实验五富营养化湖中叶绿素含量的测定

1、实验五富营养化湖中叶绿素含量的测定姓名：叶素芬 学号：22320102201142 同组人：徐凯芳 班级：10环科 实验日期：一 实验目的1. 掌握叶绿素的测定原理及方法2. 评价水体的富营养化状况二 实验方法原理 1.关于水体富营养化富营养化: 富营养化是指生物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其它浮游生物迅速繁殖，水体溶氧量下降，鱼类及其它生物大量死亡的现象。大量水华死亡的水生生物沉积到湖底，被微生物分解，消耗大量的溶解氧，使水体溶解氧含量急剧降低，水质恶化，以致影响到鱼类的生存，大大加速了水体的富营养化过程。水体出现富营养化现象时，由于浮游生物大量繁殖，

2、往往使水体呈现蓝色、红色、棕色、乳白色等，这种现象在江河湖泊中叫水华（水花），在海中叫赤潮。3. 关于叶绿素含量的测定许多参数可用作水体富营养化的指标，常用的是总磷、叶绿素-a含量和初级生产率的大小。 测定水体中叶绿素的含量，可将色素用丙酮萃取，根据叶绿素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即ACL，式中：为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数。各种有色物质在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波

3、长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b、c的含量，只需测定该提取液在三个特定波长(663、645、630nm)下的吸光度A，并根据叶绿素a、b、c在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。附表：表1：湖泊富营养化的叶绿素a评价标准指标类型贫营养型中营养型富营养型叶绿素a浓度（g/L）44-1010-150三 实验试剂和仪器1. 试剂：MgCO3悬液（已配制），90%的丙酮溶液(已配制) MgCO3粉末水样（采样时间：2012年11月29日 采样地点：厦门大学校本部

4、芙蓉湖）2. 仪器： V-1100D可见分光光度计（厂家：MAPADA），比色杯（2cm，2个），马头牌架盘药物天平BP-II型（上海医用激光仪器厂）TG16-WS台式高速离心机（湖南湘异仪器开发有限公司），TMTD-8222 三用恒温水箱（上海精宏实验设备有限公司，MIKRO22R台式冷冻离心机（厂家：HETTICH）塑料离心管（6支），刻度离心管（1支），量筒（100mL，1支，10mL，1支），具塞试管（25mL，1支），移液管（1mL，1支）， 药匙 （1把）， 黑色塑料薄膜，橡皮筋，烧杯（500mL，1个），胶头滴管（数根）、洗瓶（1个）四 实验步骤1清洗玻璃仪器（已由老师完成）2、

5、离心水样：用量筒取水样210mL倒入烧杯中，用1mL移液管移取1.00mL MgCO3悬液，将水样分别装入6支大的塑料离心管中，每支离心管加入35mL。衡重后在4000r/min 的离心机内离心10分钟。 3、提取：去掉上清液时注意要用胶头滴管小心地取出上清液，最下层的液体中仍含有较多的叶绿素，要保留。将沉淀物及残留的上清液转移至具塞试管，加少量碳酸镁粉末和10mL已水浴加热至50的90%丙酮溶液（用90%的丙酮溶液洗涤塑料离心管，尽量转移完全）。塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物（黑色塑料薄膜），充分振荡，置于恒温箱内避光提取4小时。 4、离心：提取完毕后，转移至离心管（注意要转移完全，减少叶绿

6、素的损失），衡重，置于台式离心机上4000r/min 离心20min。取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞紧塞子，4000r/min再离心10min。正确记录提取液的体积V1。5、测定光密度：采用分光光度法测定叶绿素a的含量。将提取液倒入2cm比色杯中，以90%的丙酮溶液作为空白，分别在750、663、645、630nm波长下测提取液的光密度值（OD）。在每次改变波长测定前都要进行调零。在本次实验中，第一次测得的OD750为0.012，不符合标准，进行了第三次离心，4000r/min，再次离心10min。注意：样品提取液的OD750的值应小于0.01，如不在此范围内，应再次进行离心

7、，OD663值要求在0.2与1.0之间，或调换比色杯，或改变过滤水样量。OD663小于0.2时，应该改用较宽的比色杯或增加水样量；OD663大于1.0时，可稀释提取液或减少水样滤过量，使用1cm比色杯比色。6、叶绿素含量的计算：根据公式分别计算叶绿素a、b、c含量五 实验数据记录及计算表:2 测定结果OD750OD663OD645OD630叶绿素a浓度（g/L）叶绿素b浓度（g/L）叶绿素c浓度（g/L）胡蓉湖水样0.0090.2030.0600.04645.093.283.75丙酮提取液的体积：V1=8.80mLu 叶绿素浓度计算公式如下：1、样品提取液中的叶绿素浓度为：Ca（g/L）=11

8、.64(OD663- OD750)-2.16(OD645- OD750)+0.1(OD630- OD750)Cb（g/L）=20.97(OD645- OD750)-3.94(OD663- OD750)-3.66(OD630- OD750)Cc（g/L）=54.22(OD630- OD750)-14.8(OD645- OD750)-5.53(OD663- OD750)说明：将样品提取液在663、645、630nm波长下的光密度值(OD663、OD645、OD630)分别减去750nm下的光密度值（OD750）,此值为非选择性本底物光吸收校正值。2.水样中叶绿素浓度为：叶绿素a（g/L）=（Ca&

