制备生物柴油用小球藻的油脂富集培养研究

1、Oct. 200836现代化工M odern Chemical Industry 第28卷增刊(2 2008年10月制备生物柴油用小球藻的油脂富集培养研究齐沛沛, 王飞(南京林业大学化学工程学院, 江苏南京210037摘要:研究了培养温度、光照强度、氮源及其氮含量对小球藻Chlorella spp 的生长、油脂含量及脂肪酸的影响, 以期获得最为适宜的富含油脂微藻的培养条件。采用比生长速率评价微藻的生长状况, 以溶剂浸提法提取微藻中的油脂, 并采用气质联用和气相色谱分析微藻的脂肪酸组成。研究结果表明, 既能使微藻Chlorella spp 良好生长又可提高其油脂含量的培养条件为:温度25、光照强

2、度3500lux 、添加氮源硝酸钠并使其含氮质量浓度为0125g/L , 此时的油脂含量可达4317%。微藻脂肪酸的组成以C160、C180、C182为主, 表明小球藻的主要脂肪酸组成为C16和C18脂肪酸。关键词:Chlorella spp ; 微藻油脂; 脂肪酸组成中图分类号:Q945;Q949193文献标识码:A:0253-( -04Study on oil spp for biodiesel production2pei , WANG Fei(Engineering , Nanjing F orestry University , Nanjing 210037, China Abstr

3、act :The factors that affecting the growth ,lipid content and the fatty acid composition of microalgae Chlorella spp , are investigated in this paper to determine the optimum culture condition. These factors include culture temperature , light intensity and nitrogen s ources. G rowth rate is used to

4、 evaluate the growth of Chlorella spp ,microalgae oil is extracted by s olvent extraction method ,and the fatty acid composition is analyzed by G C 2MS and G C. The results show that the optimum culture conditions of Chlorella spp are :temperatureof 25,light intensity of 3500lux ,and NaNO 3as nitrog

5、en s ource and N content of 0125g/L. Under the optimum conditions ,the lipid content of microalgae is up to 4317%.The major components of fatty acids in Chlorella spp are C16and C18fatty acids.K ey w ords :Chlorella spp ; microalgae oil ; fatty acid composition生物柴油生产的最大瓶颈是原料问题, 因此寻找新的资源, 开发潜在的生物柴油生产

6、新原料成为生物柴油产业发展的重要途径。微藻尤其是海洋微藻, 不仅资源丰富, 而且细胞内一般富含油脂, 是一种具有较好应用前景的生物柴油生产潜在新原料。利用微藻加工制备生物柴油的关键是如何通过优化培养尽可能提高微藻细胞的油脂含量。在单细胞微藻的培养过程中, 培养基成分、温度、光照强度、pH 、培养方式、通气量、盐度等均会影响微藻的生长以及其脂肪酸的含量与组成。温度、光强能影响微藻的光合作用和呼吸作用, 从而对其生长及体内生化成分产生影响1-4, 在极端高温或低温条件下, 微藻合成油脂的量都会减少5-6, 可能是相关的酶发生不可逆损伤所致, 文献7-10报道证实了这一点; 培养基中氮源对微藻的生长

7、及脂肪酸的影响也收稿日期:2008-10-10极为显著, 单胞藻对不同氮源的吸收速度与利用程度是有差别的11-12, 可能是酶功能的差异造成了各种微藻利用氮能力的差异, 结果也支持了藻类对氮盐喜好和利用能力存在差异的观点 13-18。为了探讨用于生物柴油生产的微藻油脂富集培养, 本文对小球藻Chlorella spp 在不同培养温度、光照强度、氮源及氮含量条件下的生长状况和其油脂含量及脂肪酸组成进行了研究, 以得到富含油脂的微藻藻株及其培养条件。1实验部分111实验用菌种小球藻Chlor ella spp 购自中国科学院海洋研究所。112微藻的培养与采收接种前, 为防止藻种污染, 培养用的工具

