/亚家族,其成员有、和 ; : 凡咄。、家族成员的结构家族除了有与肝

13、素和肝素样氨基葡聚糖的高亲和性这?特征外,还具有一个氨基酸左右在不同成员之间都高度同源的中央核心。这个中央核心折叠进个反向平行的链中一起形成一个由可变的氨基和羧基末端封闭的圆柱体 .,: .,; .,如图。有趣的是,家族的这种结构在空间构象上与自介素,相同 .。虽然定义家族特征的是其结构,但这些蛋白中的第一个成员却是以其生物学活性来命名,随后的这些分子都被命名为现在的并以数字进行编号排序。这种命名法本意不是为了说明这些因子都具有成纤维细胞刺激效应就没有刺激成纤维细胞的作用而是为了指出由于结构上的相.似性他们应当被归类到同一个家族中。.,图人类蛋白结构。引自陀.。. . 大多数是具有可裂解.末端

14、信号肽的分泌型蛋白 。特别是/亚家族的成员,一直以来被认为是内分泌激素样蛋白,。最近的研究表明是一种磷酸代谢类激素 /亚家族的成员、和虽然没有明显的可裂解的信号肽序列,但具有一个特殊的.末端区域以及一个包含基序的中央疏水区,第章文献综述它们能编码一种非经典式的分泌信号,因此也是可分泌蛋白.,。相反,、没有;.末端的疏水序列,不是典型的分泌蛋白。和可能从受损的细胞内或.,者通过一种独立于内质网.高尔基体通路的胞吐机制释放到细胞外。虽不分泌,但在细胞内行使功能,。、家族进化在基因进化过程中,多数基因家族都是在两个主要的阶段扩张的。第一阶段的复制发生在原口动物和后口动物分离之前的后生动物,另一阶段发

15、生在早期的脊索动物,;。基因家族的扩张也经历了这样的两个阶段。原始后生动物中存在两到三个基因。如线虫中的.和、果蝇中的、也称为和也称为,在脊索动物进化以前,通过基因复制月凹基因由两到三个扩张到六个海鞘,这个扩张的家族一直被认为是现代脊椎动物月竹基因亚家族的的祖先。 ;.,。和认为,线虫.基因的内含子.夕、显子结构与./,熟脊椎动物?一样,而与海鞘和脊椎动物的其他粥风不同。因此,曰吼.可能是由.粥,朋刀和脊椎动物的祖先基因进化而来。相对而言,的内含子.外显子结构与脊椎动物的结构不同,表明祖先基因可能没有进化到脊椎动物的基因。果蝇的屡洛、嬲、基因以及海鞘和脊椎动物的大部分基因的内含子.夕、显子结构

16、基本相同。其中凡的核心区域与大多数海鞘和脊椎动物的核心区域最相似,表明的祖先可能进化出了脊索动物其他的。海鞘六个基因中的五个,包括.、 ./、 ./、 .莉./可能是由脊椎动物亚家族的祖先基因进化而来。海鞘家族的第六个成员在脊椎动物中找不到任何的同源基因。早期脊椎动物进化过程中,经历了两次大规模的基因复制事件甚至是全基因组复制,产生了现今脊椎动物的全部成员。然而,系统发生研究并没能很好地阐明尾索动物与脊椎动物之间的这种同源关系。最近,在文昌鱼中发现了个基因,系统发生分析与精确的共线性分析表明所有脊椎动物的同源群在文昌鱼中都有一个原始直系同源基因。这表明了脊索动物基因的分离是发生在头索动物而不是

17、在尾索动物 .,。但两南大学硕十学位论文是,月凹家族具体的进化历程仍然没有完全阐明。、家族基因功能./亚家族又被称为酸性 ,它在刺激合成、炎症反应、损伤修复以及再狭窄等过程中起到重要作用 .,; 。., ., ; ,;又称为碱性 ,它与具有极高的序列相似性,广泛地分布于神经外胚层和中胚层起源的组织中。基因敲除实验证实,在心血管、骨骼以及神经元的形成中起到重要作用。在小鼠精原干细胞的自我更新和扩张以及小鼠和牛 的睾丸精子发生过程中必不可少.,:. .,。体外实验表明也能够支持牛滤泡颗粒细胞的增殖.,。在青鳓.,发育中的卵巢作为旁分泌因子影响滤泡细胞并调控卵黄发生的起始,同时也作为颗粒细胞和滤泡细

