轻工业微生物实验指导书

1、编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第11页 共11页实验一 培养基的制备与灭菌技术一、试验原理马铃薯中含有淀粉、蛋白质、脂类及多种维生素经煮沸后可把这些营养成分从中溶出以供酵母和霉菌生长需要，加入葡萄糖或蔗糖以补充微生物所需的碳源。此培养基为半合成培养基。二、实验目的：1、掌握培养基的制备方法，2、学会高压蒸汽灭菌技术。三、实验材料和仪器：1、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂。2、烧杯、漏斗、试管、三角瓶、量筒、玻璃棒、纱布、棉花、细绳、牛皮纸、试管架、培养皿。3、手提式高压蒸汽灭菌锅、天平、电炉。四、实验方法与步骤：（1）选无芽、无腐烂的马铃薯、洗净、削皮、称4

2、0g切碎加水200ml,放入1000ml烧杯中煮沸0.5hr、冷却用纱布过滤去渣。（2）在清液中加入4g葡萄糖溶解补水至200ml，此时到入一试管10ml。余下溶液加3.8g琼脂加热熔化。（3）试管分装：取玻璃漏斗装在漏斗架上，漏斗下连一橡胶管，与玻璃管嘴相接，橡皮管上夹一弹簧夹，培养基倒入漏斗，通过弹簧夹控制培养基的流量。（4）余下的培养基分装在两个250ml的三角瓶中。（5）高压蒸汽灭菌：把溶解完的培养基用棉塞塞上并用牛皮纸把棉花包住，在121，0.1Mpa下灭菌20min即可，灭菌时要注意放净阀气。取出灭菌物品时一定要等到压力降到零时打开灭菌锅盖。（6）斜面摆放：将分装灭菌后的琼脂培养基

3、试管置于水平放置的试管上，凝固后即成斜面。（7）培养皿培养基的倾倒：先用酒精棉球擦拭桌面及双手,在靠近酒精灯火焰的上方把冷却到45左右的培养基倒入培养皿内，每只倒入15ml左右。注意：温度太低培养基会凝固。五、思考题：1培养基配制好后为什么要灭菌？2蒸汽灭菌应注意几个问题？为什么？实验二 微生物接种和无菌操作技术一、实验目的1、了解无菌操作在微生物接种过程中的重要性，掌握无菌操作的基本环节。2、掌握几种常用微生物的接种方法，为微生物的形态观察作准备。二、实验材料1、菌种 （1）细菌 大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,(2)酵母 酿

4、酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,(3)霉菌 黑曲霉（Aspergillus niger）2、培养基（1）肉汤培养基 固体斜面培养基，液体培养基，半固体培养基，固体培养基。（2）PDA培养基 液体培养基，斜面培养基，固体培养基。3、接种工具 接种针，接种钩，接种环。4、酒精灯，标签纸，火柴，镊子，75%酒精棉球，试管架，电炉，铝锅，无菌平皿。三、实验方法与步骤1、斜面接种 用接种环在肉汤斜面培养基上划密波蜿蜒曲线接种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，在PDA培养基斜面上用划直线和点接的方法分别接种酵母菌和霉菌。2、液体接种：用接种环在肉汤培养基液体中接种细菌，在PDA液体培养基

5、中接种酵母菌。液体接种时取一环菌苔，沿管壁轻轻擦下菌苔，塞上棉塞轻摇试管。3、穿刺接种：在肉汤培养基上接种细菌，在PDA培养基上接种酵母菌。4、平板接种：分别在不同的培养基平板上点接不同的菌种。四、结果记录1、斜面接种（1）检查斜面接种情况、绘制斜面生长草图。（2）分析斜面接种好坏的原因（3）保留斜面、以便观察形态时使用。2、液体接种观察记录细菌、酵母的液体培养特征，保留酵母液体培养液备用。3、穿刺接种（1）检查穿刺接种效果，绘制草图。（2）叙述不同微生物穿刺培养后的现象及原因。（3）分析穿刺接种好坏的原因。4、平板接种（1）检查平板接种的生长状况，有无污染（凡没接种地方长出菌落均为染菌）。（

