化学生物学-第三章 酶

1、1Enzyme第第 三三 章章 酶酶Enzyme2一、酶的概念一、酶的概念v目前将生物催化剂分为两类目前将生物催化剂分为两类酶酶 、 核酶（脱氧核酶）核酶（脱氧核酶）n酶是一类由酶是一类由活细胞活细胞产生的，对其产生的，对其特异特异底物底物具有具有高效催化作用高效催化作用的的蛋白质蛋白质。3简史简史v公元前两千多年，我国已有酿酒记载。公元前两千多年，我国已有酿酒记载。v一百余年前，一百余年前，PasteurPasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。结果。v18771877年，年，KuhneKuhne首次提出首次提出EnzymeEnzyme一词。一词。v1897

2、1897年，年，BuchnerBuchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。了发酵。v19261926年，年，SumnerSumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。v19821982年，年，CechCech首次发现首次发现RNARNA也具有酶的催化活性，提出也具有酶的催化活性，提出核酶核酶(ribozyme)(ribozyme)的概念。的概念。v19951995年，年，Jack W.SzostakJack W.Szostak研究室首先报道了具有研究室首先报道了具有DNADNA连连接酶活性接酶活性DNADNA片段，称为片段，称为脱

3、氧核酶脱氧核酶(deoxyribozyme)(deoxyribozyme)。4酶是生物催化剂酶是生物催化剂v酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂分子，所以又称为生物催化剂(b(biocatalysts） v 绝大多数的酶都是蛋白质。绝大多数的酶都是蛋白质。v 酶催化的生物化学反应，称为酶促反应酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（Enzymatic reaction）。）。v 在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（substrate）。）。5二、酶的分类与命名 酶的分类酶的分类v 根据酶

4、所催化的反应类型，按照国际酶学根据酶所催化的反应类型，按照国际酶学委员会，将酶分为六大类：委员会，将酶分为六大类：61 氧化氧化-还原酶还原酶 Oxidoreductasev氧化氧化- -还原酶催化氧化还原酶催化氧化- -还原反应。还原反应。v主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenase)(dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(Oxidase)(Oxidase)。 乳酸乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。7CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH82 转移酶转移酶 Transferasev转移酶催化

5、基团转移反应，即将一个底物分转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。9CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO103 水解酶水解酶 hydrolasev水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。v主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。v例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化

6、的脂的水解反应：11H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH124 裂解酶裂解酶 Lyasev裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。子形成双键的反应及其逆反应。v主要包括醛缩酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶及脱氨酶等。ABA+B135 异构酶异构酶 Isomerasev异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。底物分子内基团或原子的重排过程。v常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类和变位酶类146 合成酶合成

7、酶 Ligase or Synthetasev合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类反应必须键的形成反应。这类反应必须与与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。vA + B + ATP + H-O-H =A A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi B + ADP +Pi v例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。v 丙酮酸丙酮酸 + CO + CO2 2 草酰乙酸草酰乙酸15三、酶的化学本质v一、蛋白质v二、核酸16v单体酶单体

8、酶(monomeric enzyme)(monomeric enzyme)： 由由单条肽链单条肽链构成构成,仅具有三级结构的酶。仅具有三级结构的酶。v寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)： 由由多个相同或不同亚基多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。以非共价键连接组成的酶。v多酶体系（多酶体系（multienzyme system)multienzyme system)： 由由几种不同功能的酶几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。彼此聚合形成的多酶复合物。17 (multienzyme system) (multienzyme sys

9、tem)： 由由几种不同功能几种不同功能的酶的酶彼此聚合形成的多酶彼此聚合形成的多酶复合物。复合物。v多酶体系多酶体系18酶的分子组成酶的分子组成蛋白质部分：酶蛋白蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme)(apoenzyme)辅助因子辅助因子(cofactor) (cofactor) 金属离子金属离子小分子有机化合物小分子有机化合物全酶全酶(holoenzyme)(holoenzyme)单纯酶单纯酶 (simple enzyme)(simple enzyme)结合酶结合酶 (conjugated enzyme)(conjugated enzyme)19* *各部分在催化反应中的作用各部分在催

10、化反应中的作用J酶蛋白酶蛋白决定反应的决定反应的特异性特异性J辅助因子辅助因子决定反应的决定反应的种类与性质种类与性质 金属酶金属酶(metalloenzyme)(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。失。 金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme)(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。不甚紧密。 20 金属离子的作用金属离子的作用稳定酶的构象；稳定酶的构象； 参与催化反应，传递电子；参与催化反应，传递

