表面增强拉曼光谱技术及其在生物分析中的应用

1、食品课程论文表面增强拉曼光谱技术及其生物题目 分析应用研究进展 姓名专业陈坤 学号 2009309010006 食品科学二九 年 十二 月表面增强拉曼光谱技术及其生物分析应用研究进展Bioanalysis Application of Surface-enhanced Raman Spectroscopic（陈坤 2009309010006 食科院 食品科学）摘要：拉曼光谱诞生距今已整整80年，激光器、CCD检测器、光纤探针技术的发展使拉曼光谱分析仪器及其应用进展日新月异。然而传统拉曼光谱信号微弱，因此表面增强拉曼散射光谱（SERS）凭借其超灵敏且具有化学选择性而被广泛应用于生物分子鉴定。它是

2、一种信号强度高，荧光和水的背景干扰小的表面分析技术。本文就SERS在生物应用方面的研究作简单回顾。关键词：表面增强拉曼光谱（SERS）；生物分析；应用拉曼光谱是用途广泛的无损检测和分子识别技术，它能够提供化学和生物分子结构的指纹信息。但是常规拉曼散射截面分别只有红外和荧光过程的10-6和10-14。1这种内在低灵敏度的缺陷曾制约了拉曼光谱应用于痕量检测和表面科学领域。尽管拉曼光谱技术是一种重要的生物化学分析工具，但由于其信号强度低，而生物分子通常在自然环境下含量较低，这样得到的拉曼信号很小或者检测不到，作为信息读出手段往往缺乏高灵敏性。直到20世纪70年代中期，Fleischmann、Van

3、Duyne和Creighton分别领导的3个研究组2-4分别观测和确认了表面增强拉曼现象，即在粗糙银电极表面的吡啶分子的拉曼信号比其在溶液中增强了约106倍。人们将这种由于分子等物种吸附或非常靠近具有某种纳米结构的表面，其拉曼信号强度比其体相分子显著增强的现象称作表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering，SERS)效应。SERS效应的发现有效地解决了拉曼光谱在表面科学和痕量分析中存在的低灵敏度问题。1. 表面增强拉曼散射机理与SERS实验和应用所取得的进展相比，SERS理论的研究一直相对滞后，这主要是因为具有SERS效应的体系非常复杂。体系表面形貌和

4、表面电子结构，光和粗糙表面的相互作用，光和分子的相互作用，分子在表面的取向、成键作用以及分子和表面的周边环境，入射光的强度、频率、偏振度和偏振方向等因素对SERS谱图的影响均比较复杂。SERS体系的这些复杂性导致了人们对SERS效应认知的多样性. 人们从各个角度和具体实验条件提出了不同的SERS机理5。 目前学术界普遍认同的SERS机理主要有物理增强机理和化学增强机理两类。SERS谱峰强度ISERS常具有以下正比关系6, 7：式中，E（0）和E（S）分别为频率为0的表面局域光电场强度和频率为S的表面局域散射光电场强度；和分别为分子所处位置的激发光的电场方向和拉曼散射光的电场方向；（）fi是某始

5、态i经中间态r到终态f的极化率张量。式（1）ISERS前半部分表明，入射与散射光的局域电场强度越大，拉曼信号强度越大，这来自于物理增强机理的贡献，通常归因于电磁场增强（Electromagnetic enhancement, EM）机理8。式，（1）后半部分表明，体系极化率（）fi越大, 则相应拉曼信号的强度也越大，这是SERS化学增强（Chemical Enhancement, CE）机理的贡献5, 9。它是由于分子和表面之间的化学作用，从而增大了体系的极化率。1.1 化学增强机理化学相互作用对反映在光电场下电子密度形变难易程度的拉曼过程是非常重要的。当分子化学吸附于基底表面时，表面、表面吸

6、附原子（Adatom）和其它共吸附物种等都可能与分子有一定的化学作用，这些因素对分子的电子密度分布有直接的影响。化学增强主要包括以下3类机理：（1）由于吸附物和金属基底的化学成键导致非共振增强（Chemical-Bonding Enhancement, CB）；（2）由于吸附分子和表面吸附原子形成表面络合物（新分子体系）而导致的共振增强（Surface Complexes Enhancement, SC）；（3）激发光对分子-金属（Molecule-Metal, m-M）体系的光诱导电荷转移的类共振增强（Photon-induced Charge-Transfer Enhancement, P

