粘性放线菌菌毛生物性能的研究Ⅰ.粘性放线菌菌毛的提取和鉴定

1、    粘性放线菌菌毛生物性能的研究.粘性放线菌菌毛的提取和鉴定        摘要 目的:本实验旨在建立一套提取和鉴定粘性放线菌菌毛的方法。方法:采用粘性放线菌变异株5519(1+2-)和5951(1-2+)分别提取型菌毛和型菌毛。首先用机械搅动法分离菌毛与菌体,进一步用凝胶过滤柱层析提取、纯化两种菌毛,并通过电镜观察和对流免疫电泳进行初步鉴定。结果:证实分别提取到型菌毛和型菌毛。结论:两种菌毛的提取为进一步分析研究它们的生化特征和生物活性奠定了基础。关键词 粘性放线菌 菌

2、毛A Study on the Biological Properties of Fimbriae of Actinomyces viscosus. The Preparation and Determination of Fimbriae of A. viscosusLi Wen, Liu Tianjia, Yue SonglingCollege of Stomatology, West China University of Medical SciencesZhang Chongjie, Zhao ChongrongCollege of Basic Medical Sciences, We

3、st China University of Medical SciencesAbstract Objective: To build up the methods to prepare and determine the fimbriae of A. viscosus. Methods: Type 1 and 2 fimbriae were prepared from A. viscosus 5519 and 5951 respectively. Fimbriae were isolated from bacteria cells by mechanical shaking, obtaine

4、d by collecting the supernatant after centrifugation, and purified by ammonium sulfate precipitations and gel fitration. Results: Electron microscope showed that fimbriae existed in the preparations. The immunological reaction between the fimbriae preparations and specific antibodies against fimbria

5、e attested that they were type 1 or type 2 fimbriae. Conclusion: The present study become a foundation for further study on the biological properties of fimbriae of A. viscosus.Key words: Actinomyces viscosusfimbriae粘性放线菌(以下简称粘放菌)与龋病(尤其是根面龋)以及牙周病的发生均有关1,2。其致病作用的首要条件是它对宿主的粘附和定居。众多研究结果表明3,4,粘放菌表面的菌毛与粘

6、放菌的粘附有关。粘放菌有两种功能及抗原性不同的菌毛:型菌毛和型菌毛。随着对粘放菌粘附机理的深入研究5,6,认为菌毛上存在与粘附有关的蛋白质,即粘结素。目前,对粘放菌菌毛上粘结素的结构与成分尚不清楚。为了深入研究两种菌毛的生物性能,以及菌毛上的粘结素,提取粘放菌菌毛成为研究的起点。目前,国内尚未见这方面的报道。本实验旨在建立一套提取和鉴定粘放菌菌毛的方法。1 材料和方法1.1 实验材料粘放菌5519(1+2-)和5951(1-2+)由上海第二医科大学口腔医学研究所刘正教授惠赠。抗型菌毛和抗型菌毛的多克隆抗体由美国Florida大学Nesbitt教授惠赠。凝胶过滤柱Sepharose 6B由美国S

7、igma公司提供。1.2 细菌的培养和收集选用胰蛋白胨大豆琼脂(TSB)非选择性厌氧菌培养基。37厌氧培养(80%N2,20%CO2),经形态染色、生化鉴定及血清学鉴定符合标准后,纳入实验菌株。根据两种菌毛的生物学性能的差异,确定5519只有型菌毛,5951只有型菌毛。将粘放菌5519、5951分别接种于TSB固体培养基上,37厌氧培养48小时,用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)洗下平板上的细菌,分别离心收集两种细菌(3000 r/min,10分钟),再加入0.01 mol/L PBS缓冲液。1.3 菌毛的分离参照机械搅动法7,8分离菌毛与胞壁。在4冰箱内,磁力搅拌器搅拌菌悬液

8、5分钟,4高速离心(12000×g,20分钟),收集上清液。将细菌沉淀按上述过程再处理1次。合并2次离心的上清液,为菌毛粗提物。1.4 菌毛的提纯用20%饱和硫酸铵沉淀上清液4,9,4高速离心(16000×g,30分钟),沉淀用少量0.01 mol/L PBS缓冲液溶解,并用相同的缓冲液反复透析2天,收集蛋白溶液,即为初步纯化菌毛。贮存于-20冰箱内备用。预先用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)平衡Sepharose 6 B柱。将1.5 ml初步纯化菌毛蛋白上样,用同样缓冲液洗脱(5 ml/h),收集样品(2 ml/管)。紫外线分光光度计测定每管OD280 n