11、电子；在酶与底物间起桥梁作用；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用小分子有机化合物的作用在反应中起运载体的作用，传递电子、在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团。质子或其它基团。21小分子有机化合物在催化中的作用小分子有机化合物在催化中的作用辅酶辅酶前体维生素前体维生素功能功能全酶全酶NADNAD+ +（辅酶（辅酶I I）NADP+(NADP+(辅酶辅酶II)II)B B5 5（烟酰胺）（烟酰胺）传递质子和电子传递质子和电子脱氢酶脱氢酶FADFAD和和EMNEMN（黄素辅酶）（黄素辅酶）B B2 2（核

12、黄素）（核黄素）传递质子和电子传递质子和电子脱氢酶脱氢酶TPPTPP（硫胺素焦磷酸酯（硫胺素焦磷酸酯B B1 1（硫胺素）（硫胺素）基团转移基团转移脱羧酶脱羧酶四氢叶酸四氢叶酸(THFA)(THFA)B B1111( (叶酸叶酸) )一碳基团转移一碳基团转移合成酶合成酶辅酶辅酶A AB B3 3( (泛酸泛酸) )酰基转移酰基转移合成酶合成酶生物素生物素B B7 7( (生物素生物素) )COCO2 2转移转移羧化酶羧化酶磷酸吡哆素磷酸吡哆素B B6 6（吡哆素）（吡哆素）转氨基转氨基转氨酶转氨酶辅酶辅酶B B1212B B1212（钴维素）（钴维素）异构化异构化变位酶变位酶硫辛酸硫辛酸传递氢

13、和转移乙酰基传递氢和转移乙酰基丙酮酸脱氢酶系丙酮酸脱氢酶系泛醌（辅酶泛醌（辅酶Q Q）传递质子和电子传递质子和电子氧化氧化- -还原酶还原酶22辅助因子分类辅助因子分类（按其（按其与酶蛋白结合的紧密程度与酶蛋白结合的紧密程度） 辅酶辅酶 (coenzyme):(coenzyme):与酶蛋白结合与酶蛋白结合疏松，可用疏松，可用透析或超滤的透析或超滤的方法除去。方法除去。 辅基辅基 (prosthetic group):(prosthetic group):与酶蛋白结合与酶蛋白结合紧密，紧密，不不能用能用透析或超透析或超滤的方法除去滤的方法除去。23辅酶的作用辅酶的作用1 1l氨基氨基-磷酸吡哆醛

14、磷酸吡哆醛(Vit B6)(Vit B6)l羧基羧基-生物素生物素(biotin)(biotin)、维生素、维生素K Kl一碳单位一碳单位-四氢叶酸四氢叶酸(folic acid)(folic acid)l甲基甲基-维生素维生素B B1212l酰基酰基-辅酶辅酶A A、硫辛酸、硫辛酸24辅酶的作用辅酶的作用 2l质子（氢原子质子（氢原子 ）转移）转移:lFAD+ FADH2lNAD+ NADH + H+lNADP+ NADPH + H+25辅酶在酶促反应中的作用特点辅酶在酶促反应中的作用特点v辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。v每一种辅酶都具有特殊的功

15、能，可以特定地催化某每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型的反应。一类型的反应。v同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。的全酶。v一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。类型（底物专一性）。26四、酶的结构与功能的关系27酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心28必需基团必需基团(essential group)(essential group)酶分子中氨基酸残基侧

16、酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化与酶活性密切相关的化学基团。学基团。29活性中心内的必需基团活性中心内的必需基团v结合基团结合基团 binding groupv催化基团催化基团(catalytic group)催化底物转催化底物转变成产物变成产物活性中心外的必需基团活性中心外的必需基团位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。间构象所必需。30或称或称活性部位活性部位(active site)(active site)，指必需，指必需基团在一级结构上可能相距遥远，但在空间基团在一级结构上可能相距

17、遥远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的特定空间结构的区域区域，能，能与底物特异结合与底物特异结合并并将底物转化为产将底物转化为产物物。酶的活性中心酶的活性中心(active center)(active center)31活性中心内的必需基团活性中心内的必需基团结合基团结合基团binding group催化基团催化基团(catalytic group)催化底物转变成产物催化底物转变成产物 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。的空间构象所必需。活性中心外的必需基团活性中心外的必需基团32结合部位结合部位