18、胞增殖和分化的调节因子 .,。. /亚家族;,又名.,因其是小鼠乳房肿瘤病毒经常结合的位点而得名。最初被认为是小鼠乳房肿瘤发生过程中的一种激活基因,随后的研究表明在内耳上皮细胞的形态发生和背部图式发育过程中起重要作用 .,。在斑马鱼中的研究表明,还参.,。与了斑马鱼腺垂体早期的特化以及之后的存活在胎儿肺也称角质化细胞生长因子的间叶组织中表达,在体内发育的肺中异常表达将阻碍肺分支形态的发生,促进上皮细胞增殖引起囊腺癌 .,。它在肺部.,;的炎症反应以及损伤修复中也起到重要作用,。还参与调控输尿管芽的生长以及毛囊的生长。与和除了具有很高的序列相似性外,还具有诸多相似的功能,如对角质化细胞的促有丝分

19、裂作用.,、对肾脏不同阶段的调控作用.,;.,、对上皮一间质相互作用信号的调控 .,以及对心血管发育的调控作用 .,等。是该亚家族中最晚发现的成员,其在皮肤发育和修复 .,第章文献综述、促进抑制性突触前末端的形成 .,中起到重要作用。. /亚家族又名或,是于人胃癌细胞 和卡波西肉瘤 样本筛选出可以转化成纤维细胞的基因过程中发现的一种。其在诱导精子发生 .,、调控爪蛙血液和肌肉的特化 .,以及斑马鱼左右内脏器官的图示发育.,过程中起重要作用。大量实验证实,在毛囊发育的过程中起着关键性作用., ,此外,还能影响人类的血压. .,;。又名,最早是基于其与的序列相似性而分离出来。基因敲除等实验表明,在

20、肌发生、肌肉再生., ; .,等方面具有重要作用。. /亚家族该亚家族除具有、和外在硬骨鱼类中还有。,又名雄激素诱导的生长因子.的,最早是于雄激素依赖性小鼠乳腺癌.细胞系中作为一种支持乳腺癌细胞雄激素依赖性生长因子而分离出来。研究表明,其在哺乳动物雄性生殖道导管的形成 ., 以及控制内耳形成 .,的过程中必不可少。与在功能上有一定的相似性,如在大脑新皮层的图示发育过程。同时,还具有其特有的功能,如在听觉以及在无限增殖和肿瘤中脑的结构和功能发育过程的重要作用 .,形成的前列腺上皮细胞中作为一种自分泌生长因子 .,。,同与一样,在中后脑边界.表达 .,是骨骼的生长与发育过程中软骨发生和硬骨发生一种

21、必不可少的生长因子.,; .,; .,。是家族中最晚发现的一个成员,现只在硬骨鱼类中有发现,根据系统发生重构,其被归类到/亚家族。它能促进斑马鱼后部中胚层发育.,、胸鳍的形成 .,以及腹部胰腺的特化西南大学硕士学位论文.,。./亚家族最初是在神经胶质细胞系中分离得到,基于其活性最初被命名为胶质。除了在肺部发育 .,细胞激活因子以及长骨修复中的软骨发生和硬骨发生 .,起重要作用外,在哺乳动物的性别决定与分化过程中还起到了至关重要的作用。哺乳动物性腺的命运是由与的对抗作用控制的。哺乳动物雄性性别决定开关的作用是使与之间的平衡发生改变,而倾向于雄性方向,即方向,使得双向潜能性腺分化为精巢 .,图。其

22、在哺乳动物睾丸支持细胞增殖、精索形成以及出生后的精索发育中也起重要作用 .,:.,; .,。而在小鼠中,的缺失将导致性逆转现象的出现 .,。蒌舅渺呐州嗍.帕暑器喘黜昔参.诎。哪图双向潜能性臃中掊抗信号调控性别决定。一种遗传或环境开关通过改变和之间的不平衡来起始雄性通路。在哺乳动物中,这种不平衡是通过的上调来实现。上调,维持,在性腺中形成了一个正向前馈环。在这种情况.与信号之间的平衡就偏向于,雄性通路的主导地位戟建立了。在与之间的前馈环缺失的情况下如在性腺中,阻碍了,起始了雌性通路。引自.,颤棚伽 . . 煳锄. .娜。卫 唰。,加文黜 。. 第苹文献综述 . ., , , . .,据报道,在小