9、m值,计算机绘制洗脱谱。合并电镜观察到含有菌毛的组分,即为部份纯化菌毛。冷冻干燥。将部份纯化菌毛溶于1.0 ml缓冲液中,再次上样,按上述方法经Sepharose 6 B柱层析进一步分离纯化。1.5 菌毛的鉴定1.5.1 电镜观察 参照Clark等、刘正等10,11介绍的方法观察菌毛在处理前后的细菌表面及不同阶段提取物中存在与否。1.5.2 免疫学鉴定 采用对流免疫电泳法鉴定。抗原为型或型菌毛的粗提物、部份纯化菌毛和纯化菌毛。抗体为抗型菌毛或抗型菌毛的多克隆抗体。2 结 果2.1 菌毛的提取结果粘放菌5519、5951培养48小时后,电镜观察可见菌体表面有长短不一的菌毛(1)。机械搅动2次后,

10、菌体表面菌毛基本消失,菌体完整(2)。说明本实验采用的方法使菌毛与菌体间有最大程度的分离。1粘性放线菌菌体表面有长短不一的菌毛a.粘放菌5519EM ×60000b.粘放菌5951EM ×250002粘放菌机械搅动后菌体表面菌毛消失，菌体完整a.粘放菌5519EM ×40000b.粘放菌5951EM ×40000粘放菌5519的菌毛粗提物FI经Sepharose6B第1次柱层析分离得到2个洗脱峰(3),电镜观察到第1个峰F(I,1)有菌毛;粘放菌5951的菌毛粗提物F经柱层析也有2个洗脱峰(4),第1个峰F(,1)有菌毛。3 粘放菌5519菌毛粗提物F的

11、Sepharose6B柱层析谱1 F(,1),2 F(,2)4 粘放菌5951菌毛粗提物F的Sepharose 6 B柱层析谱1 F(,1),2 F(,2)部份纯化菌毛F(,1)和F(,1)分别经Sepharose 6 B再次分离纯化(5,6)。因为F(,1)和F(,1)经过冷冻干燥,对菌毛的形状有影响,所以电镜观察再次纯化的洗脱峰,未见明显的菌毛。5 F(,1)的Sepharose 6 B柱层析谱 A F(,1,1)6 F(,1)的Sepharose 6 B柱层析谱 B F(,1,1)2.2 免疫学鉴定结果型及型菌毛提取物的对流免疫电泳结果见7,8,结果说明F、F(,1)、F(,1,1)中含

12、有型菌毛;F、F(,1)、F(,1,1)中含有型菌毛。7型菌毛提取物的对流免疫电泳实验A：粗提物F1B：部分纯化物F(,1)C：纯化物F(,1,1)D：抗型菌毛抗体8型菌毛提取物的对流免疫电泳实验A：粗提物FB：部分纯化物F(,1)C：纯化物F(,1,1)D：抗型菌毛抗体3 讨 论分离并提取完整而纯化的菌毛是深入研究粘放菌菌毛生物性能的关键。为此,国外许多学者采用了不同的方法分离和提取粘放菌菌毛。归纳步骤为:细菌培养,菌毛的分离,菌毛的初步提纯和进一步提纯及鉴定。菌毛的分离是一项关键步骤。总结国外已采用的菌毛分离方法,有4种:匀浆法8,French压榨机压挤法9,10,酶解法和超声法4。本实验

13、结合匀浆法8以及牙龈类杆菌等细菌菌毛的分离法7,采用机械搅动法分离菌毛与胞壁。仪器要求不高,操作简便。细菌经过2次处理后,电镜观察菌毛有最大程度的分离。这一结果与Masuda等8实验结果一致。本实验采用Sepharose 6B凝胶过滤层析对菌毛进行分离纯化。凝胶过滤是根据蛋白质的分子大小不同进行分离。凝胶过滤具有分离条件温和,实验重复性高,完成操作时间相对较短等优点。本实验通过2次柱层析以分离纯化菌毛。含菌毛的洗脱峰出现位置与国外同样条件下洗脱谱上菌毛出现的位置基本一致8。研究早期,国外通过电镜观察到菌毛,没有细胞、细胞器及碎片4,8,10,12。当制备出抗型菌毛和抗型菌毛的抗体后,则采用免疫