18、Binding site酶分子中与底物结合酶分子中与底物结合的部位或区域一般称的部位或区域一般称为结合部位。为结合部位。33酶与底物的结合部位酶与底物的结合部位34催化部位催化部位 catalytic sitecatalytic site酶分子中促使底物发生化酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化位学变化的部位称为催化位点点。通常将酶的结合部位和催通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部化部位总称为酶的活性部位或活性中心。位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反催化部位决定酶所催化反应的性质。应的性质。35酶活性中心的必需基团酶活性中心的必需

19、基团v主要包括：主要包括：v亲核性基团：丝亲核性基团：丝氨酸的羟基，半氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。组氨酸的咪唑基。H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNH3637五、酶促反应的特点五、酶促反应的特点The Characteristic and Mechanism of Enzyme-Catalyzed Reaction 38酶与一般催化剂的共同点酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，

20、而不改变只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。反应的平衡点。39（一）酶促反应具有高效性（一）酶促反应具有高效性 一、一、 酶促反应的特点酶促反应的特点酶的催化效率通常比非催化反应高酶的催化效率通常比非催化反应高10108 810102020倍，倍，比一般催化剂高比一般催化剂高10107 710101313倍。倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能活化能(activation energy)(activation energy)。酶比一般催化剂。酶比一般催化剂更有效地降低

21、反应的活化能。更有效地降低反应的活化能。 40反应总能量改变反应总能量改变 非催化反应活化能非催化反应活化能 酶促反应酶促反应 活化能活化能 一般催化剂催一般催化剂催化反应的活化能化反应的活化能 能能量量 反反 应应 过过 程程 底物底物 产物产物 酶促反应活化能的改变酶促反应活化能的改变 活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。41一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性酶

22、的特异性或专一性或专一性。* * 酶的特异性酶的特异性(specificity)(specificity)（二）酶促反应具有高度的特异性（二）酶促反应具有高度的特异性42分类：分类：v绝对特异性绝对特异性(absolute specificity)(absolute specificity)：只能只能作用于作用于特定结构的底物特定结构的底物，进行一种专一的反，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物应，生成一种特定结构的产物 。 v相对特异性相对特异性(relative specificity)(relative specificity)：作用作用于于一类化合物或一种化学键一类化合物或一种化

23、学键。v立体结构特异性立体结构特异性(stereo specificity)(stereo specificity)：作作用于用于立体异构体立体异构体中的一种。中的一种。旋光异构特异性旋光异构特异性几何异构特异性几何异构特异性4344 4546（三）酶促反应的可调节性（三）酶促反应的可调节性 对酶生成与降解量的调节对酶生成与降解量的调节 酶催化效力的调节酶催化效力的调节 通过改变底物浓度对酶进行调节等通过改变底物浓度对酶进行调节等酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方

24、面的调节。括三方面的调节。47六、酶促反应的机理六、酶促反应的机理v认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样如同一把钥匙对一把锁一样48六、酶促反应的机理六、酶促反应的机理诱导契合学说诱导契合学说* *诱导契合假说诱导契合假说(induced-fit hypothesis)(induced-fit hypothesis)酶底物复合物酶底物复合物 E + S E + P ESES 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变

25、形和相互适应，进而相互结合。这一过相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶程称为酶- -底物结合的诱导契合假说底物结合的诱导契合假说49E+SP+ EES能量能量水平水平反应过程反应过程 G E1 E250酶酶- -底物复合物的形成底物复合物的形成v在底物在底物S S与酶与酶E E结合之前，二者均处于自由运结合之前，二者均处于自由运动状态，在结合过程中，由于底物与酶分子动状态，在结合过程中，由于底物与酶分子的相互作用产生结合能，结合后，形成高度的相互作用产生结合能，结合后，形成高度有序、底熵的复合物有序、底熵的复合物51脱溶剂化作用脱溶剂化作用 v在酶在酶- -底物复合物底物复合物ES