7、ICT）。这3种增强机理都表示体系极化率的变化对拉曼强度的影响，它们的区别在于CB增强是由于分子与表面化学吸附形成化学键，引起分子和金属间的部分电荷转移；该体系极化率的分子和分母项都没有显著变化，但是分子的HOMO和LUMO轨道展宽。SC增强是由于在表面上由部分带正电的金属原子组成的原子簇和带部分负电荷的分子以及电解质阴离子形成表面络合物，这种络合物作为新的分子体系，具有不同的HOMO和LUMO，在可见光激发下可以达到共振；该体系极化率的分子和分母项都有较大改变，特别是分母项由于满足共振条件，其实部趋于零。PICT增强并不强调表面与分子有很强的化学作用，主要取决于金属电极的费米能级和分子HOM

8、O或LUMO的能量差；若该值与激发光能量相匹配，就会发生分子到金属或者金属到分子的电荷转移；该体系极化率的改变主要体现在中间态r上，即体系的电荷转移态。1.2 SERS的电磁场增强机理在SERS效应的电磁场增强机理解释中，表面等离子体共振（Surface plasmaon resonance, SPR）引起的局域电磁场增强被认为是最主要的贡献9-12。表面等离子体是金属中的自由电子在光电场下发生集体性的振荡效应13, 14，特定粒径的纳米粒子金属因为各自独特的等离子体共振吸收而显现出丰富多彩的颜色效应。这种等离子体的共振吸收早在19 世纪人们就开始了对其内在机理进行研究。Lorenz，Mie和

9、Debye各自独立发展了相应方法计算介质球对电磁波的散射作用，这样的理论15-17被称之为Lorenz-Mie-Debye理论，Lorenz-Mie理论或Mie理论。Mie首次解释了各种粒径的球形金纳米粒子的颜色起源。Gans修正的Mie理论可以处理椭球或者类椭球粒子的光学性质，较好地解释了金纳米棒的横模和纵模等离子体吸收峰，以及纵模吸收峰随粒子长径比变化的现象。由于早期Mie理论只是考虑孤立粒子的光学性质，并没有考虑临近粒子的耦合作用，而纳米粒子之间的耦合作用对其自身的光学性质和SERS的增强作用都有很大的影响。当粒子之间的距离小于粒子本身的尺度，甚至在发生团聚时，等离子体共振峰（SPR）发

10、生红移，同时在更长波长的位置出现吸收峰，这些谱峰被认为是类似于纳米棒中的纵模共振峰。为了克服Mie理论的缺陷。人们发展了有效介质理论，特别是Maxwell-Garnett理论，很好地解释了多粒子耦合的光学现象。除此之外还发展了存在解析解的广义Mie理论，数值求解的时域有限差分方法（Finite Difference Time-Domain，FDTD）。例如，通过拟合金属的介电常数，利用三维时域有限差分（3D-FDTD）方法模拟了不同形状的纯金属纳米粒子的电场分布，模拟了核壳结构的异质材料的光电场分布等。模拟结果表明可以利用SERS的电磁场增强的长程效应，采用“借力”的策略，以高SERS活性的A

11、u，Ag和Cu纳米粒子为基底或核，分别在其表面沉积或者修饰上极薄层的非SERS活性或者弱SERS活性材料，从而获得在这些材料上吸附的分子的高质量SERS谱，以拓展SERS研究和应用体系。此外，离散偶极近似方法（Discrete Dipole Approximation）也常用来数值求解特殊形状的纳米粒子的光学性质。定量模拟电磁场增强的分布，并与纳米粒子的表征技术相结合，可以指导人们合成具备某种光学性质可控的纳米结构材料，并推动SERS成为广泛应用于化学传感和生物医学检测方面的有力工具。2. 新型SERS 活性基底20世纪80 年代SERS 的发展遇到了不少难题：仅有金、银、铜3 种金属和少数极

