食品微生物实验

1、目 录实验一 显微镜的使用与细菌形态构造的观察1实验二 细菌的涂片制备、染色及观察7实验三 真菌制片及形态的观察9实验四 培养基的制备和灭菌10实验五 乳酸菌微生物的分离、纯化和培养13实验六 食品中细菌总数的测定16实验七 食品中大肠菌群的测定19实验八 环境因素对微生物的影响22实验九 细菌的生理生化反应25实验须知 食品微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解食品微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱

2、护公物的良好作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1、每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2、认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。3、实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4、实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸人口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。 5、实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙围等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布

3、或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。6、使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后放回原处。 7、每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5h后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8、每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9、每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填人报告表格中，力求简明

4、准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10、离实验室前将手洗净，注意关闭火、煤气、门窗、灯等。食品微生物实验指导实验一 显微镜的使用与细菌形态构造的观察一、目的要求1、掌握光学显微镜的使用和保护方法2、认识细菌的基本形态与结构二、 显微镜的使用普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大15002000倍。（一）显微镜的构造现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成（图1-1）。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直

5、接影响着显微镜的分辩率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油：增加照明亮度，增加显微镜的分辨率。1、显微镜的机械装置显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件（1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。（2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而

6、言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。（3）物镜转换器 物镜转换器上可安装34个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。（4）载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。（5）推动器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的

7、显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗动螺旋 粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜（如Nikon显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。（7）微动螺旋 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。

8、2、显微镜的光学系统显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大像 。（1）反光镜 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。（2）聚光器 聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场聚光器和暗视场聚光器。聚光器安装在载物台下，其作用是将

9、光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.81.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体

10、得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。（3）物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：干燥系物镜 以空气为介质，如常用的40以下的物镜，数值孔径均小于1。油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90100，数值孔值大于1。根据物镜放大率的高低，可分为：低倍物镜 指16，NA值

11、为0.040.15；中倍物镜 指625，NA值为0.15 0.40；高倍物镜 指2563，NA值为0.350.95；油浸物镜 指90100，NA值为1.251.40。（4）目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。（二）显微镜的使用操作及注意事项显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。1、观察前的准备（

12、1）显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。（2）将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。（3）调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。（4）调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源

13、、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。2、低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢

14、升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。3、高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。4、油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很

15、短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：（1）先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。（3）从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。（4）从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰

16、为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。（5）观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。（6）将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。5、显微镜的保护（1）移动显微镜时要轻，搬动时一手持镜臂另一手托住镜座。（

17、2）避免直接阳光照射，勿与挥发性药品及酸碱类物品在一起。（3）显微镜必须存放于干燥处，并在镜箱内或罩内放入硅胶或干燥剂，吸收水分，以防受潮。（4）禁止随意拆卸部件，各种镜面避免用手触摸，以免沾印和长霉。三、细菌形态与构造的观察（）细菌的形态和排列（见图1-2）1、球菌：双球菌、四联球菌、八联球菌、链球菌、葡萄球菌。 2、杆菌：单杆菌、双杆菌、链杆菌。 3、螺旋菌：弧菌、螺菌。 图1-2 细菌的形态及排列（二）细菌的特殊构造（见图1-3）1、细菌的鞭毛：单鞭毛、两端单鞭毛、一端丛鞭毛、两端丛鞭毛、周身鞭毛。2、细菌的芽胞：中央芽胞、近端芽胞、顶端芽胞。炭疽杆菌荚膜3、细菌的荚膜芽孢的形态（模式图

18、）图1-3 细菌的特殊构造实验二 细菌的涂片制备、染色及观察 、目的要求 1、了解细菌染色的基本原理。 2、掌握细菌革兰氏染色的方法及其原理。二、实验材料 1、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 2、菌种。 3、酒精灯、接种环、载玻片、染色液、染色用具、记号笔。 三、方法步骤涂片干燥固定染色（初染媒染脱色复染）镜检（一）细菌抹片的制备方法 1、玻片准备 选择清洁无油渍的载玻片备用。若玻片上有油渍，可滴上95 酒精2 3滴，用洁净白布擦干，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次，用布擦拭。也可滴1 2滴冰醋酸，用白布擦净，在酒精灯火焰上轻轻通过。 2、培养物涂片 固体培养物 以接种环取生理盐水或蒸馏水一小

