胶质瘤基因治疗的进展-- 细胞及分子生物学

1、胶质瘤基因治疗的进展- 细胞及分子生物学    1突变补偿目前对肿瘤的病因学研究发现，肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。突变补偿就是消除激活的癌基因或增强抑癌基因的功能。1.1消除激活的癌基因包括反义核酸、核酶和单链抗体技术。反义核酸是指与体内某 rNA或 dNA序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其转录或翻译过程的 rNA或 dNA片段。癌基因反义核酸的导入，抑制了癌基因编码蛋白质的合成，从而抑制癌基因的功能。胶质瘤常过表达一些生长因子。 tGF-是一种 t细胞抑制因子，用反义 tGF-表达质粒转导9L胶质肉瘤细胞，可使

2、荷瘤鼠长期生存率达100，12周后肿瘤消失，淋巴结效应细胞增加了34倍1。 vEGF可促进血管内皮细胞的分裂，把 vEGF vEGFR的通路打断，可抑制肿瘤血管的形成。 saleh等2把 c6胶质瘤细胞用反义 vEGF的真核表达载体转导， vEGF的表达水平下降，组织学检查见肿瘤内血管数目减少且有很大程度的坏死。肽生长因子 bFGF对胶质瘤的增殖、浸润有刺激作用。反义 bFGF使 u-87胶质瘤细胞增殖被抑制703。 trogan等4发现恶性胶质瘤有 iGF-1异常表达，此表达异常可促进肿瘤的生长；反义 iGF-1的导入，成功治疗了转基因鼠的脑内胶质瘤。虽然反义核酸治疗恶性肿瘤有一定效果，但也

3、有局限性，不能转运足够的反义核酸到靶细胞而达到长期逆转肿瘤的目的，现已设计了一种具有催化活性的反义 rNA，又被称为核酶（ ribozyme），它不仅可与 rNA结合，同时还能使其裂解，可反复使用。多形性胶质母细胞瘤（ gBM）表达 cD44粘附分子，设计了两种锤头核酶（ ham merhead ribozymes）来抑制 cD44的表达。两种核酶定靶于 cD44的外显子2上，对转录的 cD44S、 cD44R1RNA进行剪切，流式细胞仪（ fCM）检测显示了其对 cD44转录的裂解作用，这样降低了 cD44的表达5。单链抗体技术是利用抗体的特异性和高亲合特征，对表达抗体的基因进行操作，使其在

4、抗原结合区表达，又被称为内抗体（ intrabody）。 erbB2在许多肿瘤，特别是一些腺癌中过表达，将 erbB2单链可变区抗体（ scFV）基因导入肿瘤细胞内，可抑制 erbB2跨膜蛋白质的过表达，引起明显的细胞生长抑制6。这种“敲除”（ knockout）癌基因的方法很有效，也很有前途，但这方面报道较少。1.2增强抑癌基因的功能 p53是普遍公认的抑癌基因，是一种多功能蛋白质。它可以调节转录，监控细胞周期，激活细胞凋亡，控制 dNA的复制与修复，也发挥着保持基因组稳定的作用。许多肿瘤都发生 p53的点突变，突变使 p53抑癌功能丧失，而获得了肿瘤的形成能力。 frankel等7报道，在

5、40例胶质瘤中有16例（40）发生了 p53突变。 badie等8用 adP53转染9L细胞进行体内、外试验， pCR和 westennblot证实了 p53的转录和表达，抑制了肿瘤细胞的生长，使肿瘤体积缩小。 morita等9对521例多形胶母细胞瘤病人进行回顾性分析，其中10例生存期7年，这10例中有4例 p53过表达，表明 gBM病人的长期生存可能与 p53的过表达有一定的关系。新近又发现一种抑癌基因 p21WAF1 cIP1，为野生型 p53激活片段，也是周期依赖激酶的抑制剂。用 adP21WAF1 cIP1转导肿瘤细胞，可抑制其增殖和肿瘤形成。 p16（ cDKN2 mTS1）是一种

6、具有许多特性的肿瘤抑制基因，在胶质瘤中缺失率高达50。 fueyo等10用 ad5RSV-16将 p16基因导入胶质瘤细胞，可直接合成功能性的 p16，明显抑制了细胞的生长，改善了被转导细胞的恶性表型。2分子化疗该方法是将毒素基因释放到肿瘤细胞而达到化疗“辐射”的作用。在这方面研究最多、最深入的是 hSV-TK gCV系统。 hSV-TK基因表达产物可使对哺乳细胞无毒或低毒的核苷类似物（ gCV或 aCV）转换成毒性的 gCV-TP，抑制 dNA多聚酶并掺入到 dNA链中，导致肿瘤细胞的死亡。有关这方面报道较多，大多是采用产生 hSV-TK的逆转录病毒颗粒的包装细胞转导各种胶质瘤细胞， gCV