6、2）描述各个菌落的特征。实验三 显微镜的使用、微生物观察和菌体大小测定一、实验原理 应月显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，得出细胞的大小。 镜台测微尺系一特制的载玻片（图13），它的中央是一具有刻度的标尺，全长为1mm，共划分为10大格，每一大格又分成10小格，每一小格长0.01mm，即10um。也有全长为2mm，共分200小格，每小格的长度不变。在标尺的外围有一小黒环，以便找到标尺的位置。 图13镜台测微尺 目镜测微尺是放在目镜内的一种标尺，它有固定式和移动式两种类趔。固定式目镜测微尺为一块圆形玻璃片，直径为2021mm，如图14所示。在

7、它的上面刻有各种形式的标尺，有为直线式的（图1一4A），有为网式的（图14B）通常用以测量长度的标尺为直线式的，一般为5mm，分成5大格，每一大格分成10小格，共计50小格。也有用同样长度分为100小格的。网式目镜测微尺主要用以计算数目和测量物体的面积。在它上面刻有方格的网状标尺。方格的大小和数目各有不同，有25、36和49格，也有的一个正方形大格中划分100个方格，在中央的一个方格中再划分25个小方格。ABCD 图14目镜测微尺 A.直线式 B.网式 C.移动式（外形） D.移动式（内部） 移动式目镜测微尺基本上和直线式目镜测微尺相似，所不同的是除了泣种固定的标尺外，还有可以移动位置的指示线

8、。它装在一个特别的目镜中右边由一个能旋转的小轮控制着，轮上有刻度，分成100格，该轮每旋转一圈，目镜内能移动的指示线就从标尺一端向另一端移动格。 显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格代表的长度，然后才能用目镜微尺来测量细胞的长度。二、实验目的：1、学会测微尺的使用和计算方法。2、掌握酵母菌细胞体积的测定方法三、实验材料和仪器：1菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）上次实验的液体培养物2盖玻片、载玻片、显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺、酒精灯、生理盐水、吸水纸。3擦镜纸、滤纸条、镊子、无菌吸管、酒精棉球。 四、实验方法与步骤 测微尺的使用操作 1、卸下目镜的

9、上透镜将目镜测微尺有刻度一面向下装在回镜镜面上，再旋上目镜上的透镜。 2、将镜台测微尺有刻度的一面朝上放在载物台上夹好，使测微尺刻度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的刻度。 3、小心移动镜台测微尺和目镜测微尺（如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦），使两尺左边的“0”点直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线（图15）。 4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格的长度等于多少um 目镜测微尺每格的长度（um）镜台测微尺的格数目镜测微尺的格数X100123450.00.10.20.30.40.60.50.70.80.91.0图l5 目镜测微尺

10、的标定上，目镜测微尺；下，镜台测微尺例如，图15中，在低倍镜下所标定的目镜测微尺的全长（50格），等于镜台测微尺70格，则目镜测微尺每小格代表的长度则为：目镜测微尺每格的长度（um）7050X1014 取下镜台测微尺，换上要测量的玻片标本，用目镜测微尺测量细胞长度的格数，乘以每格的um数，即为细胞的实际长度。 如用不同倍数的物镜与目镜时，就需重新计算，方法同前。 在测量时应注意将被测量的标本移到视野中心，因为在这个位置上镜像最清晰像差也最小，为减少误差在测量同一物体时，要重复3次以上，再取其平均值还需注意视野中的亮度应均匀一致，以免影响测量值的准确性。 根据长度测量结果可计算细胞的体积。公式如

11、下： 椭圆形V4ab2/3（a,b为长短轴的半径） 圆球形V4r3/3（r为半径）5、酵母菌大小的测定 （1）取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片。 （2）测量菌体的长轴和轴各占目镜测微尺的格数，然后换算出菌体的实际长度。 （3）在同一标本上测量510个酵母细胞，取其平均植。6、酵母菌体积的测定 用显微测微尺测量并换算出酵母菌的长轴和短轴的实际长度后，代入公式求出酵母菌的体积V。 五、实验结果1、在低倍镜下：目镜测微尺（ ）格镜台测微尺（）格，目镜测微尺每小格（ ）um;2、在高倍镜下：目镜测微尺（ ）格镜台测微尺（）格，目镜测微尺每小格（ ）um。3、酵母细胞长=目镜侧微尺（ ）格=（ ）微米。