23、鼠和大鼠胚胎晚期以及成体的心脏.,; .,;组织、胚胎的褐色脂肪细胞中表达,; .,; .,同时,它还在小鼠昕板、发育中的听囊、咽头内胚层、鳃弓、嗅板以及发育中的内耳表达 .,;.,表明其在感觉嵴的发育中起到重要作用。能促进心肌细胞的增殖和分化、增强成体大脑中多巴胺神经元的存活以及促进鳍条再生 .,; .,。此外,还有许多与相似的功能,如促进小鼠腭皱的发育 .,和齿发生 .,。. 亚家族/亚家族成员又被命名为成纤维细胞因子同源因子。,与其他家族成员不同的是它们在家族进化的早期即与其他成员分离,在结构上由于它们不存在信号肽序列,因此不分泌到胞外,但在胞内行使功能。又名,其在神经细胞瘤、视网膜母细

24、胞瘤和脑瘤中的表达,暗示了其在肿瘤发生中的重要作用。又名,在小鼠背根神经节感受伤害的神经元中表达.,它还能在胞内抑制由辐射产生的细胞凋亡,表明了其在损伤修复过程中的.,。重要作用.,在多种组织中表达,如心脏、中枢神经系统等神经系统的分化 。在爪蛙以及调控表皮膨胀层、基底层细胞功能中具有至关重要的作用.,。是中枢神经系统钠离子通道的一种独有的调节子 .,它还在空间学习功能以及突触可塑性方面具有重要作用.,。. /亚家族该亚家族是目前唯一一个具有内分泌功能的亚家族。近年来,这一亚家族成员得到了许多研究人员极大的关注,成为了热门研究对象。两南大学硕十学位论文小鼠的是人的直系同源基因,是一种对成纤维细

25、胞因子受体 ,具有高亲和性和肝素依赖性的生长因子。研究表明, 在鸡内耳的发育起始.,.,、斑马鱼晶状体和视网膜的发育过程中起到重要作用。是最新发现和糖脂代谢有关的因子,它可以调控各种内分泌功能。它除了可以作为一种内源性因子抑制心肌内皮细胞的凋亡 .,、保护胰岛细胞的存活 .,还具有降脂 .,;., 等作用。主要由骨原细胞和成骨细胞产生和分泌,在脑、胸腺、小肠、肝脏、心脏、淋巴结、甲状腺、甲状旁腺、骨髓等低表达,是一种最新发现的磷代谢激素,可以在一个相对较窄的范围内保持血清磷酸盐浓度。此外,它还是监测慢性肾脏疾病的一个重要指标 .,在骨骼塑造和重塑方面也具有重要作用,。、本研究的立项依据和目的意

26、义尼罗罗非鱼 俗称非洲鲫鱼,为热带鱼类,原产非洲的坦噶尼喀湖,在分类上隶属鲈形目、丽鱼科、口孵非鲫属。该属常见的有尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼.、莫桑比克罗非鱼.等。尼罗罗非鱼具有生长快、适应性强、食性杂肉质细腻鲜美等优点,是联合国粮农组织向世界各国推荐的优良养殖对象,也是农业部为贯彻实施“十一五”规划实施的“九大行动”水产养殖重点推广的个主导品种之一。目前,罗非鱼在我国产量由年的不足.万吨,增长到年万吨,占世界产量的.%,并在年达到万吨。目前,我国已成为全球最大的罗非鱼生产国和出口国。由于尼罗罗非鱼雄鱼生长速度比雌鱼快%.%,再加上具有性成熟时间短半年到一年,繁殖周期短大约天一个周期等特点,所以