26、ES形成过程中，酶分子活性中心结合形成过程中，酶分子活性中心结合的水分子和底物分子结合的水分子相继发生脱溶剂化的水分子和底物分子结合的水分子相继发生脱溶剂化作用，脱溶剂化作用增加了作用，脱溶剂化作用增加了ESES复合物的能量，使其更复合物的能量，使其更活泼而容易反应。活泼而容易反应。 52静电不稳定作用静电不稳定作用 v当底物进入酶的活性中心时，底物分子的带电荷基团被当底物进入酶的活性中心时，底物分子的带电荷基团被迫与酶活性中心的电荷相互作用，导致静电不稳定作用，迫与酶活性中心的电荷相互作用，导致静电不稳定作用，底物分子发生扭曲、形变，从而引起反应加速进行。底物分子发生扭曲、形变，从而引起反应

27、加速进行。 5354（三）与酶的高效率催化有关的机制：（三）与酶的高效率催化有关的机制：1.1.邻近效应与定向排列邻近效应与定向排列 2.2.多元催化多元催化：酸碱催化酸碱催化 3.3.表面效应表面效应：防止底物与酶之间形成水化膜：防止底物与酶之间形成水化膜 55a 底物在活性中心聚集，局部微环境浓度底物在活性中心聚集，局部微环境浓度 a 催化基团定向催化反应催化基团定向催化反应56l 接受质子：接受质子：碱碱l 提供质子：提供质子：酸酸l 酶活性中心的某些基团可作为质子的供体或酶活性中心的某些基团可作为质子的供体或受体，从而对底物进行酸碱催化受体，从而对底物进行酸碱催化l 如组氨酸的咪唑基如

28、组氨酸的咪唑基, , 解离常数为解离常数为6.06.0，在生，在生理理pHpH下酸碱形式均可存在，很活跃下酸碱形式均可存在，很活跃l 酸碱催化酸碱催化可参与多种反应，如多肽的水解、可参与多种反应，如多肽的水解、酯类的水解、磷酸基的转移酯类的水解、磷酸基的转移2. 2. 多元催化（多元催化（multielement catalysismultielement catalysis）57l 酶活性中心酶活性中心疏水性疏水性“口袋口袋”l 防止底物与酶之间形成水化膜防止底物与酶之间形成水化膜l 有利底物与酶密切接触有利底物与酶密切接触3. 3. 表面效应表面效应 (surface effect)(su

29、rface effect)58七、七、 酶促反应动力学酶促反应动力学Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction 59q概念概念研究各种因素对研究各种因素对酶促反应速度酶促反应速度的影响，的影响，并加以定量的阐述。并加以定量的阐述。q影响因素包括有影响因素包括有酶浓度、底物浓度、酶浓度、底物浓度、pHpH、温度、温度、抑制剂、激活剂等。抑制剂、激活剂等。 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。60一、底物浓度对反应速度的影响一、底物浓度对反应速度的影响单底物、单产物反应单底物、单产物反应酶促反应速度一般在规定的反应条件下，

30、酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用用单位单位时间时间内内底物的消耗量底物的消耗量和和产物的生成量产物的生成量来表示来表示反应速度取其反应速度取其初速度初速度，即底物的消耗量很小（一，即底物的消耗量很小（一般在般在5 5以内）时的反应速度以内）时的反应速度底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度研究前提研究前提E + SE + S k k1 1k k2 2k k3 3ESESE + PE + P61v 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈应速度的影响呈矩形双曲线关系矩形双曲线关系。当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；

31、反反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。应为一级反应。随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加反应速度不再增加, ,达最大速度达最大速度; ;反应为零级反应反应为零级反应65底物对酶促反应的饱和现象：底物对酶促反应的饱和现象：66（一）米曼氏方程式（一）米曼氏方程式中间产物中间产物酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E + SE + S k k1 1k k2 2k k3 3ESESE + PE + P67SS：底物浓度底物浓度V V：不

32、同不同SS时的反应速度时的反应速度VmaxVmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)(maximum velocity) m m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)(Michaelis constant) V VmaxmaxS S K Km m + S + S 68米米-曼氏方程式推导基于两个假设：曼氏方程式推导基于两个假设：E与与S形成形成ES复合物的反应是快速平衡反应，复合物的反应是快速平衡反应，而而ES分解为分解为E及及P的反应为慢反应，反应速率取决的反应为慢反应，反应速率取决于慢反应于慢反应。即即 Vk3ES (1)S的总浓度远远大于的