12、酵母细胞宽=目镜侧微尺（ ）格=（ ）微米。酵母菌细胞体积=（ ）um3。六、思考题1、为什么采用不同放大倍数目镜和物镜时，必须重新用镜台测微尺对目镜测微尺进行标定？2、若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么，目镜测微尺每格所测量的酵母的实际长度（或宽度）是否相同？为什么？ 实验四 酵母菌细胞计数法及酵母出芽率的测定一、实验目的：1、了解血球计数板的构造和使用方法。2、学习并掌握利用血球计数板对酵母菌细胞数进行测量和酵母出芽率的测定。二、实验材料和仪器： 1、菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）上次实验的液体培养物2、盖玻片、载玻片、显微镜、血球计数板、酒

13、精灯、滤纸条、无菌吸管、酒精棉球、擦镜纸等。三、实验方法与步骤： 1. 血球计数板的构造:测定微生物生长量的方法很多，对酵母来说有两大类：总菌计数和活菌计数，分别称为直接和间接法。总菌计数是利用血球计数板在显微镜下直接计数，立即得到数值，是死细胞和活细胞的总和；活菌计数是计算活菌在平皿上形成的菌落数，费时较长。本实验利用血球计数板对酵母直接计数，计数的同时统计出出芽率。血球计数板由四条平行槽而构成三个平台，中间平台较宽，并分为两部分，每部分均刻有长和宽各1mm的方格网，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的体积为0.1mm3。常用血球计数板有两种规格。一种16x25型，称为麦氏血球计数

14、板，共有16个大格，每个大格又分为25个小格；另一种是25x16型，称为希里格式血球计数板，共25个大格，每一大格又分为16个小格。无论 是哪一种血球计数板，都有一共同特点，即计数室的小格数相同，均为400个。其结构见下图。0.01mm1/400mm2 XB-K-25计数板盖玻片中央平台2.酵母菌细胞计数：(1).检查血球计数板是否有杂质和菌体，若有用脱脂棉蘸取95%酒精轻轻擦洗计数板的计数室，用蒸馏水冲洗计数板，用滤纸吸干其上水分，勿用火烤，最后用擦镜纸揩干净。(2).样品稀释：稀释的目的在于便于计数，稀释要求每小格内45个细胞，一般稀释10倍。（3）加样：先将盖玻片置于计数室上，用吸管吸取

15、一滴稀释好的菌液滴于盖玻片边缘，让菌液自行渗入，多余的菌液用滤纸吸去，稍待片刻，待酵母细胞全部沉降到计数室底部在进行计数。(4).计数 将加好样品的计数板放到显微镜载物台中央，按下列步骤寻找计数室并计数。 找计数室 先用低倍物镜寻找到大方格网位置。寻找时，显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗，然后顺着大方格移动计数板，使计数室位于视野中间。 转换高倍镜 转至高倍物镜后，适当调节光亮度，使菌体和计数室线条清晰，然后将计数室一角的小格移至视野中。 计数 16x25型 取左上、右上、左下、右下四大格共100小格内的细胞逐一进行计数； 25x16型 取左上、右上、左下、右下和中间五大格共80小格进行计数

16、，计数时遇到位于大格线上的酵母菌时，只计大格上方及右方线上的细胞（或只计下方及左方线上的细胞），将细胞数填入格中 对每个样品重复三次，取平均值，计算酵母菌细胞数。（5）计算公式：25x16: 细胞数/ml=(80小格细胞总数÷80)x400x10x1000x稀释倍数16x25: 细胞数/ml=（100小格细胞总数÷100）x400x10x1000x稀释倍数 (6) 清洗 计数板使用完毕后，用蒸馏水冲洗，绝不能用硬物洗刷，洗后待其自行晾干或用滤纸吸干，最后用擦镜纸揩干净。若为病原菌，则浸泡在5%石炭酸溶液中消毒后再清洗。3.酵母出芽率的测定：（1） 同上步骤数出酵母的出芽数并