27、尼罗罗非鱼全雄鱼苗生产及其性别控制研究是各国水产科技工作者的热门课题。目前,斑马鱼、红鳍东方纯幻 、日本青鲻、黑青斑河豚和三棘刺鱼 基因组全序列已完成并公布。通过生物信息.,学基因组比对研究发现,鱼类在进化上经历了一次独特的基因组复制。伴随基因组大规模测序所产生的基因信息学;也被越来越多的运用到生命科学的研究中。从已有的数据库中寻找新的基因或者第苹文献综述已知基因的类似物已经成为非常有用而且普遍的研究方法。但是,上述鱼类都是一些小型鱼类,没有任何水产养殖价值。尼罗罗非鱼及其他四种与、布氏新亮丽之亲缘关系较近的丽鱼科鱼类:伯氏朴丽鱼、奈里朴丽鱼鲷 、斑马宫丽鱼的全基因组测序已经完成,基因组序列也

28、已于网上公开,具有良好的基因组资源,利于从基因组水平对尼罗罗非鱼进行研究。综上所述,实验动物尼罗罗非鱼是进行各项鱼类研究的好材料,并能很好的兼顾理论和应用两个方面。本实验室在尼罗罗非鱼的性别决定与分化的分子机制研究方面做了大量工作,克隆了一些与罗非鱼性别决定和分化相关基因、类固醇合成酶基、 因,如、聊、 .,等; .,初步研究了这一系列基因在性别分.,;化和配子发生过程中的作用,提出转录因子通过调控芳香化酶的表达、控制雌激素水平从而影响硬骨鱼类性分化方向的假说,并通过一系列的在体和离体实验加.,。以证实家族是一个生长因子大家族,生物学功能多种多样,但目前的研究普遍限于哺乳动物,鱼类中只有少量报

29、道。在哺乳动物生长、发育、性别决定和分化过程具有重要的作用,让我们看到了其在鱼类性别决定和分化以及性腺发育过程中的潜在作用。目前虽然在人类、小鼠以及斑马鱼中对进行过系统的分析,并在哺乳动物中分离到个,在斑马鱼中分离到个其中删肋为斑马鱼特有、在四足类还没有被发现、粥在斑马鱼中不存在,但是在其它硬骨鱼中还没有见到详细的报道。在尼罗罗非鱼甚至是其它硬骨鱼类中究竟存在多少成员,还会不会有新成员被发现,它们在起源进化过程中会不会有特殊性,这些成员中又有哪些可能会对尼罗罗非鱼的性别决定与分化以及性腺发育起作用;鉴于在哺乳动物性别决定与分化过程中具有至关重要的作用,在尼罗罗非鱼中能否找到粥矽的同源基因,或者

30、找到与相似在性别决定与分化过程中起重要作用的成员将是本研究的关键问题。本研究将立足于基因组以及转录组对尼罗罗非鱼家族成员进行系统全面的分析,并对其中重要成员在性腺中可能的作用做初步研究,为进一步解析在鱼类性别决定和分化以及性腺发育过程中的作用奠定基础。两南大学硕十学仲论文第章尼罗罗北鱼家族成员的分离及生物信息学分析第章尼罗罗非鱼家族成员的分离及生物信息学分析、前言基因家族成员表达于各种组织、器官,参与到个体生长、发育、性别决定与分化等各个方面,具有极其重要的作用,是一大类小型分泌多肽生长因子,以与肝素的高亲和性以及与细胞表面肝素硫酸蛋白聚酶的相互作用为主要特征。家族成员具有一个氨基酸左右在不同

31、成员之间都高度同源的核心序列,这个核心折叠进个反向平行的链中一起形成一个由可变的氨基和羧基末端封闭的圆柱体。在人类 ,、小鼠 ,中已分离到个成员,而在斑马鱼中已分离到个成员 ,。目前对于功能的研究也主要在这三种模式生物中展开,其他物种中的研究还相对较少,在硬骨鱼类中的研究更少,除了斑马鱼外只有青鲻中有少量报道。根据系统发生重构,脊椎动物基因家族可以分为个亚家族:/、/、/、/、/、/、/。除了/以及/亚家族成员外,其他成员都是典型的可分泌蛋白,和可能从受损的细胞内或者通过一种独立于内质网.高尔基体通.,。虽不分泌,但路的胞吐机制释放到细胞外在细胞内行使具体功能,。尼罗罗非鱼除了作为一种世界性养