19、滴，置于玻片上，用灭茵接种环钓取少且培养物与水滴混匀，涂布成薄层。 液体培养物 涂片时先将其摇匀，再用灭菌接种环钓取一环，于玻片上均匀涂布成薄层。 检查多个样品时，可在一张载玻片上做多个抹面，用记号笔做好标记。 3、干燥 涂好的抹片一定要进行干燥，一般以自然干燥较好，也可用风机吹干，但温度不能太高。 4、火焰固定 通过固定可以使抹面上多余的水份除掉，使抹面很好地固着于玻片上。固定过程中可以杀死细菌的繁殖体，但不改变细菌原有的形态特征，同时还可增强细菌细胞对染料的亲和性，使菌体易于着色。手执干燥后的抹片，使涂面向上，连续通过酒精灯火焰三次，用手背试其热度，以不烫手为度。 （二）染色方法 革兰氏染

20、色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。 革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结

21、晶紫结合成结晶紫 碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫 一 碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染后，细胞被染上复染剂的红色。 革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，

22、采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-3分钟，水洗。 加革兰氏碘溶液于抹片上媒染；1-3分钟，水洗。 加95酒精于抹片上脱色30秒，水洗。 加碱性复红液（或沙黄染液，或稀释石碳酸复红液），复染1-3分钟，水洗。 吸干、镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 实验三 真菌制片及形态的观察一、目的要求1掌握酵母菌水浸片制备和封闭标本的制备。2掌握观察酵母菌的基本方法，并观察其形态特征。二、实验材料 1、显微镜、擦镜纸。 2、酵母菌。 3、接种环、载玻片、盖玻片、染色液、染色用具、记号笔。 三

23、、实验方法常用美兰染色液制备酵母菌水浸片来观察酵母菌的菌体形态，并且活细胞能还原美蓝为无色，故可区别死细胞、活细胞。将美兰染色液一滴滴加在干净的载玻片中央，如不染色则加蒸馏水一滴，用接触环以无菌操作取培养48h左右的酵母菌体少许，在液滴中轻轻涂抹均匀（液体培养物可直接取一接种环培养液于玻片上）并加盖干净盖玻片。为避免产生气泡，应先将其一边接触液滴，再慢慢放下盖片。然后置于显微镜载物台上进行观察，注意酵母菌的形态、大小和芽体，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。实验四 培养基的制备和灭菌一、目的要求1、 了解并掌握培养基的配制、分装方法2、 掌握各种实验室灭菌方法及技术二、基本原理培养基是

24、供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98100下融化，于45以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。三、器材1、 溶液或试剂 蛋白胨、

25、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4等等见培养基配方。2、 仪器或其他用具 电子天平、高压蒸汽灭菌锅、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、试管、三角瓶、漏斗、移液管、培养皿、玻璃棒、烧杯、试管架、酒精灯、电炉等。四、操作步骤基本流程：称药品溶解调pH值融化琼脂过滤分装包扎标记灭菌摆斜面或倒平板。1、 称量药品 根据培养基配方及配制量依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2、溶解 用量筒取一定量(约占总量的2/3)蒸馏水倒入烧杯中，在电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，

26、补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。3、调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。4、溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。5、分装 分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角

27、瓶，其装量以不超过三角瓶容积的2/3为宜。6、包扎标记 培养基分装后加好硅胶塞或试管帽。在在瓶壁或管壁上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。7、灭菌培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121 20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜。7.1高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121，经1530mi

28、n，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。7.2操作方法和注意事项如下 :7.2.1加水 打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。 7.2.2装料、加盖 灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。 7.2.3排气打开排气口(也叫放气阀)。分别设定所需灭菌温度和时间（锅体上的定时器为一压控开关）。接通电源加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。 7.2.4升压、保

29、压和降压 当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，灭菌锅自动控制加热开关以维持恒温，待设定时间到达（一般培养基和器皿灭菌控制在121，20min）后，自动停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。8、无菌检查将已灭菌培养基放入37的温室中培养24-48小时，以检查灭菌是否彻底。实验五 乳酸菌微生物的分离、纯化和培养一、目的要求掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化物的基本操作技术。二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

30、本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：1、选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2、微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。纯培养的确定：1.确定其菌落观察特征；2.结合显微镜检测个体形态特征的确定。三、器材1、菌种 乳酸菌；2、培养基 MRS培养基；3、仪器或者其他用具 接种环，无菌培养皿，发酵乳样，显微镜等。四、操作步骤平板划线