33、总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的总浓度，因此在反应的初始阶段，的初始阶段，S的浓度可认为不变即的浓度可认为不变即SSt。 692 2稳态的概念介入米氏方程式的推导过程稳态的概念介入米氏方程式的推导过程 稳态：稳态：是指是指ES的生成速率与分解速率相等，的生成速率与分解速率相等，即即 ES恒定。恒定。 k1 (EtES) Sk2 ES + k3 ESk2+k3 Km （米氏常数）（米氏常数） k1令：令：则则(2)(2)变为变为: : (EtES) S Km ES(2)(EtES)Sk2+k3ES k1整理得：整理得：70将将(3)(3)代入代入(1) (1) 得得k3EtS Km + S

34、 (4) V当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即即EtES，反应达最大速率反应达最大速率Vmaxk3ESk3Et (5)ES EtSKm + S(3) 整理得整理得: :将将(5)(5)代入代入(4)(4)得米氏方程式：得米氏方程式：VmaxS Km + S V 71K Km mSS KKm m值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/Lmol/L。2 2K Km m + S+ S V Vmaxmax V VmaxmaxSSV VmaxmaxS S K Km m +

35、S + S 72（二）（二）K Km m与与V Vmaxmax的意义的意义 K Km m值值 K Km m等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。度。 意义：意义：a)a) K Km m是酶的特征性常数之一；是酶的特征性常数之一； Km Km 只与酶的性质有关只与酶的性质有关, , 与酶的浓度无关与酶的浓度无关b)b) K Km m可近似表示酶对底物的亲和力可近似表示酶对底物的亲和力（反比）（反比）c)c) 同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的KmKm值。值。 确定最合适底物或天然底物确定最合适底物或天然底物73Km是酶的特征

36、性常数是酶的特征性常数 在酶的结构、溶液在酶的结构、溶液pHpH、温度等条件不变的情、温度等条件不变的情况下，酶促反应底物的况下，酶促反应底物的Km不因反应中酶浓度的改不因反应中酶浓度的改变而不同。变而不同。 同一酶对其所催化的不同底物有不同的同一酶对其所催化的不同底物有不同的Km；不同酶对同一底物也有其各自的不同酶对同一底物也有其各自的KmKm的范围多在的范围多在10-610-2mol/L之间。之间。74 6.0 6.0 10 10 3 3己己-N-N-乙酰乙酰2 2葡萄糖胺葡萄糖胺溶菌酶溶菌酶 2.5 2.5 10 10 2 2H H2 2O O2 2过氧化氢酶过氧化氢酶 4.0 4.0

37、10 10 3 3D-D-乳糖乳糖 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 2.5 2.5 10 10 3 3N-N-苯甲酰酪氨酰胺苯甲酰酪氨酰胺 1.08 1.08 10 10 1 1甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 2.6 2.6 10 10 2 2HCOHCO3 3 碳酸酐酶碳酸酐酶 1.5 1.5 10 10 3 3D-D-果糖果糖 5 5 10 10 5 5D-D-葡萄糖葡萄糖 4 4 10 10 4 4ATPATP己糖激酶（脑）己糖激酶（脑） K Km m（mol/Lmol/L） 底物底物 酶酶一些酶的底物的一些酶的底物的Km75Km在一定条件下可表示酶对底物的亲和

38、力在一定条件下可表示酶对底物的亲和力k1Km =k2 + k3当当k k3 3 ESE时，时，V Vmax max = k= k3 3 E E 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 85A A：底物浓度曲线，其中，：底物浓度曲线，其中，EE1 1 E E2 2 E E3 3。从图中可。从图中可知，知， EE的变化不影响酶促反应的的变化不影响酶促反应的Km。B B：反应速率对酶浓度作图，：反应速率对酶浓度作图，V V与与EE呈直线关系。呈直线关系。86q双重影响双重影响温度升高，酶促反应速温度升高，酶促反应速度度升高升高；温度升高温度升高1010o oC, C, 反应反应速度增加一倍速度

39、增加一倍由于酶的本质是蛋白质，由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度从而反应速度降低降低 。 三、温度对反应速度的影响三、温度对反应速度的影响酶酶活活性性0.50.51.01.02.02.01.51.50 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 温度温度 C C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响 87q最适温度最适温度 ( (optimum temperature) )：酶促反应速度最快时的环境温度。酶促反应速度最快时的环境温度。温血动物：温血动物：35354040Taq DNATaq DNA聚合酶

