豆科牧草生物固氮20101017

1、8.5 豆科牧草根瘤菌的共生固氮玉永雄1 何庆元21西南大学2安徽科技学院20世纪以来，单位面积上粮食产量的增加很大程度上归功于化肥的施用。近年来氮肥的施用量越来越大，但肥料的利用率却在不断下降，大部分进入地下水，使江河湖泊富营养化。大量施用氮肥，致使土壤板结，降低了土壤的蓄水保墒能力。并且工业氮肥是在高温高压下生产的，消耗大量石油、煤炭等不可再生的能源，同时造成对环境的污染。生物固氮是固氮微生物在常温常压下利用可再生能源（太阳光）固定空气中的氮素，使之能直接被生物吸收利用的过程。生物固氮固氮量大，是工业固氮的三倍，不但可以使农作物增产而且也不会出现对环境的任何污染，同时改善土壤，降解土壤中的

2、毒素，是可持续农业发展的重要措施。因此，加强固氮微生物活动，利用生物固氮获得氮肥，是今后氮素肥料研究的主要方向之一。而共生固氮是生物固氮中最重要的固氮形式，其固氮量占整个生物固氮的一半以上。8.5.1 共生固氮的概念共生固氮是指植物和微生物相互作用，形成共生体系，在这个体系中微生物（小共生体）发挥其固氮活性，使大气中的游离的氮气转化为生物可利用的化合态氮的过程，而植物（大共生体）在此过程中为微生物提供固氮所需的场所、环境和能源，并促进微生物发挥固氮作用。8.5.1.1 共生固氮的类型固氮生物多种多样，除了少数蓝藻外，大多是一些简单最原始的生物。固氮生物一般分为非共生固氮和共生固氮两大类。其中共

3、生固氮是最重要的固氮方式，迄今为止，发现的共生固氮类型大致可分为以下五类：1）豆科共生固氮型：固氮菌为生活在豆科植物根内的细菌，如苜蓿根瘤菌，有近900个种。2）非豆科共生固氮型：生活在非豆科植物根上和根内的菌，如与杨梅、木麻黄等近120种非豆科植物共生的固氮菌，多数为放线菌，也有真菌、蓝藻、细菌、分枝杆菌等。3）联合固氮型：植物根际上的联合固氮微生物进行生物固氮，如生活在植物（水稻、小麦、玉米等）根表和根际的极毛杆菌、酵母、细菌等。4）叶瘤和叶面微生物固氮型：生活在某些植物叶中的细菌（如杆菌、分枝杆菌、蓝藻等）和叶面的固氮菌（如极毛杆菌、酵母、细菌等）进行生物固氮。5)其他：如菌根（小球菌和

4、放线菌），地衣（多种蓝藻），绿萍（念珠菌）等。8.5.1.2共生固氮研究的历史回顾和展望1) 生物固氮研究的起步阶段对生物固氮的认识和研究最先是从豆科植物共生固氮开始的。在人们对生物固氮概念尚未明确之前，我国劳动人们在生产活动中，就知道豆科植物能够肥田。公元前三世纪的西晋广志中就有利用苕子和水稻轮作增产的记载。最先从科学上证明生物固氮的是1883年法国农业化学家J.B.Bousinggault根据田间试验和化学分析的结果指出，豆科植物可以从空气中取得氮素营养。1866年俄国学者沃罗宁（M.C.Bopo）最先发现豆科植物根瘤中含有微生物，并指出根瘤的形成是微生物侵染的结果，但他没有把根瘤的形成和

5、豆科植物的固氮作用联系起来，直到1886-1888年德国学者H.Hellreigel等用砂培试验证明，豆科植物只有形成根瘤时，才能固定空气中的氮素。1888年，荷兰学者M.W.Beijerinck证明了豆科植物根瘤是由细菌引起的，并分离纯化获得了根瘤菌纯培养物。接着，波兰学者Prazmowski用根瘤菌纯培养物接种豆科植物，形成了根瘤。2) 生物固氮研究的飞跃发展阶段从20世纪20年代起，生物固氮研究偏重于描述各种生物固氮的类型、形态、分类和固氮菌的生理生态方面。40年代后，则集中在生理和生物化学方面，人们对生物固氮的了解只停留在整体细胞水平上。直至1952年，Stone和Wilson得到固氮