31、法：(1) 倒平板 将MRS固体培养基灭菌，待冷至5560倒平板；(2) 制备样品稀释溶液 称取样品10g，放入盛有90mL无菌水的三角烧瓶，振动约20min，使样品与水分混合，将细胞分散。用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL样品悬液加入盛有9mL无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL加入另一个盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的样品溶液；(3)划线 在近火焰处，左手拿平皿，右手拿接种环，挑取上述的样品溶液一环在平板上划线，划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀

32、释，使之形成单个菌落；(4) 培养 将MRS培养基平板倒置于37温室中培养23天；(5) 挑菌落 待菌落长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。图5-1 平板划线操作图图5-2划线分离图3、微生物的接种技术 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进

33、行。 （1）斜面接种法 斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈4550角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）

34、必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌落取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。2.穿

35、刺接种法 主要用于检测细菌有无动力，具体操作方法如下： 按上述方法持菌种管和半固体试管，接种针灭菌并取菌，将沾有细菌的接种针从半固体琼脂中心垂直刺入至底部约0.5cm处，然后循原路退出。管口灭菌后塞上棉塞，作好标记，送至37度培养24h后观察结果。3液体培养基接种法 是将细菌接至液体培养基进行增菌培养或发酵的接种方法。具体操作方法：按斜面接种法中的方法持菌种管，接种环灭菌、取菌，将沾有细菌的接种环伸进试管，试管稍倾斜，先将接种环上的细菌在挨着液面的试管内壁上轻轻研磨，然后直立试管，细菌即进入液体培养基中。管口灭菌后塞上棉塞，作好标记，送至37培养24h后观察结果。实验六 食品中细菌总数的测定一

36、、目的要求 1、学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理 2、了解菌落总数测定在样品进行卫生学评价中的意义 二、基本原理 菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、实验材料 3.1食品检样 3.2培养基 营养琼脂培养基，无菌生理盐水 3.3其它 无菌培养皿，无菌移液管，无菌不锈钢勺。 四、实验内容4

37、.1取样、稀释和培养 4.1.1以无菌操作取检样25g（或mL），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理1min，制成1:10的均匀稀释液。 4.1.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。 4.1.3另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10mL吸管。 4.1.4根据标准要求或对污染情况的估计，

38、选择23个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 4.1.5稀释液移入平皿后，将凉至46营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 4.1.6待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每mL）样品所含菌落总数。 4.2菌落计数方法 作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立

39、即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不要超过24h。 4.3菌落计数报告方法 4.3.1平皿菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。 4.3.2稀释度的选择 4.3.2.1应选取平均菌落数在30300之间的稀释度报告（下表中例1）。 4.3.2.2若有二个稀释度均在30300之间时，应以二者比值决定，比值2取平均数，比值2则其较小

40、数字（下表中例2和3）。 4.3.2.3若所有稀释度均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（下表中例4）。 4.3.2.4若所有稀释度均30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之（下表中例5）。 4.3.2.5若所有稀释度均无菌落生长，则应按300，有的又30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 4.3.4菌落计数报告方法 菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。稀释度选择及菌落数报告方式 例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数(

41、个/或mL)报告方式(个/或mL)10-110-210-311,3651642016，400 16,000或1.610422,760295461.637,75038,000或3.810431,650271602.227,10027,000或2.71044无法计数1,650513513,000510,000或5.110552711527020或2.71046无法计数3051230,50031,000或3.1104五、结果 1将实验测出的样品数据以报表方式报告结果。 2对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。 实验七 食品中大肠菌群的测定一、 目的要求1、学习并掌握大肠杆菌的分离和活菌计数的基本

42、方法和原理 2、了解大肠菌群最近似数测定在样品进行卫生学评价中的意义二、 实验材料 培养箱、天平、灭菌吸管、试管架、平皿、酒精灯、打火机、记号笔等。 乳糖胆盐培养基、伊红美兰琼脂培养基等。三、 实验步骤1、检样稀释 （1）以无菌操作将检样25mL(或g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成110的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以800010000r/min的速度处理1min，做成110的均匀稀释液。（2）用1mL灭菌吸管吸取110稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成