40、：聚合酶：707075 75 可耐受可耐受100100高温高温此酶是从水生栖热菌此酶是从水生栖热菌 Thermus AquaticusThermus Aquaticus（TaqTaq）中分离出的热稳定性）中分离出的热稳定性DNADNA聚合酶，用于聚合酶，用于PCRPCR反应。反应。 88贮存生物制品、菌种等贮存生物制品、菌种等 v低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，但温度升高后，酶活性又可恢复酶活性又可恢复。临床上的低温麻醉临床上的低温麻醉v减少组织细胞的代谢程度，使机体耐受手术时减少组织细胞的代谢程度，使机体耐受手术时氧和营养物质

41、的缺乏氧和营养物质的缺乏 89四、四、 pHpH对反应速度的影响对反应速度的影响 蛋白质的极性基团蛋白质的极性基团 辅助因子的荷电状态辅助因子的荷电状态 底物的解离状态底物的解离状态 而不同的解离状态或直接影响酶与底物而不同的解离状态或直接影响酶与底物的结合的结合, 或影响酶的空间结构或影响酶的空间结构, 从而改变酶的从而改变酶的活力活力90q最适最适pH pH (optimum pH)(optimum pH)：酶催化活性最大酶催化活性最大时的环境时的环境pHpH。多数酶：多数酶：7.07.0左右左右胃蛋白酶：胃蛋白酶：1.81.8肝精氨酸酶：肝精氨酸酶：9.89.80 0酶酶活活性性 pH

42、pH pH对某些酶活性的影响对某些酶活性的影响 2 24 46 68 8101091五、抑制剂对反应速度的影响五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂酶的抑制剂(inhibitor)(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。白变性的物质称为酶的抑制剂。 区别于酶的变性区别于酶的变性 抑制剂对酶有一定选择性抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性引起变性的因素对酶没有选择性92 抑制作用的类型抑制作用的类型不可逆性抑制不可逆性抑制( (irreversible inhibitionirreversible inh

43、ibition) )可逆性抑制可逆性抑制 ( (reversible inhibitionreversible inhibition) )：v竞争性抑制竞争性抑制 (competitive inhibition)(competitive inhibition)v非竞争性抑制非竞争性抑制 (non-competitive (non-competitive inhibition)inhibition)v反竞争性抑制反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition)(uncompetitive inhibition)93( (一一) ) * * 概念概念抑制剂通常以抑制剂通常以与与酶

44、活性中心的必需酶活性中心的必需基团基团相结合，使酶失活。相结合，使酶失活。 * * 举例举例有机磷化合物有机磷化合物 羟基酶羟基酶解毒解毒 - - - - - - 解磷定解磷定(PAM)(PAM)重金属离子及砷化合物重金属离子及砷化合物 巯基酶巯基酶解毒解毒 - - - - - - 二巯基丙醇二巯基丙醇(BAL)(BAL) 94ESSAsCHCHCl+CH2SHCHSHCH2OHESHSH+CH2SCHSCH2OHAsCHCHClROROPOX+HOEROROPOOE+HXClAsClCHCHCl+ ESHSHESAsSCHCHCl+2HCl有机磷化合物有机磷化合物路易士气路易士气失活的酶失活

45、的酶羟基酶羟基酶失活的酶失活的酶酸酸巯基酶巯基酶失活的酶失活的酶酸酸BAL巯基酶巯基酶BAL与砷剂结合物与砷剂结合物95* * 概念概念抑制剂通常以抑制剂通常以非共价键非共价键与与酶或酶酶或酶- -底物复底物复合物合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑抑制剂可用透析、超滤等方法除去。制剂可用透析、超滤等方法除去。竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制 96. . 竞争性抑制作用竞争性抑制作用反应模式反应模式抑制剂与底物的抑制剂与底物的结构相似结构相似，能与底物，能与底物竞争酶的活性中心竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合，从而阻

46、碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。用称为竞争性抑制作用。 97高浓度的底物可解除抑制高浓度的底物可解除抑制98 无抑制剂无抑制剂 抑制剂抑制剂 1/V 1/S 竞争性竞争性I I往往是酶的往往是酶的底物底物结构类似物结构类似物； 抑制剂与酶的结合部位抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的与底物与酶的结合部位结合部位相同相同 酶的活性中心酶的活性中心 抑制作用可以被抑制作用可以被高浓度高浓度的底物的底物减低以致消除；减低以致消除； ( (表观）表观）KmKm值增大，值增大，VmVm值值不变不变99* * 举例举例 丙二酸丙二酸与琥

