凝胶电泳应用于糖蛋白的分离鉴定 ppt课件

1、二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定目 录糖蛋白1糖基化2凝胶电泳分离纯化技术3基于PAS反应的染色方法4由短的寡糖链与蛋白质共价结合构成的分子。蛋白质含量较多，糖所占比例变动大，表现为蛋白质的特性。细胞膜、溶酶体、细胞外液糖蛋白glycoprotein ）膜蛋白中的糖膜蛋白分子中的糖这些寡糖链常常是具分支的杂糖链，不呈现重复的双糖系列，一般由2-10个单体少于15组成，未端成员常常是唾液酸或L-岩藻糖。 糖蛋白的结构单糖的种类葡萄糖(Glu)半乳糖(Gal)甘露糖(Man)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)岩藻糖(Fuc)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)N-乙酰神经氨酸

2、(NeuAc)连接方式N-衔接：O-衔接：糖蛋白的结构糖基化糖基化糖基化 是蛋白质翻译后修饰最重是蛋白质翻译后修饰最重要的方式之要的方式之一，是必需的生理过程，对蛋白质一，是必需的生理过程，对蛋白质生物学功能的生物学功能的正确发挥起着至关重要的作用。正确发挥起着至关重要的作用。糖蛋白的形成是糖基化的一种表现糖蛋白的形成是糖基化的一种表现形式形式糖基化生物活性折叠溶解度半衰期抗原性蛋白质蛋白质糖链糖链糖蛋白 分离纯化及鉴定是糖蛋白研究分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤的重要步骤糖蛋白的分离纯化方法Capillary electrophoresisCapillary electrophoresi

3、s毛细管电泳毛细管电泳MLCMLC多维液相色谱多维液相色谱electroblottillg电印迹技术gelelectrophoresis凝胶电泳电泳技术的基本原理等电聚焦(Isoelectro focusing IEF)等电聚焦(Isoelectro focusing IEF)等电聚焦(Isoelectro focusing IEF)插入梳子插入梳子加缓冲液加缓冲液加加 样样电泳电泳剥胶剥胶凝胶电泳可直接在胶上对糖蛋白进行酸水解或酶解后进行后续的鉴定分析或糖链的结构分析。可以同时分离多个复杂混合物优势优势双向凝胶电泳二维电泳）双向凝胶电泳二维电泳） 第一向采用等电聚焦第一向采用等电聚焦 根据复

4、杂的蛋白质成根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的分中各个蛋白质的PIPI的不同，将蛋白质进行分离。的不同，将蛋白质进行分离。 第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳 （SDS-PAGESDS-PAGE就是按蛋白质分子量的大就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状状，而是呈现为斑点状 。二维电泳胶性 PH9中电加解入质了溶双液 PH3加上电场后建立稳定PH梯度蛋白质溶液加入，建立电场染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开第一向等电聚焦PI逐渐降低等电聚焦

5、胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上 第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量逐渐降低PI 逐渐降低 双向凝胶电泳示意图双向凝胶电泳示意图二维电泳二维电泳1基于PAS反应的染色方法3GelCode糖蛋白染色试剂盒2硼酸根荧光染料二维电泳中糖蛋白的染色方法基于PAS反应的染色方法PAS-periodic acid-Schiffs base method(高碘酸/过碘酸-席夫式碱方法)原理 在过碘酸的作用下，糖蛋白中糖链上相邻两个碳原子上的羟基被氧化成醛基，醛基再与带有紫外或荧光基团的氨基形成席夫式碱，在紫外或荧光灯下检测即可。席夫式碱N原子和C原子双键结合的一类化合物基于PAS反应的染色方法酸性品红丹酰肼荧光试剂丹磺酰甘氨酰肼荧光试剂Pro-Q Emerald类染料过碘酸作用显紫红色对还有唾液酸的糖蛋白灵敏染色7天灵敏度低g高碘酸作用醛基与胺基反应形成腙染色2天灵敏度低40 ng反应条件苛刻酸性条件灵敏度低10-