6、菌的无细胞提取液，将研究推进到细胞水平，成为固氮生化的转折点。1974年，英国Beringer等学者发现的R6845质粒在根瘤菌之间推动染色体基因的转移，进一步将根瘤菌的研究推进到共生固氮基因的水平上。20世纪末的几十年中，由于分子生物学和生物化学飞速发展，尤其是酶学在固氮以外的其他方面所积累的大量知识，以及近代物理、化学技术的广泛应用，在固氮酶的分离、纯化、结晶、结构与功能、生物固氮的能量来源、酶促反应及催化机理、电子传递和防氧机制、化学模拟生物固氮等进行了深入的研究，取得了突破性的进展。而20世纪以来，固氮的研究从微观上进一步深入到了分子水平，对固氮基因、结瘤基因以及固氮基因组和竞争结瘤等

7、方面都做了大量的工作，也取得了阶段性的成绩。从宏观上，进一步从生态的角度研究固氮作用，并且加强了对植物与固氮微生物相互关系的研究，植物光能利用率和固氮的关系将作为进一步研究的内容。3) 共生固氮的研究方向和展望目前的共生固氮研究，正围绕着如下几个方面的问题进行：固氮生物资源的进一步开拓利用，固氮微生物的系统分类和遗传地位，现有固氮生物固氮能力的提高，寻找更高效的固氮微生物；固氮微生物的逆境生理，在环境条件胁迫下寻找高效的固氮菌；固氮遗传和遗传工程的研究，利用生物技术改造菌株，提高菌株的固氮能力；其他，如光合固氮及其与氢代谢的关系以及植物固氮相关基因的定位和克隆等。这些研究中，学者们正期待能够实

8、现下面一些美好的愿望：进一步增加已知的植物微生物系统所得固氮量。建立更好的甚至是新的植物微生物共生关系，特别是将根瘤菌转移到其他非豆科植物上，实现固氮作用；将固氮基因转移到不固氮的植物上，使这类植物自己利用大气中的氮自己解决氮素营养问题；发展在常温常压下合成氨等。8.5.2 根瘤的形成、结构与功能豆科植物固氮是豆科植物和根瘤菌相互作用，形成根瘤，由根瘤菌在根瘤内提供固氮活性酶，植物提供固氮所需的环境和能源的相互协作的过程。因此，根瘤菌、植物及其相互作用都能影响共生固氮。根瘤菌和植物的相互识别、相互作用是一个非常复杂的生理、生化过程，涉及到植物和根瘤菌的各个方面。8.5.2.1 根瘤的形成过程豆

9、科植物根瘤的形成是根瘤菌和植物之间对抗和协调的统一，最终成为相互有利的共生关系。但在某些情况下，协调关系不能完全建立，如根瘤菌对豆科植物只是单纯寄生。根瘤形成过程大体上可分为感染，根瘤的发生和根瘤的发育三个阶段。从起源划分，根瘤又分为外生型和内生型两种。外生型的感染局限于皮层的薄壁组织，除维管束以外，根的中柱组织和根瘤的形成无关。内生型根瘤的组织完全是由中柱鞘的再生分化而形成的。1）感染和侵染过程根瘤菌一般通过豆科植物的根毛对植物根部进行感染，也有直接通过细胞壁感染。还有一些植物是由侧根穿过表皮的裂隙部位侵染植物组织内部。而水生的豆科植物则是从表皮层细胞侵染根部。感染形成的根瘤一般有两种类型，

10、一种无限生长型根瘤（如：三叶草、苜蓿、豌豆等），具有顶端分生组织，在根瘤成熟后能继续生长，使根瘤体积增大，以致分叉。另一种是在有限生长型根瘤，没有分生组织，生长发育一段时间后，各部分同时分化成熟，根瘤体积不再增大（如大豆、豇豆、山麻黄、花生等），如图8-1。无限型根瘤 有限型根瘤图8-1 无限型根瘤和有限型根瘤（引自 李阜棣，2000）根瘤菌和豆科植物相互作用时，首先是豆科植物根系在土壤中生长，刺激相应的根瘤菌向根际移动并大量繁殖。根的这种影响甚至可以达到2-3厘米远的距离。这时，许多根瘤菌吸附在根的表面。这种吸附不是简单的物理过程，而是豆科植物与相应的根瘤菌之间的特定识别作用。其基本过程为：