9、#215;V1）/(V2×L)叶绿素b（g/L）=（Cb×V1）/(V2×L)叶绿素c（g/L）=（Cc×V1）/(V2×L)式中，Ca样品提取液中叶绿素a浓度(g/L)V190%丙酮提取液的体积(mL)V2离心水样的体积（L）L比色杯宽度(cm),因此，u 样品提取液中的叶绿素浓度为：Ca（g/L）=11.64(OD663- OD750)-2.16(OD645- OD750)+0.1(OD630- OD750)=11.64×（0.203-0.009）-2.16×（0.060-0.009）+0.1×（0.046-0

10、.009）=2.152Cb（g/L）=20.97(OD645- OD750)-3.94(OD663- OD750)-3.66(OD630- OD750)= 20.97×(0.060- 0.009)-3.94×(0.203- 0.009)-3.66×(0.046- 0.009)=0.170Cc（g/L）=54.22(OD630- OD750)-14.8(OD645- OD750)-5.53(OD663- OD750)= 54.22×(0.046- 0.009)-14.8×(0.060- 0.009)-5.53×(0.203- 0.009

11、)=0.179u 水样中叶绿素浓度为：叶绿素a（g/L）=（Ca×V1）/(V2×L)=（2.152×8.80）/(0.21×2)=45.09叶绿素b（g/L）=（Cb×V1）/(V2×L)=（0.170×8.80）/(0.21×2)=3.28叶绿素c（g/L）=（Cc×V1）/(V2×L)=（0.179×8.80）/(0.21×2)=3.75其中，L=2cm,V2=35mL×6=210mL=0.21L, V1=8.80mL六 实验结果及分析1、思考题a)根据你的计

12、算结果判断湖水富营养化程度答：实验测得的叶绿素a浓度为45.09g/L，根据湖泊富营养化的叶绿素a评价标准，该值落在10-150中，因此初步判定该湖泊属于富营养型。即厦门大学校本部芙蓉湖的湖水是富营养型湖水。由于45.09g/L的值不是特别高，因此认为湖水的富营养化程度不是很严重。b)如何保证水样中叶绿素a浓度测定结果的准确性？主要应该注意哪几个方面的问题？答：从叶绿素a浓度测定的计算公式以及实验操作两个方面上看，为保证测定结果的准确性，需要注意几个方面的问题：1、光密度值测定的准确性 2、准确读取丙酮提取液体积 3、离心水样体积要准确 4、玻璃仪器是否清洗干净，实验操作的规范性，是否引入杂质

13、或者其他物质与叶绿素发生反应，注重细节等具体来说，因为在样品提取液中叶绿素a浓度计算时关键点在于样品在各波长下所测定的光密度值是否准确，因此，本实验关键的地方也因包括光密度值的测定，为了保证得到准确的光密度值，需要注意几个问题：1、实验仪器具有良好的灵敏度、精确度和准确度。2、所用的两个比色杯使用之前要进行校准。3.每次改变波长进行测定前都要重新调零。另外，准确的丙酮提取液体积也是实验测定结果准确性的保证。因为离心后得到的提取液体积较少，但提取液溶有需测定的叶绿素，故应准确记录体积，这就要求离心后要小心抓取离心管，不能有大的晃动，实验时要尽可能保证所有的提取液都吸取出来并准确读取体积。同时，离

14、心水样体积的准确性也是需要保证的，因为有离心水样体积才能计算出样品中的叶绿素浓度。本实验中的水样是用量筒取的，精确度相对较低。为尽可能减少误差，在读数时姿势要标准，视线要与凹液面平行。由于在酸性条件下叶绿素a会分解，因此为保证测定结果的准确性，需要特别注意整个实验中所使用玻璃仪器都是干净的。实验操作过程中，要注意细节，如用黑色塑料薄膜包裹具塞试管时要注意包裹完全，不要透光。2、实验误差来源a）仪器本身带来的误差，此误差不可避免，但由于较小，一般可以忽略不计。b）由于操作方法不当带来的误差，如玻璃仪器没有清洗干净，最终可能造成叶绿素a有所损失。使实验结果偏低。C）本实验中在第一次离心后倒去上清液的步骤中将上清液的下层全部倒掉，造成了较多的叶绿素a的损失，使实验的结果偏低。d）本实验中所使用的刻度离心管的刻度精度较差，读取提取液的体积时会有较大的偏差，对实验结果造成了一定影响。e）本实验过程中存在多次的转移，由于未能完全洗涤干净也会造成叶绿素a的损失，使实验的结果偏低。3、其他方面的思考a）用丙酮溶液避光提取时，实验讲义上的时间是4小时，此时间不是硬性要求，而是为了保证提取充分，因此适当延长时间可能对提高实验结果的准确性有帮助。b）将提取完毕