分子生物技术在蜜蜂遗传和育种研究上的应用-

1、分子生物技术在蜜蜂遗传和育种研究上的应用摘要:随着分子生物学研究的不断发展,用蜜蜂为素材进行遗传学、进化学基础理论的研究已越来越多,本文综述了分子杂交技术、PCR技术、RFLP技术、RAPD技术、微卫星DNA技术、线粒体DNA技、DNA指纹技术等分子生物技术所进行的蜜蜂遗传和育种研究现状。为今后蜜蜂分子生物学领域开展的研究提供参考。关键词:蜜蜂;遗传;育种;生物技术1 分子生物技术分子生物技术就是通过蛋白质、核酸在分子水平上的研究,掌握其性质,利用其性质在分子结构水平上操作从而达到人们对生物的改造获得人们所需要的产物。主要的分子生物技术有已知序列的基因合成、未知序列的全基因的合成、southe

2、rn杂交、northern杂交等技术。分子生物技术主要用于重组蛋白的生产、基因改造物种、基因治疗、基因改造及刑事案件的断定、环境保护等。它是以细胞融合技术和基因重组技术为基础,通过对生物体自身的一些特性和功能的研究,从新设计和构建出一个具有人为干涉的新物种或是新品系,再结合一些工程原理来进行相互生产和加工,从而为我们提供附加商品和服务的综合性技术体系。所以我们也经常把分子生物技术称作生物工程,这也是标志着现代生物技术的主要研究方向。分子生物学技术已经成为研究动物病害的一个重要手段,对于我国蜜蜂养殖业高效和可持续发展也有着十分重要的影响。现在对于蜜蜂方向的研究早已进入分子方向,分子生物技术已被越

3、来越多地应用到蜜蜂遗传和育种研究中,本文综述了分子杂交技术、PCR技术、RFLP技术、RAPD技术、微卫星DNA技术、线粒体DNA技、DNA指纹技术等分子生物技术所进行的蜜蜂遗传和育种研究现状。2 分子生物技术在蜜蜂遗传和育种上的应用2.1 分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。分子杂交是基因工程和分子生物学的重要技术之一,主要包括Southern印迹法、Northern印迹法以及Western印迹法,它们的杂交受体分别是DNA片段、RNA片段和

4、蛋白质。DNA的分子杂交是双链DNA 的变性和带有互补序列的同源单链间的配对过程。通过分子杂交技术可以克隆一些新基因并研究同源基因之间遗传进化上的差异。2.2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR技术多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加

5、到引物3´-OH末端,并以此为起始点,沿模板5´3´方向延伸,合成一条新的DNA互补链。多聚酶链式反应是八十年代发展起来的新技术,它通过模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地扩增DNA某个特殊区域。在蜜蜂学的研究中较典型的事例是:利用蜜蜂的微卫星片段(微卫星序列是由大量CT GT AC 短串联重复序列构成的DNA片段,在不同个体间的变异频率很高进行群体变异、新基因的分离分析和蜂王交尾频率的研究。如:Estoup等人从蜜蜂的基因组文库中分离得到了一系列微卫星序列,其中一个由13个CT串和9个GGT串构成的微卫星序列在欧洲黑蜂的野生群体中表现出的高度变异,明显的不同于

6、其它西方蜜蜂;Rozalski等应用西方蜜蜂的微卫星序列为引物,对日本蜜蜂蜂王的交尾频率以及遗传相关性进行了分析,结果表明,日本蜜蜂蜂王的有效交尾频率17.86,高于西方蜜蜂(12.4和小蜜蜂(5.65,而低于大蜜蜂(25.5。并且受试蜂群有一定程度的遗传相关性(r=0.278。2.3 RFLP技术(restriction fragment length polymorphism,限制性内切酶片段长度多态性RFLP(restriction fragment length polymorphism是限制性片段长度多态性的简称,RFLP 限制性内切酶片段长度多态性作为第一代分子生物学标记自问世以来

7、已广泛运用于多门生物学科研究中,但它运用于植物抗性研究还只是近几年的事。RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离,利用RFLP技术,对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者,若能提取纯净DNA,则可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性,利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。RFLP技术在用于基因型分型研究的同时,同样的可用于在不同环境中微生物多样性的研究。RFLP技术主要包括以下基本步骤:DNA提取用限制性内切酶酶切DNA用凝胶电泳分开DNA片段把DNA片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段(Southern杂交和结果分析。它通