32、殖鱼类,在研究生长、发育、性别决定与分化上还具有其独特的特点,近年来也逐渐成为人们关注的对象。有鉴于此,在尼罗罗非鱼甚至在硬骨鱼中究竟存在多少个家族成员,它们在进化历程上是否存在着不同,它们在尼罗罗非鱼性别决定与分化过程中是否也起到重要作用,本研究对尼罗罗非鱼基因组进行了全面的分析,从中分离了全部家族成员,并对其系统发生、共线性进行了分析研究,还通过本实验室前期所测个尼罗罗非鱼性腺转录组对其在性腺的表达进行了研究,这将有助于丰富对硬骨鱼类基因家族的认识,为更进一步揭示粥家族进化历程提供理论依据,也为进一步深入研究硬骨鱼类家族成员是否对性别决定与分化起重要作用奠定基础。、材料与方法.五种丽鱼科鱼

33、类基因组本地数据库的构建五种丽鱼科鱼类基因组数据从运用上下载,:/./两南大学硕十学位论文一.一.:/./软件构建本地基因组数据库,用于后续基因组比对分离尼罗罗非鱼月凹家族成员基因序列。.尼罗罗非鱼家族成员基因序列的分离首先从:/./下载已公布的人类及斑马鱼全部序列核苷酸和蛋白质,放入本地基因组数据库中对尼罗罗非鱼基因组进行同源比对和,分离出可能含有基因的片段,同时应用:/./.网站预测出目的基因的序列,通过网上分析,并与尼罗罗非鱼性腺转录组数据进行比对,最终确定尼罗罗非鱼全部的序列。再将尼罗罗非鱼的序列放入本地基因组数据库中对其他四种丽鱼科鱼类基因组进行同源比对,分离出其他四种丽鱼科鱼类的全

34、部序列。同时将尼罗罗非鱼和斑马鱼脚序列放入 :/./中比对已公开的其他硬骨鱼基因组获得这些硬骨鱼所有的序列。.尼罗罗非鱼家族成员系统进化分析所有的核苷酸序列的编辑、序列对比分析都由软件包的和完成。蛋白质序列的比对分析采用软件.,.软件 ., 用于构建和编辑,。进化树使用的进化树,进化树的构建采用邻接法序列包括本研究分离到的尼罗罗非鱼全部家族成员蛋白序列以及已公布的人类和斑马鱼全部蛋白序列。其中尼罗罗非鱼、为本研究克隆,其余为本研究从基因组分离得到;斑马鱼 、是从基因组中新分离得到,其余为上已公开发表序列。/亚家族所有成员序列均来自于。研究所用序列见表。.尼罗罗非鱼与人类基因共线性分析人类及其相

35、邻基因图谱的构建采用:/.。构建尼罗罗非鱼及其相邻基因图谱是通过将尼罗罗非鱼性腺转录组获得的序列比对到基因组上获得。共线性分析所用到的其他尼罗罗非鱼基因名称通过系统发生分析确定。第章尼罗罗卜鱼家族成员的分离及生物信息学分析表系统发生分析用到的序列的登录号 .本研究分离. 本研究分离 从 . 本研究分离鼹 本研究分离静 本研究分离 . 本研究分离铋 . 本研究分离 本研究分离. . . 本研究分离. 本研究分离 . 本研究分离 本研究分离. 本研究分离.本研究分离托.鼯 气 本研究分离. . 本研究分离从 . .基因组分离. .基因组分离; . 基因组分离 .棚 . 本研究分离 . 本研究分离.