11、1）植物分泌特异的黄酮或类黄酮物质；2）根瘤菌合成和释放类似几丁质的寡聚多糖（胞外多糖）；被称之为结瘤因子；都含有35个糖苷基单位组成的b-1,4-N乙酰葡萄糖胺骨架；在非还原段C-2位上有一脂肪酸链；因菌种不同，两端的其它碳位上具有不同基团，它们决定结瘤作用的特异性；3）如果结瘤因子能够正确识别出黄酮或类黄酮物质，就会激活其它的nod基因，然后这些基因的编码蛋白共同形成结瘤因子；4）植物再识别并确认正确的结瘤因子，这样，结瘤因子就启动了结瘤的早期过程；5）除结瘤因子之外，根瘤菌的胞外多糖可能在以后结瘤过程中(细菌侵染植物细胞)起到重要的识别作用。根瘤菌进入根毛细胞的部位，根毛细胞壁内陷，并开

12、始分泌一种含纤维质的物质，将根瘤菌包围起来，随着根瘤菌向前推进，形成一条管状的分枝或不分枝的纤维素鞘，称着侵染线。在显微镜上可看到根瘤菌在卷曲的根毛壁上形成一个明显的点，并不断膨大。侵染线不断延伸，直到根的内皮层。在适宜的寄主细胞中，侵染线细胞破裂，细菌释放到寄主细胞的细胞质中，然后，每个细菌由寄主植物产生膜包围起来，膜和膜之间留有空隙，可以让植物细胞内氧、氢和二氧化碳等气体，有时包括氨气体通过，以适应生物固氮的需要。根瘤菌侵染线形成和发展过程中，根毛细胞核具有十分重要的作用，如果最初侵染点上没有细胞核，侵染线就不能发育而造成其凋亡。侵染线使根毛生长速率减少7-10m h-1。McCoys (

13、1932)对紫花苜蓿的研究表明，侵染线在化学结构上与根毛壁是相似的。侵染线的形成频率相当低，在这些侵染线中，根瘤菌分开被包围在一种尚未成型的结构中。这种结构由细菌外多糖和植物糖蛋白组成。侵染线的尖端是开放的。侵染线尖端的封闭会导致其不能形成。Vance (1983)认为，侵染线的根毛细胞壁对试图穿透或机械伤害产生应答性生长，这与对疾病的抵抗反应是类似的。根瘤菌在侵染线内不断繁殖，侵染线也就不断伸长，向根毛基部和表皮细胞推进。每小时约可前进5-8m，1-2天内到达表皮细胞。通常每条根毛有一根或几根侵染线，但只有个别侵染线能够持续发展。当侵染线到达根毛细胞基部的细胞壁时，侵染线壁同细胞壁联接起来，

14、穿过表皮细胞壁向根内推进。侵染线到达根的皮层后就分枝发育，侵染线侵入根的皮层组织的深度随植物种类和入侵位置而异。在大豆主根中，侵染线只能达到皮层第5-6层薄壁细胞；在侧根中，由于皮层细胞的抵抗力较弱，侵染线可直达到中柱鞘细胞层。2）根瘤的发生和发育当侵染线到皮层3-6层细胞时，位于前方靠近内皮层的细胞受到影响，开始分裂，成为根瘤的分生组织。而寄主根部皮层细胞进一步分裂发育增长形成纤维厚壁组织，在外观上凸出到根的表层上，成为“疙瘩”，即所谓的根瘤。不断长大的根瘤分化为外皮层组织和内部组织，并形成维管束与根的维管束接连起来，建立了共生关系。共生开始后，根瘤菌聚集在寄主细胞的细胞质外围，大量繁殖，变

15、成环带状的肿大类菌体。在圆球状有限型生长根瘤中，如Lotus, Glycine, Phaseolus 和Vigna，结瘤分生组织在外皮层开始。然后，在内皮层细胞也产生分裂。这些分生组织融合，形成初始根瘤体。通过细胞膨大向四周分裂，产生圆球状根瘤。分生组织仅在根瘤发育的早期发挥短期（8-14天）作用。成熟有限生长型根瘤组织没有分生能力。相反，在无限生长型的根瘤里，如苜蓿和三叶草，根瘤分生组织发育是在邻接内皮层的内皮部。无限生长型的根瘤发挥数个月的功能，在有些多年生木本植物里甚至长达数年。并且细胞单向分裂，分生组织分化成为一种杆状。细胞分裂后接着进行细胞扩大，导致形成一种长、圆柱型的根瘤。随着根瘤