43、1100的稀释液。 （3）另取1mL灭菌吸管，按操作（2）依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。2、乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361温箱内，培养242h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 3、分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361温箱内，培养1824h，然后取出，观察菌落形态，并做

44、革兰氏染色和证实试验。4、证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养242h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。5、报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。 表7-1 大肠菌群最近似数（MPN）检索表阳性管数MPN100 mL(g)95%可信限1 mL(g)30.1 mL(g)30.01 mL(g)3下限上限 0003000130590002600039001030513001160012900131200206002190022120

45、02316003090031130032160033190100405200101701021010211010315011070102301111103036011215011319012011030360121150122200123240919130160131200132240133290200901036020114030370202200203260阳性管数MPN100 mL(g)95%可信限1 mL(g)30.1 mL(g)30.01 mL(g)3下限上限 21015030440211200708902122702133402202104047022128010015002223

46、50223420230290231360232440233530300230401200301390701300302640150150030395031043070210031175014023003121200300380031316003209301503800321150030044003222100350470032329003302400360130003314600710240003321100015004800033324000注：1.本表采用3个稀释度（1 mL(g)、0.1 mL(g)、0.01 mL(g)），每个稀释度3管。 2.表内所列检样量如改用10 mL(g)、1

47、mL(g)、0.1mL(g)时， 表内数字相应降低10倍； 如改用0.1 mL(g)、0.01 mL(g)、0.001 mL(g)时，则表内数字相应增加10倍，其余可类推。实验八 环境因素对微生物的影响 、目的要求 通过本实验加深理化、生物因素对微生物形响概念的理解。 二、实验器材器材：培养箱、水浴箱、无菌工作台，平皿、试管、酒精灯、打火机等。 培养基：MRS培养基。 三、实验内容（）温度对微生物的影响 1.基本原理 温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构如细胞膜的流动性及完整性来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。过高的环境温度会导致蛋白质或核酸的变性失活，而过低的温度会

48、使酶活力受到抑制，细胞的新陈代谢活动减弱。每种微生物只能在一定的温度范围内生长，低温微生物最高生长温度不超过20，中温微生物的最高生长温度低于45 ，而高温微生物能在45 以上的温度条件下正常生长，某些极端高温微生物甚至能在100 以上的温度条件下生长。微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度，但它并不等于其发酵的最适温度，也不等于积累某一代谢产物的最适温度。粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势，而酿酒酵母可发酵产气。本实验通过在不同温度条件下培养不同类型微生物，了解微生物的最适生长温度与最适代谢温度及最适发酵温度的差别。

49、 2.操作步骤 （1）将MRS培养基倒平板 注意倒平板时培养基量适当增加，使凝固后的培养基厚度为一般培养基厚度的152 倍，避免在高温（45）条件下培养微生物时培养基干裂。 （2）在上述平板无菌操作划线接种，倒置于4、37及45条件下保温4872h，观察细菌的生长状况。 3.实验报告比较微生物在不同温度条件卞的生长状况（“”表示不生长，“”表示生长较差，“”表示生长一般，“”表示生长良好）。 （二）渗透压对微生物的影响 1.基本原理 在等渗透溶液中，微生物正常生长繁殖；在高渗溶液（例如高盐、高糖溶液）中，细胞失水收缩，而水分为微生物生理生化反应所必需，失水会抑制其生长繁殖；在低渗溶液中，细胞吸

50、水膨胀，细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等大多数微生物具有较为坚韧的细胞壁，而且个体较小，因而在低渗溶液中一般不会像无细胞壁的细胞那样容易发生裂解，具有细胞壁的微生物受低渗透压的影响不大。不同类型微生物对渗透压变化的适应能力不尽相同，大多数微生物在0.5 3的盐浓度范围内可正常生长，10 15 的盐浓度能抑制大部分微生物的生长，但对嗜盐细菌而言，在低于15 的盐浓度环境中不能生长，而某些极端嗜盐菌可在盐浓度高达30的条件下生长良好。2.材料 （1）培养基 分别含0.85 、5 、15 NaCl的MRS培养基。 （2）仪器或其他用具 无菌平皿，接种环等。3.操作步骤将含不同浓度NaCl的MRS琼脂培养基溶化、倒平板。无菌操作划线接种，避免污染杂菌或相互污染。4.将上述平板置于37温室中，2-3d后观察并记录含不同浓度NaC