8、与器皿基金项目:国家“948”重大引进创新项目(2006-4-C05 ; 南京林业大学科研创新基金项目作者简介:齐沛沛(1983- , 女, 硕士生; 王飞(1962- , 男, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事天然产物化学、生物质能源与化学品研究, 通讯联系人hgw f . cn 。2008年10月齐沛沛等:制备生物柴油用小球藻的油脂富集培养研究37都经过严格的灭菌。将培养至对数生长期的微藻于Allegra X-22R 离心机中离心, 弃去上清液后, 在浓缩藻液中加入少量新鲜培养基, 混匀后量取一定量的藻液转接至新鲜配置的培养基, 培养基采用

9、BG 11培养基, 并通过测定其吸光值来调控其初始接种密度。将新鲜藻液置于光照培养箱中静置培养, 每天振摇34次, 光暗周期为12h 12h , 培养温度有20、25、30、354个水平, 光照强度分2500、3500、4500lux 3个水平, 并分别添加氮源NaNO 3或NH 2C ONH 2, 使培养基的氮质量浓度分别为010625、01125、01250、01375g/L , 以探讨不同培养温度、光照250, 离子源温度为250, 载气为氦气, 流速018m L/min , 分流比为1/10, 进样量1L 。(2 气相色谱定量分析采用氢氧化钾-甲醇法进行油脂甲酯化后, 利用气相色谱法定

10、量分析脂肪酸组成百分含量。气相色谱仪为SHI M ADZ U G C-14B , 采用色谱柱为DB -5毛细管柱(30m ×0132mm , 0125m , 程序升温:150恒温1min , 以3/min 升温速率升至250并保留2min 。进样口温度为250, 氢火焰离子检测器(FI D , 载气为高纯氮, 氮气压力1kg/cm 2; 氢气流量50m L/min , 空气流量50m L/min , 分流比为1/10, 进样量1L 。强度及氮源添加量对微藻生长、油脂含量及脂肪酸组成的影响。采用离心法采收微藻,3500r/min 5min , 30h , 取出后保存于4113211微藻

11、脂肪酸组成的确定气相-质谱联用技术用于确定微藻脂肪酸组成, 将微藻进行油脂提取后的样品, 采用氢氧化钾-甲醇室温甲酯化法进行油脂甲酯化, 所得样品进行气质联用分析, 结果如图1所示, 各个色谱峰的保留时间与其所对应的脂肪酸种类如表1所示。采用紫外可见分光光度仪测定微藻溶液在540nm 处的吸光值(OD 540 。比生长速率可用来评价微藻在一定时期内的总体生长情况。该指标的计算以浊度法测定的吸光值为基础, 如公式:=(ln N T -ln N 0 /T其中为比生长速率, N 0为接种时藻液在540nm 处的吸光值, N T 为培养T 天后藻液在540nm 处的吸光值。在该研究中, 平均生长速率以

12、微藻在8天内的平均比生长速率计, 即T =8。114油脂的提取采用溶剂浸提法, 提取溶剂为石油醚、乙醚混合溶液(体积比为21 ,40条件下浸提5h 。将充分研磨的干燥粉加入提取溶剂, 期间适当振荡混匀, 待提取结束后, 加入质量分数10%的氢氧化钾溶液沉淀微藻细胞, 摇匀静止一段时间后, 将混合溶液在6000r/min 转速下离心10min , 收集上清液于已恒重的离心管中, 于60水浴中迅速蒸去多余的溶剂, 称量, 计算油脂含量。115脂肪酸组成分析(1 气相色谱-质谱联用定性分析图1微藻甲酯化产品, 脂肪酸甲酯的气质联用气相色谱图从图1可以看出, 微藻的脂肪酸组成很复杂, 但主要的脂肪酸组

13、成有10种, 由表1可知, 主要的饱(和脂肪酸有C140,C160,C180“”前的数字是脂肪酸的碳数, 之后的数字为含的碳碳双键数, 下同 , 其中还有极其微量的C150,C170; 不饱和脂肪酸主要为C161,C162,C163,C181,C182,C183,C205。据研究报道(W ood 1988, Dunstan 1992, Zhukova &Aizdaicher 1995 , 绿藻纲微藻常含有表1气相色谱中主要脂肪酸所对应的相对保留时间脂肪酸种类相对保留时间/min 脂肪酸种类相对保留时间/minC1408134C18 018188C16013136C18118109C16