12、不常用的碱金属（如锂、钠等）具有强的SERS效应；金、银、铜金属尚需表面粗糙化处理之后才具有高SERS活性，故常用的平滑单晶表面皆无法用SERS研究；实验上所观察到的很多复杂现象尚无法用现有的SERS理论进行解释。20世纪90年代以Kneipp和Nie S为代表的一些小组对上述问题进行了理论与实验研究，取得了突破性的进展：SERS增强因子从最初的104106提高到了10141016，SERS逐渐发展成为单分子科学研究手段之一18, 19；在系列纯过渡金属元素（第副族元素）以及其它体系中观察到SERS效应20, 21。目前吸附分子产生表面增强拉曼散射的金属有Ag、Au、Cu、Li、Na 、K、I

13、n、Al、Pt 、Rh、Ni、Ti、Hg、Cd、Pd等，化合物有TiO2、NiO等22。纳米技术的发展给SERS技术的发展注入了活力，例如，某些纳米粒子体系的SERS信号可以放大至百万亿倍，因此有望成为单分子科学中的重要检测工具。19, 23近年来，SERS被广泛地应用于表面吸附24、电化学和催化反应24, 25、化学和生物传感器23, 26、生物医学检测27-29及痕量检测与分析30等领域。在发现SERS效应之后，人们发现表面增强效应也普遍存在于其它光谱学中，通过对各种表面增强光谱的系统研究发现，它们都具有强烈依赖于特定的金属纳米结构的共性。为了达到增强效果，应选择直径10-100nm接近待

14、分析分子的金属粒子。增强途径很多，常用技术及使用的纳米粒子均列于表1中。金银溶胶，薄层和电极是最常用的增强基底。金纳米粒子易控制大小分布，稳定性好，与抗体、抗原蛋白质，DNA及RNA有良好的生物相容性，它已经成功的应用于标记技术，合适大小和粗糙度的金溶胶粒子很适合做SERS基底。因此，标记免疫纳米粒子通过各种生物反应识别待测部分，可以很好的达到检测要求。3. 生物分析应用拉曼光谱具有灵敏度高、需样量浓度低（10-310-5 mol·L-1）、反映信息量大以及不受水溶剂的干扰等优点，此外还可以针对复杂分子的不同生色团进行选择性共振激发（生物分子在250750 nm范围内有较强的吸收谱带

15、），因此激光拉曼光谱被广泛用于研究DNA、胆色素、卟啉等生物分子的结构表征及其与药物分子的相互作用31-33。采用表面增强拉曼光谱手段对几种季铵盐化合物与DNA之间的相互作用，结果表面拉曼光谱作为一种抗癌药物筛选和药物作用研究手段具有十分广阔的应用前景33。3.1 生物分子检测3.1.1 氨基酸溶液SERS实时SERS观测在生物分子研究领域有着卓越的应用前景，如核酸和氨基酸识别。这项工作致力于对氨基酸的光诊断应用研究。氨基酸是构成蛋白质和酶的基础物质。要组成不同的蛋白质需要多种氨基酸来组合。一个氨基酸通常大于100nm，所以这个氨基酸只有部分能连到Ag+基底上34，35。据此来推测Glu和As

16、p在中枢神经系统损伤中的作用36。3.1.2 肽链SERS肽链大多是通过羧基端与Ag+相连。一般会在930和1410cm-1处出峰。但是对于不同的氨基酸这些峰的位置和强度都会发生变化，揭示了可能是由于羧基端和银表面相互作用的结果37。3.1.3 蛋白质SERS蛋白质SERS分析几乎与氨基酸SERS同时展开。这些研究囊括对神经传递38、血红蛋白39、四黄素40、视网膜41、胆液42、视觉交叉神经43等的研究。3.1.4 双螺旋DNA SERS当核酸吸附到金属纳米结构上时就可被检测到，与普通的基因诊断不同，这是一种直接测定技术。还有其它SERS报道用于DNA杂交1,3,7,9-6氯-6-羧基二氢荧