47、珀酸竞争琥珀酸脱氢酶与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶COOH CH2 CH2COOH COOH COOH CH2 丙二酸丙二酸琥珀酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸延胡索酸100 磺胺类药物磺胺类药物的抑菌机制的抑菌机制与与对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸竞争竞争二氢叶酸合成酶二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氢叶酸二氢叶酸合成酶合成酶二氢叶酸二氢叶酸COOH H2N SO2NHR H2N 磺磺 胺胺 类类 药药 物物 人体细胞的叶酸由食物获得，不受磺胺类药物人体细胞的叶酸由食物获得，不受磺胺类药物的抑制的抑制1012. 2. 非竞争性抑制非竞争

48、性抑制* * 反应模式反应模式I I与酶的活性中心与酶的活性中心外外的位点结合的位点结合102v非竞争性抑制的特点：非竞争性抑制的特点： 非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；分子结构类似； 抑制剂与酶的活性中心外的位点结合；抑制剂与酶的活性中心外的位点结合； 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；度的改变对抑制程度无影响； 抑制程度取决于抑制剂的浓度抑制程度取决于抑制剂的浓度 动力学参数：动力学参数：KmKm值不变，值不变，VmVm值降低值降低。 103抑制剂抑制剂 1 / V

49、 1/S 无抑制剂无抑制剂 104. 反竞争性抑制反竞争性抑制* * 反应模式反应模式v 抑制剂抑制剂不能与游离酶不能与游离酶结合，但可结合，但可与与ESES复复合物结合合物结合105v 反竞争性抑制的特点：反竞争性抑制的特点： 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；分子结构类似； 抑制剂与底物可抑制剂与底物可同时同时与酶的不同部位结合；与酶的不同部位结合； 必须有底物存在必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制，抑制剂才能对酶产生抑制作用；作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加；抑制程度随底物浓度的增加而增加； 抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物

50、的浓度抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度 动力学参数：动力学参数：KmKm减小，减小，VmVm降低降低。106抑制剂抑制剂 1/V 1/S 无抑制剂无抑制剂 107各种可逆性抑制作用的比较各种可逆性抑制作用的比较 动力学参数动力学参数表观表观Km Km K Km m增大增大不变不变减小减小最大速度最大速度V Vmaxmax不变不变降低降低降低降低林林- -贝氏作图贝氏作图斜率斜率K Km m/ / V Vmaxmax增大增大增大增大不变不变纵轴截距纵轴截距1/V1/Vmaxmax不变不变增大增大增大增大横轴截距横轴截距- -1/K1/Km m增大增大不变不变减小减小与与I I 结合的组分结

51、合的组分E EE E、ESESESES作用特征作用特征无抑制剂无抑制剂竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制108六、激活剂对反应速度的影响六、激活剂对反应速度的影响激活剂激活剂(activator):(activator):使酶由无活性变为有活使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。性或使酶活性增加的物质。 必需激活剂必需激活剂 (essential activator)(essential activator) 非必需激活剂非必需激活剂 (non-essential activator)(non-essential activator)109v金属离子：金

52、属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ Co2+、Fe2+ 阴离子：阴离子： Cl-、Brv有机分子有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽谷胱甘肽v金属螯合剂：金属螯合剂：EDTA - v这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用110八、酶的制备v酶的分离纯化：酶的分离纯化：v1、基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液.u2、基本操作程序：u选材：微生物（微

53、生物发酵物: 胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）。u抽提：加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等），u分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。u纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。111同工酶同工酶* * 定义定义同工酶同工酶(isoenzyme)(isoenzyme)是指催化相同是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。性质乃至免疫学性质不同的一组酶。112v国际生化学会：国际生化学会：v由由不同基因或者等位基因不同基因或者等位基因编码的多肽链编码的多肽链v由由同一基因编码同一基因编码，生成不同的生成不同的mRNAmRNA翻译而来的翻译而来的v不包括不包括翻译水平修饰所形成的多分子形式翻译水平修饰所形成的多分子形式v同工酶：同工酶：v通常存在于同一种属或者同一个体的不同组织通