14、112175C18217188C1621214C18318104C16312153C20522145微藻样品经提取油脂后, 采用氢氧化钾-甲醇室温甲酯化法进行油脂甲酯化, 所得脂肪酸甲酯进行气-质联用分析, 以确定微藻中主要脂肪酸组成。采用Finnigan G C-MS Trace DC Q 进行分析, 色谱柱为DB -5(0125mm ×30m ×0125m , 程序升温:150恒温1min , 以3/min 升温速率升至250并保留2min 。进样口温度为250, 气化室温度为38现代化工第28卷增刊(2由表2可知, 藻株Chlorella spp 的油脂含量受温高浓度

15、的C16和C18脂肪酸, 而C20和C22不饱和脂肪酸则缺乏, 本研究的结果与之相一致。212温度和光照强度对微藻生长、油脂含量与脂肪酸组成的影响温度和光照强度是影响微藻生长的极为重要的环境因子, 不同的培养温度和光照强度下所得到的微藻平均生长速率、油脂含量和其脂肪酸组成如图2和表2所示。度的影响是极其显著的。相同光照强度下, 在2035的范围内, 都呈现出先增大后减小的趋势, 在25时微藻的油脂含量最高。早期研究报道6,19,在极端高温或低温的情况下, 微藻油脂的合成量会减少, 研究指出极端温度下合成受限可能是相关的酶发生不可逆损伤所致。在微藻油脂含量最高的培养温度25下, 藻株Chlore

16、lla spp 亦随光照强度的变化而改变, 当光照强度为3500lux 时, 其油脂含量达到了最大值, 在2500lux 处的油脂含量也略大于其在4500lux 处的油脂含量spp 的脂肪酸00, 即以饱和脂肪酸为主。, 主要脂肪酸的种类不变, 而含量会图2Chlorella 有所增减。随着温度的升高, 饱和脂肪酸的百分含量略有减小, 而不饱和脂肪酸C162、C182、C183所占的比例则略有增加。随着光照强度的增加, 饱和脂肪酸C160和C180的含量均有明显的增加, 而不饱和脂肪酸C182、C161、C162、 C163、C205等的比例都有减小, 这与李荷芳等的报道相一致20。213氮源

17、及其含量对微藻生长、油脂含量与脂肪酸小球藻Chlorella spp 在培养温度为25时, 达到了最大的平均生长速率。由图2可知, 小球藻在2035均能够正常生长, 在同一光照强度下, 小球藻的平均生长速率随着温度的升高而先增加后降低, 在25得到了最大的平均生长速率, 即为其生长的适宜温度。在培养温度为25时, 小球藻Chlorella spp 的平均生长速率均随光照强度的增加而增大, 适宜的微藻Chlorella spp 生长的光照强度为35004500lux 。表2温度和光照强度对微藻Chlorella spp 油脂含量和脂肪酸组成的影响2500lux3500lux4500lux组成的影

18、响氮元素是单细胞微藻生长发育必需的元素之一, 微藻通常可以利用铵盐、硝酸盐及尿素等作为其氮源。单胞藻虽对这些盐类都能吸收与利用, 但在吸收的速度与利用的程度上是有差别的11-12。在该研究中, 首先选取NaNO 3和NH 2C ONH 2作为氮源来考察其对小球藻Chlorella spp 生长和油脂含量、脂肪酸组成的影响, 结果如图3和表3所示。202530352025303520253035C140318811210212310019217417注:表中“”表示脂肪酸含量极微或未检测出, 下表同。图3氮源及其氮含量对小球藻Chlorella spp生长的影响2008年10月齐沛沛等:制备生物

19、柴油用小球藻的油脂富集培养研究39由图3可以看出, 添加氮源的小球藻Chlorella spp 的平均生长速率均大于不添加氮源的藻液。以NaNO 3为氮源时, 小球藻Chlorella spp 的平均生长速率随着氮含量的增加而减小, 而在含氮质量浓度为010625g/L 与01125g/L 时, 微藻的平均生长速率基本相当; 以NH 2C ONH 2为氮源时, 小球藻Chlorellaspp 的平均生长速率随着氮含量的增加而先增大后脂肪酸为C160和C180, 即以饱和脂肪酸为主, 而不饱和脂肪酸以C161、C182为主; 而以尿素为氮源时, 其主要脂肪酸亦为C160和C180, 但其C180