17、光素和罗丹明6G44，45。3.2 免疫测定SERS标记免疫学创立于年代初期，开始以放射免疫分析为代表，以后相继派生出许多其它的标记免疫分析方法。在方法学的研究、开发和发展过程中，人们关注的焦点始终围绕着如何提高灵敏度和特异性这两大精髓问题。随着基础医学和相关技术的发展，特别是近十余年来，新理论、新方法、新材料、新工艺、新产品不断开发，使标记免疫分析技术向纵深发展，目前已形成由多种标记、多种反应模式的综合性标记免疫分析体系。标记免疫学是一门边缘学科，其基本技术标记免疫分析，是将多种标记示踪技术的高度灵敏性和医学免疫学抗原抗体反应的高度特异性相结合的产物，因此具有及其良好的微量分析效果，是生物活

18、性物质分析方法上的新领域。这一分析方法不仅灵敏度高，特异性强，重复性好，准确性高，而且操作简单，易于商品化。传统的拉曼散射光谱信号较弱，作为信息读出手段往往缺乏高灵敏性。70年代中后期Au、Ag、Cu上表面增强拉曼散射（SERS）效应的发现与证实，给拉曼光谱的研究应用注入了新的活力。SERS标记免疫检测是一种将SERS免疫反应中加入标记示踪物，与标记免疫学相结合，利用SERS的高灵敏度和光谱选择性，结合抗体抗原的特异反应作用而进行的纳米标记免疫分析技术。这种新发展起来的标记免疫分析技术将生物分析技术、纳米技术与SERS三者很好的结合。事实上，在一些纳米银“热粒子”上，某些分子，如染料分子、血红

19、蛋白等的信号灵敏度可与荧光光谱媲美，甚至超过荧光光谱，且拉曼谱峰宽度通常比荧光谱峰要窄一倍，对生物分子光损伤性很小，尤为适合水溶液物质结构研究。SERS的高选择性、高灵敏度，使其在生物分子的结构和构象、分子的界面行为和性质、标记分子与金属纳米粒子表面的相互作用等方面有良好的研究前景。SERS标记免疫技术是在生物免疫应答的基础上发展起来的，主要基于类似三明治结构的构建，基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体-待测抗原-标记抗体”夹心复合物，通过对标记分子SERS信号的识别进行免疫分析。这项技术最早是由Rohr等人46于1989年创立，他们首先利用表面增强共振拉曼光谱(SERRS

20、)来研究生物分子之间的相互亲和性，将二甲基偶氮苯胺以共价键与抗甲状腺促进激素(TSH)抗体相连，形成标记抗体，以银表面固定的anti-TSH抗体作为固相抗体，二者与待测液中TSH抗原形成夹心复合物，利用夹心复合物中标记物的SERRS信号来进行免疫分析，但这种固相抗体的均一性较难控制，重现性较差。随着生物技术的发展，SERS在酶联免疫47和基因工程48领域也有了较大的研究进展。Dou49和Mirkin50等人分别将SERS标记免疫技术用于酶联免疫分析与DNA序列识别。这些研究为以后SERS标记免疫检测打下了坚实的理论与实验基础，引起了世界各研究小组的广泛关注。Mirkin小组将SERS标记免疫与

21、医学上的银染色技术相结合进行免疫识别，利用银的强SERS效应，在标记免疫金纳米粒子与固相抗体所捕获的抗原发生免疫识别后进行银染色以获得较好的活性。将标记免疫分析的选择性与表面增强拉曼散射技术的灵敏度进行有机结合，对拉曼光谱在生物体系中的应用有重要意义。免疫检测建立在抗原与其对应抗体的特异性反应上，它是生化分析，医学诊断和环境监测中非常有用的分析手段。而最具代表性的研究当属Porter小组51于1999年首次将SERs标记分子和羊抗小鼠IgG直接与金溶胶相作用形成标记免疫溶胶，通过相应小鼠抗原与固定在基底上的羊抗小鼠IgG相连，进行SERs免疫检测。采用双官能团标记分子代替单官能团标记分子是提高