7、治疗后，发现肿瘤完全消退。也有对转导动力学和毒性进行了试验，发现该系统对小鼠、大鼠和猴基本是安全的；也未检测到插入突变和有复制能力病毒的产生。胶质瘤细胞处于活跃的增殖状态，易被自杀基因 tK转导。但也存在正常细胞转导表达 tK基因导致组织损伤的可能性，如肠上皮和骨髓细胞被转导可引起腹泻和骨髓抑制，为此，研究者们克隆了只在特异组织表达的启动子基因，用 mBP启动子与 hSV-TK结合就可只转导胶质瘤细胞， gCV治疗后使肿瘤消退，避免了腹泻和骨髓抑制等副作用11。对 hSV-TK基因的转导开始多采用逆转录病毒，近几年开始尝试用其它载体，如单纯疱疹病毒本身，腺病毒及质粒 dNA的直接注射等，对单纯

8、疱疹病毒进行操作，保留其 tK基因，去除那些编码神经毒性的基因如 rR（核糖核酸还原酶）基因，成为单纯疱疹病毒的突变体 hrR3，用此载体结合 gCV治疗胶质瘤很有效12。腺病毒以其极高的转导效率及安全性备受青睐。 maron13用腺病毒把 hSV-TK导入 c6胶质瘤中， gCV治疗后，肿瘤体积缩小28倍，生存期延长了4倍。也有学者把含有 hSV-TK的质粒直接注射来转导，这种质粒表达载体较安全，易构建。也可应用较强的启动子和脂质体包裹提高转导效率和表达时间。 hSV-TK gCV是第一个被批准用于人恶性胶质瘤临床试验的基因治疗系统。 oldfield14报道7例接受 hSV-TK gCV治

9、疗的病人，其中5例肿瘤缩小，临床效果和安全性都较好。其它研究机构有关这方面的报道尚少，总之仍处于实验阶段。3遗传性免疫增强法本策略是通过增强免疫反应而获得有效的抗肿瘤效应。可通过细胞因子、导入肿瘤相关抗原和其刺激分子来实现。细胞因子是调控免疫反应所必需的。把细胞因子导入肿瘤、抗肿瘤效应细胞（ lAK， cTL， tIL）或易于移植和在体内长期存活的载体细胞，使在肿瘤局部分泌高浓度的细胞因子，发挥抗肿瘤效应。目前已报道用于胶质瘤基因治疗的细胞因子很多，有 iFN-、 iFN-、 iL-1、 iL-2、 iL-4、 iL-7、 m-CSF等。 wei15和 nam16分别用 nIH3T3和内皮细胞

10、把 iL-4和 iL-2导入 c6和9L肿瘤内，可见肿瘤生长明显受抑，荷瘤鼠生存期延长。组织化学检测在注射部位有小胶质细胞、吞噬细胞、 cD8 nK细胞的浸润。 sobol等17报道了1例星形细胞瘤病人，用自体肿瘤细胞混合 iL-2基因修饰的成纤维细胞，分10次皮下注射，病人细胞免疫反应增强，治疗4周后，肿痛有明显的坏死。但是，由于细胞因子生物学作用多样性，其与疾病发生发展的关系相当复杂，加上细胞因子在体内处于一个复杂的细胞因子网络（ cytokinenet-work）之中，并受到整体调节，如何在体内充分发挥其治疗作用仍需进一步研究。肿瘤的发生与肿瘤细胞逃避机体免疫反应有关，这是由于肿瘤细胞免

11、疫原性比较差，不足以刺激机体产生抗肿瘤的免疫反应。导入肿瘤相关抗原，提高肿瘤细胞的免疫原性，从而达到抗肿瘤的目的。 asai18把 s-myc基因与巨细胞病毒启动子结合转导 c6、9L胶质瘤，抑制了肿瘤的形成。这是由于 s-myc的表达刺激 c6、9L肿瘤相关抗原提呈给 t-淋巴细胞，激活了宿主的免疫反应。缺陷型单纯病毒型（ dlsptk）治疗胶质瘤有效，部分是由于病毒的感染，肿瘤细胞表面产生新抗原而诱发的免疫反应所致。 b7是激活 cTL细胞的第二个信号， b7分子的导入可激活 cD8 cTL细胞，引起肿瘤消退。 yang等19把 b72cDNA用质粒导入 p815细胞中，引起 p815肿瘤的消退，而且对 p815的再次攻击产生抵抗。 zitvogel20把 iL-12和 b71共同导入肿瘤细胞中，抗肿瘤效应更明显。这种联合应用两种或多种方法可能成为今后治疗肿瘤的一