20、的比例有所下降, 而不饱和脂肪酸中C181所占的比例有所增加。而在所有考察的条件中, C205所占的比例均很小, 但随着添加氮量的增加而会略有增加。减小, 在氮质量浓度为01125g/L 时达到最大值。在同一氮含量的条件下, 小球藻Chlorella spp 在以NH 2C ONH 2为氮源时的生长速率更大, 这也说明NH 2C ONH 2是更为适宜的氮源, 其最适宜的氮质量3结论(1 将微藻生长的最适条件与富集油脂的最佳浓度为01125g/L 。表3氮源及其氮含量对小球藻Chlorella spp 的油脂含量及脂肪酸组成的影响L -1脂肪酸无添加硝酸钠尿素氮源01062501125油脂含量/

21、%C140C160C161C162C163C180C181C182C183C2055144510421034101254317条件综合考虑, Chlorella spp 适宜的培养条件为:温度25、光照强度3lux L 1的研究发现, 培养条件对脂肪酸主要组成成分的种类没有明显影响, 但是各个主要组分的百分含量会随培养条件的改变而有相应的改变。Chlorella spp 的主要脂肪酸为C160、C180、C182, 表明小球藻的主要脂肪酸组成为C16和C18脂肪酸。参考文献1Renaud S M ,Zhou H C ,Parry D L , et al . E ffect of tem per

22、ature on thegrowth ,to tallipid content and fatty acid com position of recently is olated tropical microalgae 7:595-602.2Zhu C J ,Lee Y K,Chao T M , et al. Diurnal changes in gross chemicalcom position and fatty acid profiles of Isochrysis galbana in outdoor closed tubular photobioreactors J.J M ar

23、Biotech , 1997(5 :153-157.3M ortensen S H ,Rainuzz o J R , K nutsen G, et al. Fatty acid and elemen 2tal com position of the marine diatom Chaetoceros gracilissch ütt. E ffects of silicate deprivation ,tem perature and light in tensityJ.J Exp M ar BioEcol ,1988,122:173-185.4Thom ps on P A ,Harr

24、is on P J ,Whyte N C. In fluence of irradiance on thefatty acid com position of phytoplankton J.J Phycol ,1990,26:278-288.5Aarons on S L. E ffect of incubation tem perature on the macrom olecularand lipid content of the phytoflagellate Ochrom onas danicaJ.Phycol , 1973,9:111-113.6Opute F I. S tudies

25、 on fat accumulation in Nitzschia palea J.Ann Bot ,1974,38:889-892.7M ortens on S H ,Borsheim K Y,Rainuzz o J K. Fatty acid and elementalcom position of the marine diatom Chaetoceros gracilis Schutt. E ffects of silicate deprivation ,tem perature and light intensity J.Exp M ar. Biol Ecol ,1988,122:1

26、73-185.Isochrysis sp. , Nitzschiaclosterium , Nitzschia 2paleacea ,and commercial species Isochrysis sp J.Appl Phycol ,1995,813019013211117117616由表3可知, 在不添加氮源的情况下, 微藻的油脂含量均最大, 且达到了45%, 在曹春晖等21关于小球藻的油脂含量研究中小球藻的油脂含量一般为8%27%, 而该研究出现的高脂肪含量可能正是由于低氮培养条件造成的脂肪积累现象。微藻Chlorella spp 以硝酸钠为氮源的油脂含量均高于以尿素为氮源的油脂含量,

27、 其中当硝酸钠的添加质量浓度为0125g/L 时, 微藻的油脂含量最高; 而添加尿素为氮源的4个水平中, 以添加量为01125g/L 时的油脂含量最高。故与其适宜的生长条件相结合, 选择添加硝酸钠, 氮质量浓度为0125g/L 。同时, 由表3可知, 藻株Chlorella spp 的主要脂肪酸组成为C160、C182、C180、C161。当不添加氮源时, 其主要脂肪酸为C160和C182, 两者所占总脂肪酸的70%以上; 以硝酸钠为氮源时, 其主要(下转第41页2008年10月刘锦超等: 红薯淀粉浆在水解过程中的黏度41体, 其分子量在5万20万之间, 相当于2001200个葡萄糖分子聚合而