8、过检验DNA经限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段来区分不同的物种。较常见的技术是Southern印迹法。Hall将随机的蜜蜂DNA片段克隆在大肠杆菌pBR322上,并以其作探针对蜜蜂进行RFLP分析。结果发现这些探针中有19个可用于区分非洲蜜蜂和欧洲蜜蜂。分离用于RFLP分析的足量的DNA是一件耗时耗力的工作,而PCR技术可以在短时间内扩增出RFLP分析所需要的DNA量,因此,二者结合发展出了CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence技术,又称PCR-RFLP。它采用DNA的特异片段为引物,DNA为模板进行PCR扩增,然后用限制性内切酶酶切PCR

9、产物,再用琼脂糖电泳将DNA片段分开。蜜蜂的线粒体DNA细胞色素C氧化酶的两个亚基COI和COII之间的区域具有重要的长度多态性,应用PCR-RFLP技术,对该区域进行分析能够方便快速地检测不同蜜蜂蜂种间线粒体DNA类型。Garnery曾采用这种方法对西方蜜蜂的线粒体DNA 进行了分析,他通过对隶属于12个亚种的302个蜂群进行PCR-RFLP分析,发现了21种不同的线粒体DNA类型。此外,中国农业科学院蜜蜂研究所石巍等也采用这种方法对我国一些蜂种进行多态性分析,研究它们在遗传进化上的差异。2.4 RAPD技术(random araplified polymorphic DNARAPD技术为随

10、机扩增多态性DNA的简称,又称任意引物PCR,利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸(通常是10聚体为引物,对所研究的基因组DNA进行PCR扩增,从而达到对整个DNA进行检验的目的。在蜜蜂的微卫星片段被发现以前,已用它来分析蜜蜂的父系,验证单倍二倍性昆虫的遗传模式,进行蜜蜂的X位点与序列标签位点(STS间的连锁分析。Hant和Page以及Fonda也都先后采用含有50%GC的随机引物去鉴别蜂群中各个个体的遗传背景。如:用4只雄蜂的精液对蜂王进行人工授精,然后采用RAPD技术分析后代工蜂,可以很容易的找出这4个父亲。与以上技术相比,RAPD技术的主要缺点是工作量较大,这是因为随机扩增是在个

11、体水平上显示差异并且扩增点较多,用它进行群体分析(特别是蜜蜂,它是以群为基本实验单位,需要大样本数,还需要有效的统计学分析。RAPD的另一缺点是重复性差。为了解决这一缺点,又衍生出了其他一些技术,如SCAR(sequence-characterized amplified regions。它是根据目标RAPD片段设计引物,然后进行特异的PCR扩增,这样可以鉴定出与原先RAPD片段中相对应的单一扩增位点。除了上述几种方法外,DNA指纹图谱也是蜜蜂遗传领域中较常用的一种技术,也可用于鉴定蜜蜂的父系、确定蜂王交尾数目和频率。使用合成的(GATA14寡核苷酸为探针,作指纹图谱分析可找出蜂群中全胞同胞和

12、半胞姐妹。此外,Blanchetot用M13为探针进行DNA指纹图谱分析,结果在一个蜂群中鉴定出了11个父系。2.5 微卫星DNA(microsatellites DNA技术人们通过分析欧洲黑蜂、喀尼阿兰蜜蜂和意大利蜜蜂等工蜂的10个微卫星DNA,发现它们各存在7-20个亚家系(父系,并且分蜂时分出群工蜂的父系与原群封盖子的父系明显不同。用11个微卫星位点分析从西班牙南部到斯堪的纳维亚半岛(Scandinavia上外观相当一致的西班牙蜜蜂蜂群和法国饲养的蜜蜂蜂群的遗传多样性,发现如果没有基因渗透,西班牙蜜蜂在分类上属于独立种。对采自泰国北部的小蜜蜂DNA进行微卫星分布估计,小蜜蜂蜂王的有效交尾

13、数比西方蜜蜂蜂王少,小蜜蜂蜂王至少与5-14只雄蜂交配。Moritz et al根据沙巴蜂工蜂样本微卫星位点(A14、A76、A88的遗传变异估计蜂王的多雄程度.蜂王平均与(30.17±5.98只雄蜂交配(19-53只,平均每只蜂王交配有效数为(25.56±11.63次。在提取沙巴蜂工蜂的微卫星DNA样本后,扩增出某一序列的标签位点,并确定出这些位点的基因型,蜂王与10-32只雄蜂交尾,平均有效交尾数是(10.5±0.4只,蜂群内遗传相关系数为(0.31±0.03。2.6 线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA技术对澳大利亚塔斯马尼亚