17、填在上面表格中（一般需平行计数三次）。（2）观察酵母菌出芽率时，遇到芽体大于细胞本身50%时不作为芽体计数，而作为酵母数计数。（3）计算公式：酵母出芽率=（芽体数÷酵母菌细胞总数）x100%四、 实验结果细胞总数测定表格：计数次数各大格中的细胞数大格中细胞总数稀释倍 数细胞浓度（个/ml）芽体数左上 右上 右下 左下 中间第一次第二次第三次平均值三次测定结果：每毫升菌液中酵母细胞数平均值_。酵母细胞出芽率的测定计算次数总酵母细胞数芽体数出芽率（%）第一次第二次第三次 三次测定结果平均值：出芽率_%五、思考题：1、试述计数板的计数原理。为什么用两种不同规格的计数板来计数同一样品，结果是

18、一样的？2、试分析酵母计数时应注意的问题和影响计数准确的原因。应如何尽量减少误差，力求准确？实验五 微生物的分离技术一、实验原理 枯草芽孢杆菌的多数种都能产生大量的淀粉酶、蛋白酶，因此比较容易分离得到。目前市场上销售的细菌淀粉酶、蛋白酶就是利用枯草芽孢杆菌生产的，所以它是重要的工业用菌之一。 由于芽孢具有较强的抗高热能力，分离纯化时可以采用热处理的方法。七原理是，通过高温加热处理，杀死其中所有不生成芽孢的菌类，在培养过程中，使芽孢得到很好得富集。利用该菌产酶的特性，选择分别以淀粉、酪蛋白为主要碳源的分离培养基。因酶的水解作用会使菌落周围均出现清晰的透明圈。根据透明圈的直径（C） 与菌落直径（H

19、）之比可初步鉴定酶活力，即C/H比值越大，酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。 二、实验目的学习并掌握枯草芽孢杆菌的分离纯化技术三、实验材料 1.样品 含有机质较丰富的土壤。 2.培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，淀粉培养基，酪素培养基。牛肉膏蛋白胨培养基(150ml)：牛肉膏0.5，蛋白胨1，NaCl 0.5，pH7.27.4，121灭菌20min淀粉培养基(60ml)：牛肉膏0.5，蛋白胨0.5，NaCl0.5，可溶性淀粉2，琼脂1.82。pH7.2，121灭菌30min酪素培养基(60ml)：磷酸二氢钾0.036,七水硫酸镁0.05，氯化锌0.0014，七水磷酸氢二钠0.107，NaCl0.

20、016，氯化钙0.0002，硫酸亚铁0.0002，酪素0.4，琼脂2。pH值6.57.0，121灭菌20min。 3.试剂 0.02mol/l碘液，无菌水。 4.仪器 平面皿，吸管，三角瓶，无菌信封，无菌纱布，玻璃珠，摇床，涂布器。四、实验方法与步骤 1.采样 到园田用无菌小铲采集离地面515cm深处的土壤若干，装入无菌信封中，记录时间、地点、植被和环境情况。 2. 分离 取土样1g于250ml无菌三角瓶中，内加99ml无菌水及数粒无菌玻璃珠，置摇床上振荡510分钟，用无菌纱布过滤收集滤液。 3. 富集培养 取5ml滤液接于牛肉膏蛋白胨培养液中（250ml三角瓶中装有150ml培养液），置入8

21、090水浴中，加热1015分钟，记录处理时间。然后30振荡培养24小时，镜检。4. 倾注分离 将培养液再经一次热处理后，以10倍稀释法适当稀释，取最后三个稀释度的稀释液各1ml于无菌平皿中，每稀释度平行两个皿。5. 融化淀粉琼脂培养基与酪素琼脂培养基，冷却至50倾入上述各皿，轻轻摇匀，凝固后30培养2448小时。6.挑菌落 蛋白酶菌株 可直接观察在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈，挑C/H比值大的接入斜面培养基，培养备用。 淀粉酶菌株 可取0.02mol/l碘液滴加在淀粉平板中的菌落周围，观察形成透明圈的结果。挑C/H比值大的接入斜面培基，培养备用。7.纯种鉴定 染色后，在显微镜下观察，利用细