28、成。支链淀粉是以-1,4糖苷键连接为主, 同时还有2%4%通过-1, 6糖苷键连接而成的D -葡萄糖的聚合体, 其中-1, 4糖苷键连成的链作主链, 在主链上通过-1,6糖苷键形成众多的侧链。支链淀粉的分子量在20万60万之间, 相当于130036000个葡萄糖聚合而成。直链淀粉分子和支链淀粉分子的侧链趋向平行排列, 相邻羟基间经氢键结合成散射状结晶性“束”(micelles 的结构, 称为双螺旋结构。颗粒中水分子也参与氢键结合, 淀粉分子间有的是由水分子氢键结合, 水分子介于中间, 有如架桥。氢键的强度虽然不高, 但数量众多, 结晶束具有一定强度, 故淀粉具有较强的颗粒结构。结晶束间区域分子

29、排列没有平行规律, 较杂乱, 为无定形区, , 骨架作用。淀粉颗晶颗粒体积的25%50%, 其余为无定形区。结晶区和无定形区并没有明确的界限, 变化是渐进的。1895年Meyer 最早提出的淀粉颗粒模型。1969年Nikuni 7根据直链淀粉是和支链淀粉结合而存在的设想提出淀粉粒的单分子主张。1984年Lineback 8在此基础上进行改进, 主要是基于支链淀粉分子为“簇”的概念, 而直链淀粉则随机或呈螺旋结构而存在, 这取决与颗粒中脂类物质, 因为大多数谷类淀粉存在着这类物质。而Ostergetel 和van (上接第39页8Seto A ,W ang H L ,Hesseltine C W

30、 , et al. Culture conditions affect e 2icosapentaenoic acid content of Chlorella minutissima J.Jaocs ,1984, 61(5 :892-894.9Renaud S M ,Zhou H C ,Parry D L , et al. E ffect of tem perature on thegrowth ,total lipid content and fatty acid com position of recently is olated tropical microalgae Isochrys

31、is sp. et al J.Applied Phycology ,1995,7:595-602.10周洪琪,Renaud S M ,Parry D L , 等. 温度对新月菱形藻、铲状菱形Bruggen 9认为, 结晶区是由连续的超分子螺旋结构的支链淀粉组成, 螺旋结构中有许多空隙, 可以容纳直链淀粉分子。尽管直链淀粉的分支有时出现在无定形区, 但科学家发现支链之间极易形成双螺旋结构。1997年G allant 等10提出淀粉颗粒中有晶体(坚固的壳体 颗粒状结构物(blocklets , 根据不同的淀粉类型及在颗粒中的定位, 其直径范围为20500nm , 这种结构与半晶体(软壳体 小颗粒状

32、结构物(2050nm 交替出现。小颗粒(约9nm 厚 又由交替出现的晶型和非晶型层组成。笔者认为, 淀粉颗粒内存在两种组成及性质不, , , 它们在X 射线衍。这对DSC 曲线上出现的双峰熔融现象作出很好的解释。当淀粉颗粒含水量在平衡水分以下时, 随着含水量的改变, 链链衍射晶峰的强度和面积基本保持不变, 而链水衍射晶峰的强度和面积则随着含水量的增减而增减。另外当淀粉颗粒分散在常温水分散系中时含水量在平衡水分以上时, 尽管只发生了轻度的可逆溶胀, 其分子团簇的能量结构性质发生了根本性质变化, 导致但淀粉颗粒原有的结晶结构已收到很大程度的破坏, 而且这种破坏作用对链链结晶结构和链水结晶结构的影响基本上是一致的。因此如果在特定的酶作用而无势垒的情况下可以进行常温下的水解。logical consequences of brown tides in U. S. mid 2Atlantic coastal waters J.Limnol Oceanogr ,1997,42(5 :1023-1038.15沈颂东. 氮素对小球藻生长的影响J.水利渔业,2003,23(2 :55-57.16Y ongmanitchai W ,W ard O P. Omega 23fatty acids :Alternatives ourcesof productionJ.Process Biochem ,1