22、检测灵敏度的方法之一。双官能团标记分子一端通过巯基与金纳米粒子相连，另一端与抗体相连，这种方法大大增加了金纳米粒子表面吸附标记分子的数量，提高了检测的灵敏度，其待测抗原的检出限达到了1 pg/mL。采用这种标记免疫溶胶方法，金纳米粒子表面产生的电磁场将直接影响相连的标记分子，可产生较强的SERS信号，且不存在距离影响SERS信号的问题。因此无需选用特定的吸收光谱与入射光波长相匹配产生共振效应的分子，拓宽了标记分子的选择范围，这种方法与Rohr、Dou等人采用的直接标记法、酶标法相比更体现了SERS其独特的优点。3.3 生物组织或细胞SERS分析近几年，拉曼标记与生化、免疫手段相结合定位检测亚细

23、胞结构甚至某种特定生物大分子的研究，正成为激光拉曼光谱拓展到生物医学领域的新切入点。不会导致生物变性的近红外激光和高灵敏度的CCD检测器的使用以及显微拉曼光谱仪器的12m空间分辨率使单细胞的拉曼光谱检测成为可能，自从Puppels等报道采用自行研制的激光共聚焦显微拉曼光谱仪检测单个细胞及染色体之后，单个细胞原位、无损检测的报道层出不穷。鼠肝星状细胞体内外激活的拉曼光谱研究表明其活化过程中分子组成和结构会发生变化，基于模糊C均值和人工神经网络等聚类分析法，构建了自动判别肝损伤程度的数据处理系统和探索了早期预警肝纤维化的快速诊断方法52。采用化学方法将纳米金与从病毒中提取的核定位肽连接，制成细胞核

24、靶向拉曼光谱检测，成功地获取了核内生物大分子的大量结构53信息。拉曼光谱因具有较高选择性以及尤为适合水溶液物质结构研究等特点，近年来己在生物医学研究领域中显示出独特的潜在应用前景，而被大量应。基于组织在病变过程中分子组成和分子结构的变化，拉曼光谱法另辟蹊径试图从分子层面区别病变和正常组织的差异，从而实现疾病的早期诊断。自从Alfano等首次证实了拉曼光谱可用于区分正常组织与癌症组织后，各类器官的正常与癌变组织的拉曼检测工作陆续开展起来，这些组织包括皮肤、脑、眼、口腔、食道、胃、肝、膀胱、子宫颈、结肠、骨等。目前，除乳腺、皮肤等体表组织以及胃肠道中的结肠、食道组织和妇科肿瘤中的子宫颈组织可以实现

25、体内检测外54，其他器官组织还停留在离体检测阶段。对正常与病变组织的拉曼光谱比对，并采用小波分析等化学计量学手段对所获得的拉曼光谱谱图进行信号处理和特征信息的提取55。例如，对参与阿尔茨海默病变的海马组织进行拉曼光谱研究，发现在脑内与-淀粉样蛋白共存的分子伴侣-胆固醇的堆积以及tau蛋白异常磷酸化等新的拉曼光谱信息。以此作为一种新的多组分拉曼光谱判据，为了解阿尔茨海默症的致病机理和药物治疗提供了新的视角。人眼翼状胬肉拉曼光谱研究表明：拉曼光谱可作为一种简便直观和信息丰富的新型病理学诊断手段，它所提供的关于翼状胬肉的病理变化信息涵盖了免疫学、超微结构病理学和脂类过氧化反应三种病理学手段的检测结果

26、。过氧化氢是医用牙齿漂白剂的主要活性成分，其漂白机理及安全性一直存在争论。采用激光拉曼光谱、激光诱导荧光光谱和红外光谱对漂白前后的牙釉质和牙本质进行了系统的研究，从多个视角了解了漂白剂在牙漂白过程中对牙釉质/牙本质的力学强度、矿物和有机成分的组成与结构的影响56, 57，为漂白机理的探讨和评估漂白剂使用的安全性提供了坚实的科学依据。单个培养的胃癌细胞SGC7901和胃黏膜组织中的正常与胃癌细胞的拉曼光谱比较显示出维生素A和类胡萝卜素在癌变过程中呈现此消彼长的关系，这一发现为探讨癌变机理提供了新的思路。基于曲线拟合的重叠峰解析和小波分析等多种化学计量学手段对单个培养的胃癌细胞SGC7901和胃黏