22、胞形态及菌落形态进行鉴别。8.纯化 将选定的菌株，采用平板分离纯化法。五、思考题 1、仔细分析以上菌种筛选和纯化步聚试述菌种分离成功的关键因素。 2、采用以上方法是否能够分离筛选出青霉素抗性菌。实验六 微生物染色（或发酵实验）微生物细胞含水量大，对光线的吸收和反射与水溶液对光线的吸收和反射差别较小，与背景没有明显的明暗差别，因此，对微生物的观察除观察活体微生物的运动性和直接计算菌体数外，绝大多数情况下都必须经过染色，才能在显微镜下进行观察。但在染色和制片过程中，微生物的形态和结构均发生一定程度的改变，不能完全代表其生活细胞的真实情况。在实际操作中要根据观察目的不同，选用不同的染色和制片方法。

23、一、染色的基本原理微生物染色的基本原理，是借助于物理因素（细胞和细胞质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等）和化学因素（细胞物质和染料性质不同而发生的各种化学反应）对微生物作用来进行的。如呈酸性的细胞核物质易于被碱性染料染色。但是，要使酸性物质染上酸性染料，必须改变它们的化学形式，才有利于吸附作用的发生。相反碱性染料也如此。细菌的等电点较低，pH25之间，在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷；碱性染料电离时带正电荷，因此，在细菌染色时常用碱性染料进行染色。影响染色的因素：菌体细胞的构造、外膜的通透性、培养基的组成、菌龄、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等。二、染料及种

24、类（一）染料的性质染料大多是一种含有苯环的机化合物，能使其它物质牢固地着色。大都有苯环、发色基团（色基、呈色团）和助色基团（或作用基团）组成。若苯环上只连接发色基团，它虽然能呈色，但不能作为染料，因为它不能电离，与细胞的亲和力差，与细胞的结合不牢固，用水一冲便可除去。有了助色基团，就具有了能够电离的性质，能够和适当的物质结合为盐类。带有正或负电荷的染料离子就能与细胞牢固地结合，使其呈色，所以苯环必须连接呈色和助色两个基团后才能作为染料使用。颜色是发色基团所致，染色性则由助色基团决定。（二）染料的种类根据染料电离后染料离子带电荷的性质，分为酸性、碱性、中性（复合）和单纯染料四大类。1、酸性染料：

25、电离后染料粒子带负电，可与碱性物质结合成盐。如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等。2、碱性染料：电离后染料粒子带正电，它们与酸性物质结合成盐。如美蓝、结晶紫、碱性复红、番红、孔雀绿和甲基紫等。2、中性（复合）染料：酸性染料与碱性染料的结合叫中性（复合）染料。如瑞脱氏染料和基姆萨氏染料等。三、制片与染色（一）制片在干净的载玻片上滴一滴蒸馏水或无菌水，用接种工具进行无菌操作，取少许培养物，置于水滴中做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层。也可在玻片的另一端加一滴水对第一次的悬液进行稀释使菌体分布均匀减少重叠，否则会使染料大面积堆积，不利于观察。（二）干燥涂片最好是使其自然干燥，也可手持载玻片

26、菌体面向上在酒精灯的火焰高处微微加热，以防标本烤枯而使菌体变形。（三）固定采用高温固定，即手持载玻片快速从在酒精灯火焰外层来回通过3-4次，约2-3秒钟，不断用以载玻片接触皮肤，温度不超过60，待冷却后，进行染色。如果观察的微生物不适宜采用此法应采用化学方法固定。（四）染色采用合适的染色剂把固定后的标本全部浸在染色液中进行染色1-3分钟之间。（五）水洗用细小的水流洗掉多余的染料，获得清晰的视野以利于观察。（六）干燥将洗干净的标本晾干或用吸水纸吸取多余的水，烘干后备用。一、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦医生Gram创立的一种重要的细菌鉴别方法。其机理是利用G+和G-菌细胞壁的组成成分和结构的的不同。G-的细胞壁中含有较多的类脂质和较少的肽聚糖。当用乙醇或丙酮脱色时，类脂质被溶解，增加了壁的通透性是染料的复合物易于渗出，细胞脱色，复染后呈现出复染的染料颜色。G+的肽聚糖含量高，类脂质少，乙醇或丙酮洗脱时，肽聚糖层的孔径变小，通透