36、 本研究分离 / / . 本研究分离 . 他. 本研究分离 ./. . 本研究分离 /. 本研究分离 .洲. 乙 . 本研究分离. . 从托. 本研究分离. 本研究分离本研究分离. “ . . 本研究分离.? . 本研究分离他.本研究分离、实验结果.尼罗罗非鱼家族序列分析通过同源比对搜索以及转录组数据分析,本研究从尼罗罗非鱼基因组中共分两南大学硕十学位论文离到个家族成员。除了以外的所有人类同源基因在尼罗罗非鱼中都存在。其中粥,、粥舰粥,、粥,、粥,、粥砣、因基因组复制而存在旁系同源基因,尼罗罗非鱼成员数目比斑马鱼已有的报道 ,要多出个、本研究还从己公开的包括三棘刺鱼、青鲻、红鳍东方纯、黑青斑河

37、豚以及新近完成测序的伯氏朴丽鱼、布氏新亮丽鲷、奈里朴丽鱼和斑马宫丽鱼在内的硬骨鱼类基因组中分离出了全部基因表,此外还从斑马鱼基因组中分离到个新成员。其中黑青斑河豚和青鲻中只分离到个成员;三棘刺鱼中分离到个;红鳍东方啬屯中分离到个;布氏新亮丽鲷中分离到个;伯氏朴丽鱼、奈里朴丽鱼和斑马宫丽鱼都分离到个成员。在所有已公开的硬骨鱼基因组中都没有分离到人类的同源基因。在新发现的个成员中,在红鳍东方囟屯和斑马鱼中不存在:粥仅在鲈形目中存在;存在于所有硬骨鱼类当中斑马鱼为新分离;粥,乃在三棘刺鱼、红鳍东方鲍以及青鲻中不存在;在三棘刺鱼、黑青斑河豚和青鲻中不存在;仅存在于种丽鱼科鱼类及红鳍东方纯中,脚动仅存在

38、于种丽鱼科鱼类中。尼罗罗非鱼月凹家族成员的长度在到之间,分别编码到个氨基酸,各成员之间氨基酸相似性从.%到.%。尼罗罗非鱼家族基因结构内含子夕显子结构可以分为三种类型:除了粥心外的所有/、/、/、/、/亚家族成员都含有三个外显子,含有四个外显子;/亚家族成员含有五个外显子;/亚家族成员含有五个外显子。所有尼罗罗非鱼月觎家族基因皆含有一个/亚家族为编码核心区域的外显子图。第章尼罗罗鱼家族成员的分离及卞物信息学分析表所有已公开的硬骨鱼基因组中家族成员数目. . . . . . . . . 一 。 。簪,西南大学硕士学何论文: :/脚一。胁第章尼罗罗非鱼家族成员的分离及生物信息学分析一妇一一: :/

39、一乃一: : :? :彪妇一心妨一圈尼罗罗非家族成员基因结构。方框和双斜线分别代表外丑子和省略的序列。数字代表外丑子和内含子的碱基数目。和分别代表外显子和内含子。和:、分别代表起始密码子和终止密码子.舱。蚋弓.婚瞄,. 戗. .两南大学硕七学位论文.尼罗罗非鱼家族系统进化分析系统进化分析选取了人类、斑马鱼包括基因组新分离到的成员以及尼罗罗非鱼全部家族成员。系统发生重构可以看出,包括人类、斑马鱼在内的全部家族成员可以明显分为七个亚家族:/、/陀、/、/、/陀、/、/图。这与在人类 以及斑马鱼 ,中的对于家族聚类的研究结果一致。同时,在尼罗罗非鱼中新发现的、也都与、聚类到同一支图。/,懈、?,:一

40、,二一、,/圈尼罗罗非量、人类、斑马鱼家族进化树。进化树采用法以.来构建。用于蛋白质序列比对。进化树所用到的序列来源描述于材料与方法章节。代表尼罗罗非;代表人类:代表斑马鱼。 鹞协硝. 逾 . 鹤 嗽, / 碰驴 :.戳咖。嚣.踟吡嗍嚣玳鹤涮/; ;删第章尼罗罗鱼家族成员的分离及生物信息学分析.尼罗罗非鱼基因家族共线性分析为了阐明尼罗罗非鱼基因与人类基因之间的关系,我们比较了人类月与尼罗罗非鱼月卯在染色体,或连锁群 ,上的基因座位以及它们保守的基因顺序。人类和以及尼罗罗非鱼和的基因座位之间存在明显的保守顺序,表明尼罗罗非鱼和是人类和的直系同源基因,而系统发生结果以及尼罗罗非鱼以及复制基因的存在