27、膜组织中的胃癌细胞的拉曼光谱数据进行了处理，大大提高了光谱数据的信噪比并得到了精确甄别出胃黏膜组织上胃癌细胞的拉曼光谱判据，为胃癌的早期诊断和胃癌手术中癌组织的准确甄别与手术切除提供了一种可行的依据53。脊髓损伤（SCI）的发病率随着交通与建筑业的发展而逐年增加，脊髓损伤引发的继发性骨质酥松机理尚未明晰。而采用激光共聚焦拉曼光谱从分子层面对脊髓损伤引发的骨质变化进行了初步的研究，证实了荷尔蒙的变化是引起骨质流失的重要因素之一。表面增强拉曼光谱（SERS）拓宽了生物分析这个领域中的应用，可使生物样品的拉曼信号增强若干个数量级。SERS还被应用到昆虫病毒，抗滤过性病原体的药物，泌尿系统细菌等方面的

28、研究。3.4 生物组织或细胞SERS成像将表面增强拉曼光谱与共聚焦拉曼显微镜结合，可以得到这种高光谱表面增强拉曼成像技术（HSERI）。这是一种采用激光共焦拉曼散射显微三维扫描技术，在无扰、原位、实时情况下，对活细胞的分子结构与分布状态进行测定并三维成像的技术与方法。表面增强拉曼成像技术结合了SERS的灵敏度和共聚焦显微拉曼的高空间分辨率，使得发展一种用于活细胞内分子实时动态监测的成像手段成为可能。HSERI具有提高高通量分析和直接成像的能力，能为化学分析提供更多有用的信息58。激光拉曼光谱技术是一种非侵入性的光散射技术，能够无损、无须任何标记物标记情况下提供丰富的分子结构和物质成分的信息。特

29、别是激光共焦拉曼散射显微三维扫描技术，可以100nm的横向分辨率实现对活细胞内有关分子的结构组成，浓度与分布的二维以至三维分布的测定与成像，还可实现对这些参数随细胞内外有关条件改变的动态变化作监测。采用这种技术，对各种状态的活态人红细胞内，其血红蛋白的分布状态，从脱氧到含氧状态的动态过渡；淋巴细胞在有关因子（如射频电磁波、UV 射线等）作用下，其 DNA、蛋白、多肽等分子的结构变化及其分布状态的变化成像的有关技术与方法。包括对活态细胞分子结构与分布成像的扫描技术、扫描参数的优化，以及为保证所得样品拉曼谱线的真实、可靠性进行的系统性能快速测试、校正方法研究。将显微激光共焦拉曼光谱技术用于活态细胞

30、检测时的优化实验参数。在这些研究基础上，结合小曝光积分时间对剔出谱线外来干扰，并以归一化结合基线校正法对谱线作后处理的方法，建立一种将强度匹配技术和模型匹配技术相结合的二维拉曼成像技术。并发展出简易的活态红细胞由T态到R态的跃迁速率测定技术，测量分析出血红蛋白结构随有关条件变化而动态变化的情况，由此证明不同胞龄红细胞具有不同的携氧能力；揭示了不规则细胞内分子会在畸形位置处聚集的现象。表面增强拉曼光谱技术与拉曼显微成像相结合的表面增强拉曼显微成像将为生物芯片的原位检测提供有效手段54, 59, 60。结语在其他技术的配合下，SERS标记免疫检测将不断地得到更新与进步，从而作为一门独特的新技术在生

31、物医学及其他领域的研究中发挥越来越大的作用。表面增强拉曼光谱作为一种分子结构表征手段，在生物医学领域中的应用方兴未艾。从近十年的研究进展来看，不论是体表的乳腺和皮肤组织还是体内的胃肠道等器官，都已经实现或者正在努力实现体内检测；不论是单个细胞的激光拉曼捕集检测还是组织切片的二维拉曼扫描，都可以清晰地获得与组织形态学相关的伪彩色拉曼图像。因此可以预料，随着表面增强拉曼光谱技术在生物医学领域中的广泛应用，将会迎来它历史上发展的第三个春天。参考文献：1. Pettinger B. Adsorption at Electrode Surface M, New York: VCH, 1992: 2852

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