14、岛上1831、1884年分别引入的纯种欧洲黑蜂、纯种意大利蜜蜂采用苹果酸脱氢酶和m tDNA的多态性分析技术进行纯度检验,发现在温暖的沿海地区,两亚种间有相当程度的杂交;而在凉爽的山区,杂交程度低得多,仍以纯种特征为主。通过对墨西哥聿科坦(Yucatan半岛上凶猛蜜蜂m tDNA分析,发现54%抽样的凶猛群由纯非洲蜂群组成,但20%蜂群含欧洲蜜蜂的线粒体型(m itotypes。对此,专家的解释是给非洲化蜜蜂的蜂群更换蜂王,可将欧洲蜜蜂的基因渐渐地渗透进来。将西西里西部的西西里蜜蜂与意大利东南部和中部的意大利蜜蜂m tDNA进行比较,岛屿蜜蜂明显不同于陆地蜜蜂.西西里蜜蜂带有强烈的非洲血统。用

15、m tDNA的变异性研究西班牙蜜蜂的生态型渐变群,表明一者几乎固定在西班牙南部和葡萄牙,在东北部的另一者几乎是纯种。而法国西方蜜蜂种群展现出m tDNA不同水平的渗透。如果不考虑渗透现象,则法国种群有2个生态簇,一个在法国的东北部,另一个包括瑞典和西班牙东北部的其它所有种群。在m tDNA和核DNA上选取2个等位基因分子标记,检验海角蜜蜂和东非蜜蜂间是否有基因漂变。海角产卵工蜂的影响愈强,一般m tDNA向东非蜜蜂群渗透就愈进一步。通常海角产卵工蜂孤雌生殖地产下雌性后代(产雌单性生殖,而其它亚种的工蜂产雄性后代(产雄单性生殖。通过产卵工蜂对蜂群的繁殖和适应性的贡献即可估计出海角蜜蜂基因渗透进东

16、非蜜蜂的程度。在美国加州,种用蜂王需通过m tDNA结合同功酶的变异酶谱分析,对其特性进行鉴定后方可出售。2.7 DNA指纹(DNA fingerprint技术DNA指纹分析技术因具有多态性强、谱带丰富且清晰可辨、实验结果稳定性和重复性好等优点而被广泛运用。该技术在蜜蜂遗传与育种上应用最多,主要包括:(1识别性连锁;(2分析同一蜂群内的工蜂关系;(3分析蜂王后代相关值;(4鉴定姐妹蜂王的基因型;(5分析迷巢雄蜂的遗传学组成;(6分析精子受精力的倾向性;(7分析海角蜜蜂基因型组成;(8区别全胞、半胞姐妹。有人用蜂王自己产的雄蜂为蜂王自身人工授精,以使其50%受精卵发育成二倍体雄蜂;取这些雄蜂蛹的

17、DNA建立第1个DNA库,从同一蜂王的70只工蜂中建立第2个DNA库,进行DNA库的筛选时,发现了仅存在于雌性蜂的一个DNA指纹等位基因,定名为Zb-3/TC。.由于二倍体雄蜂在任何一个 Za-3/TC 位点上都是纯合子，根据性位点假说，Zab-3/TC 标记与 X 连锁，因此，可识别性决定 位点。同样，DNA 指纹也可以确定每一蜂群内亚家系的数目和频率。例如，人工授精王的蜂群，亚 家系的数目与用于人工授精的雄蜂数目相关，而在自然交尾群内,亚家系的频率范围为 1%-26%，平 均有 12 个亚家系，与蜂王自然交尾数相关。一般情况下，同群内的工蜂,其相关系数为 0.328，相 当于它们的蜂王有

18、6.4 次有效交尾。 用单个位点 DNA 指纹，对海角蜜蜂中王位的竞争研究发现仅少数父系的工蜂产生了后代，产卵 工蜂的这些后代在所有核群中有同样的亚家系。进行同胞分析后 ,在生殖显性时观察到的变异中大 约 67%由亚家系间效应引起。这也可解释为由于某一性状高度遗传变异，而这一变异性状与适应性 紧密连锁。用单个位点 DNA 指纹，还可以确定每个姐妹蜂王领导的蜂群内每一只工蜂的基因型、每 一组蜂王的基因型或确定家系簇。有时会发现某一组的蜂王，尽管释放时意味着它们是姐妹蜂王， 但实际并不相关。若以反转录 DNA 片段（pMy7）作为探针，可确定蜂群中成员间的遗传关系。该指 纹有高度重复性，不显示非双亲带,可区别全胞和半胞以及亲缘和非亲缘的蜜蜂。Rinderer et al 对从沙巴州采集的大蜜蜂工蜂样本基因型进行单一