14、学方法鉴定10,13。本实验结合上述两种方法,首先电镜观察处理前、后粘放菌表面菌毛存在的情况,确定菌毛已脱落。进而,通过电镜观察确定部份纯化组分F(,1)和F(,1)含有菌毛。免疫学鉴定则确定再次纯化得到的洗脱峰F(,1,1)、F(,1,1)分别含有型菌毛和型菌毛,同时证实粗提物、部份纯化组分中含有菌毛。比较两种鉴定方法,电镜观察直观,但国内存在价格高,仪器技术条件不稳定等因素的影响。免疫学鉴定准确简便,但国内尚需制备出抗两种菌毛的抗体。关于型菌毛、型菌毛的提取,Cisar等14用粘放菌T14V作为抗原,制备出抗型菌毛的单克隆抗体。Cisar和Clark等1,9偶联此单克隆抗体制备一个亲和层析

15、柱,从而分别收集到型菌毛和型菌毛。此外,也可通过只有型菌毛和只有型菌毛的变异株来分别提取型或型菌毛15,16。本实验采用后一种方法提取到型菌毛和型菌毛,为进一步分析研究两种菌毛的生化特征和生物活性奠定了基础。本研究为国家自然科学基金资助项目(编号 39270717)作者单位:(李 文,刘天佳,岳松龄)610041 华西医科大学附属口腔医院,(章崇杰,赵崇蓉) 基础医学院参考文献1Firestone AR, Feagin FF, Heaven TJ, et al. In vitro demineralization by strains of Actinomyces viscosus and S

16、treptococcus sobrinus of sound and demineralized root surface. J Dent Res, 1993, 72(8):118011832Burckhardt JJ, Gaegauf-Zollinger R, Schnid R, et al. Alveolar bone loss in rats after immunization with Actinomyces viscosus. Infect Immun, 1981,31(3):9719773Clark WB, Wheeler TT, Lane MD, et al. Actinomy

17、ces adsorption mediated by antibody type 1 fimbriae. J Dent Res, 1986, 65(9):116611684Cisar JO, Curl SH, Kolenbrander PE, et al. Specific absence of type 2 fimbriae on a coaggregation-defective mutant of Actinomyces viscosus T14V. Infect Immun, 1983, 40(2):7597655Nesbitt WE, Beem E, Leung KP, et al.

18、 Adherence inhibition of Actinomyces viscosus by a monoclonal antibody to type 1 fimbriae-associated adhesive proteins. Abstr 69th Gen Meet Int Assoc Dent Res, 1991:3176Leung KP, Nesbitt WE, Stroup S, et al. Immunogold labeling of fimbriae-associated proteins mediating Actinomyces viscosus adherence

19、. Abstr 69th Gen Meet Int Assoc Dent Res, 1991:3177Ogama T, Shimanchi H, Hamada S. Mucosal and systemic immune responses in BALB/C mice to Bacteroides gingivalis fimbriae administered orally. Infect Immun, 1989, 57(11):346634718Masuda N, Ellen RP, Grove DA, et al. Purification and characterization o

20、f surface fibrils from taxonomically typical Actinomyces viscosus WVU 627. J Bacteriol, 1981, 147(3):109511049Wheeler TT, Clark WB. Fibril-mediated adherence of Actinomyces viscosus to saliva-treated hydroxyapatite. Infect Immun, 1980, 28(2):57758410Clark WB, Webb EL, Wheeler TT, et al. Role of surf

21、ace fimbriae (fibrils) in the adsorption of Actinomyces species to saliva-treated hydroxyapatite surfaces. Infect Immun, 1981, 33(3):90891711关为群,刘 正.口腔粘性放线菌菌毛的电镜观察.口腔医学纵横,1995,11(2):737512Cisar JO, Vatter AE. Surface fibrils (fimbriae) of Actinomyces viscosus T14V. Infect Immun, 1979, 24(2):52353113Crawford PC, Clark WB. Fimbriae-specific antibodies in serum and saliva of mice immunized Actino