41、,表明了尼罗罗非鱼是的旁系同源基因图。大多数人类,昶/,与昆罗罗浆鱼/昶/亚家族成员之间都存在保守的基因顺序,表明尼罗罗非鱼、分别是人类粥乃、的直系同源基因。在人类与尼罗罗非鱼的基因座位之间可以看到明显的保守基因顺序,表明尼罗罗非鱼是人类的直系同源基因。虽然在人类与尼罗罗非鱼粥之间没有看到保守的基因顺序,但是根据系统进化树尼罗罗非鱼与是最接近的,所以是的旁系同源基因。人类与定位在号染色体的相邻的座位上。尼罗罗非鱼与定位在 上,而与定位在上。根据系统发生以及蛋白质相似性比对,尼罗罗非鱼粥砌与更接近于人类粥形和舰,表明它们分别是上,粥砌人类阳彤与的直系同源基因。此外,在尼罗罗非鱼和脚的基因座位也可

42、见保守的基因顺序,表明阳彤和分别是和的旁系同源基因图。尼罗罗非鱼/亚家族包括、以及。人类、座位与尼罗罗非鱼、座位之间的保守基因顺序表明尼罗罗非鱼、是人类、直系同源基因。蛋白质相似性分析以及保守的基因顺序表明,尼罗罗非鱼是人类的直系同源基因。在尼罗罗非鱼座位和人类座位之间也存在一定的共线性,同时系统进化研究也表明了是的旁系同源基因图。尼罗罗非鱼/亚家族包括、。尼罗罗非鱼、与人类、座位之间存在保守的基因顺序,表明尼罗罗非鱼、是人类、的直系同源基因,系统进化以及蛋白质相似性表明尼罗罗非鱼是的旁系同源基因。虽然尼罗罗非鱼与人类之间不存在明显的保守基因顺序,但是尼罗罗非西南大学硕十学位论文鱼的蛋白序列与

43、人类的蛋白序列最相似,表明尼罗罗非鱼阳,是人类粥,的直系同源基因。在人类中,与基因在号染色体上相邻,但是在尼罗罗非鱼中,基因却是与在 上相邻图。尼罗罗非鱼/亚家族包括、和。保守的基因顺序表明尼罗罗非鱼是人类的直系同源基因。尼罗罗非鱼有两个同源基因,系统发生和共线性表明是人类的直系同源基因,而是人类的旁系同源基因图。昆罗罗非鱼/,亚家族包括、瓤在腆、与尼罗罗非鱼、基因座位之间都存在明显的保守基因顺序。系统进化以及蛋白质相似性分析表明尼罗罗非鱼、分别是人类粥,、的直系同源基阻。砥、是、的旁系同源基因图。第章尼罗罗仁鱼家族成员的分离及生物信息学分析彰刀取. ./ 、,.盂:?叫?一丑%】如.、 ?:

44、 , .勃:玉/ /:.件.:.: /。 工, ”.知:一撒:疋缸加:缸奎譬矗矗加/: 寸,.、,. .启. 鲞/免曲, 、】.、: ./ 缸/., 矗,象譬 . 竹 三 .:耵 .:加袅届哐 加:似知呦. :. :矗 靠 ? 矗. :,.:。 ,:籼两南大学硕十学位论文图人类染色体以及尼罗罗非鱼连锁群或上家族基因座位图谱。基因图谱是使用 :/.本实验室构建尼罗罗非鱼基因组本地构建。横线长度不代表基因之间的距离。基因名称是基于网站的描述。共线性分析使用到的尼罗罗非鱼基因的同源关系由系统发生分析确证。这些基因序列是从我们实验室建立的尼罗罗非鱼性腺转录组数据中获得。红色标注的基因代表尼罗罗非鱼。.

45、:人类染色体,.:尼罗罗非鱼连锁群,.:尼罗罗非鱼。.。:/. . . .:,.: ,.:.尼罗罗非鱼家族基因性腺转录组分析通过对本实验室前期所测孵化后天、天、天、 天、性腺共计个转录组的分析我们发现,在尼罗罗非鱼性腺发育的不同时期,共有个成员表达于性腺中图、图。从孵化后天开始表达,其在雌性的表达高于雄性,并于孵化后天达到最高,随后略有降低;在孵化后天即开始表达,在天时达到最高,雄性略高于雌性:从孵化后天即开始在雌性表达,随着个体的发育,在雄性的表达逐渐升高并高于在雌性的表达;在孵化后天即高表达,但没有明显的性差;也在孵化后天即开始表达,雄性高于雌性,在孵化后天、天雄性以及天雌性也有少量表达;

46、从孵化后天开始表达,雄性高于雌性,在 天时雌性高于雄性;仅在孵化后天雌雄性腺以及天的雄性性腺少量检测到:从孵化后天即开始表达,雄性中表达低于雌性,孵化后天在雌性中达到最高值;在孵化后天的雄性性腺中有较高表达,而在孵化后天和天的雌性性腺中没有检测到;从孵化后天开始表达,孵化后天雌性略高于雄性,其他时间雄性高于雌性并于孵化后天达到最高;从孵化后天开始表达,孵化后天雄性略高于次性,其他时间雌性高于雄性并于孵化后天达到最高:最早在孵化后天的雌性性腺表达,随后在雄性出现表达并高于在雌性的表达;从孵化后天即被检测到,其在雄性的表达一直高于雌性,并于孵化后天达到最高值;铀从孵化后天开第章尼罗罗角.家族成员的

47、分离及生物信息学分析始表达,雄性远高于雌性,随后有所降低,但在雄性的表达一直高于雌性:粥,从孵化后天即开始少量表达,孵化后天在雌性的表达达到最高峰,雄性一直处于较低水平;删最早在孵化后天雌性性腺表达,随后在雄性开始出现表达,并于孵化后天达到最高;在早期雌性高于雄性,随后雄性高于雌性;粥砣从孵化后天即开始表达,早期处于较低水平,随后雌性迅速升高一直到孵化后天,而雄性一直处于较低水平;仅表达于孵化后天性腺以及天雄性性腺;在雄性的表达一直高于雌性,在孵化后天的雄性性腺最高图。为了更加直观地分析,我们还比较了同一时期所有在性腺表达的腓基因的表达情况。孵化后天,粥在雄性的表达量最高,粥,和次之;在雌性的

48、表达量最高,其次是;其它在这一时期要么不表达,要么表达水平处于很低的水平。孵化后天,在雄性的表达量依旧最高, 次之;在雌性的表达也是最高,和次之,其它都处于较低的水平。孵化后天,许多在雌性的表达迅速升高,如、:/:/:而在雄性大多处于较低水平。孵化后天,、和在雌性的表达水平依旧很高,而铀在雄性的表达略有升高,其它都处于较低水平图。两南大学硕十学位论文:;.二 :,夕夕 ,夕夕爹夕夕夕夕夕 ,翻哆:葛: 一:.:爹夕夕夕夕夕 矿爹夕夕夕夕 夕夕夕, 昭崛怫,.:. :.,夕夕夕夕 ,夕夕夕 ,夕夕。,:嚣;.懿:. 艺辨呓. .,夕夕 夕,夕 ,夕夕夕. 域 :。鄞:. :醛:. ,哺。.夕,夕

49、夕夕夕 夕,夕夕爹夕,夕夕多,硼, , 删轼 嘴.三三芎 嚣; 悖。.夕,夕夕夕夕夕爹,夕夕岁 夕夕夕夕夕夕夕阳,”,:.夕,夕夕夕夕 夕夕,夕夕爹圈基于尼罗罗非鱼性腺八个转录组的尺铲家族表达模式。代表每一百万读数中每一千碱基对的读数;,孵化后天:,孵化后天;,孵化后夭 ,孵化后天:,孵化后天:,孵化后天.,孵化后天;,孵化后天.蛳 .脚;,【. ; ;伽 ;蛐;:;取;飘飙第章尼罗罗非鱼家族成员的分离及生物信息学分析蒌驹釉一? ?.弛肌.?。?.:”?.,一 ”?二”竺.二梦:柚譬釉芑柏心?心?.兰兰.”舯一譬誓.? ?二二二”二.叭。兰帅。坐一.盟圈通过转录组分析比较尼罗罗非家族成员在孵化后天、天、如夭和夭的表达水平。注释同图.,卯 ,. 锄叫湖.。两南大学硕十学位论文