16、生长，有些根瘤的顶端区域分化十分频繁，导致产生具有分枝、珊瑚状的根瘤。3）细胞间直接侵染在许多生长在热带和亚热带豆科植物中，没有观察到侵染线。花生、田皂角属（Aeschynomene）的一些种和某些柱花草属（Stylosanthes）的种，仅在侧根突出处发现长有根瘤。又如在田皂角（Aeschynomene indica）和圆锥田皂角（A.pamiculata）存在茎瘤。研究表明豆科植物中存在另一种感染方式。这种方式表现为根瘤菌能够诱发根毛的卷曲与分枝，但这种方式仅发现于侧根突出处。然而，这种根瘤菌的入侵仅限于通过根毛壁和邻接的表皮和皮层细胞间的空间突出处。并且感染仅发生于根毛有膨大基部细胞处。

17、虽然仅仅是被感染的突出侧生根的皮层细胞发育为根瘤，但最初被根瘤菌入侵的是上述根毛着生的膨大基部细胞。根瘤菌侵染宿主植物的感染方式取决于寄主植物，而不是由细菌的基因组所决定。8.根瘤的结构和功能1）根瘤的结构根瘤菌在寄主植物中形成的根瘤分为五个部分：1）由小细胞组成的分生组织，这些小细胞不会被根瘤菌侵染，只能促使根瘤的生长。2）侵染线区域：这一区域的细胞增值很快，被根瘤菌侵染，但并不固氮。3）固氮区域：在寄主植物这部分细胞里充满了根瘤菌，菌体外形膨大，呈各种形状，称为类菌体。这种形态的根瘤菌里含有固氮酶，因此能够固定空气中的氮。固氮酶中含有铁和钼，这两种金属在传递电子中具有重要作用。此区域呈红色

18、或粉红色，是细胞内含有豆血红蛋白的缘故。豆血红蛋白是一种将氧传递给类菌体的红色素，保证固氮所需的无氧或低氧环境，又能满足固氮所需的能量。4）退化区域：呈浅绿色，细胞已经退化，不再固氮。5）维管系统：在中柱的导管中形成，用以为根瘤输送营养物质，把固氮所需的碳水化合物输入根瘤，同时把合成的含氮化合物运送到叶中去。不同类型的根瘤由于生长和发育的方式不一样，其形状和大小不一，无限型根瘤是长、圆柱型的，常象珊瑚状，在根瘤的末端有顶端分生组织。成熟根瘤有三个色区：1）白色区，它包括根瘤分生组织和侵染线区；2）粉红色区，存在有豆血红蛋白，它是有效固氮的部位，含有不同发育阶段的类菌体（有固氮酶活性的细菌）；3

19、）老根瘤的绿色区，预示根瘤基本衰老。有限型根瘤呈圆形，其单个根瘤内没有太多的分生组织。新形成的小根瘤是白色并含有大量可分裂的细胞，在豆血红蛋白作用下，有的瘤表现出粉红色。衰老的根瘤是绿色或棕色。不同发育时期的根瘤可以在成熟植物任何一个时期内形成。2）根瘤的功能根瘤是固氮作用的场所，根据其不同组份的作用可以分为以下三类功能。第一类是根瘤中固氮作用的能量供应及产物的同化和转运的酶类。根瘤菌的生存、代谢活动和固氮都需要能量。植物地上部分光合作用产物运输到根瘤中，经过代谢产生还原力、ATP和一些代谢产物，供给类菌体中固氮酶进行固氮之用。光合作用每同化100单位碳，就有32单位转运到根瘤中；而类菌体每固

20、定100单位氮，只有6单位保留在根瘤中，绝大部分运送给植物的地上部分，一小部分转送给根系，固氮产物氨输送给植物，为植物合成蛋白质提供原料，同时也防止了氨在根瘤内累积而毒害类菌体中的固氮酶，从而提高了固氮效率。第二类是根瘤色素。根瘤发育形成一定的结构物质，可使根瘤内环境维持在厌氧状态。有效根瘤由于含有一种豆血红蛋白，呈现红色，豆血红蛋白能够为类菌体提供低浓度和高流量的微环境，在根瘤中起调节氧的缓冲剂作用，把多余的氧气送走。因为固氮酶在氧压较高时失活；而为了提供还原作用的能量，类菌体又需要氧进行氧化磷酸化，这样也为ATP形成创造了条件。第三类是与根瘤的固氮效率相关酶类。根瘤中进行的固氮作用和豆科植

21、物的整个新陈代谢结合起来，使这种共生体系的固氮效率比自生固氮体系高很多。自生固氮菌每消耗1克碳水化合物固氮约10毫克，肺炎克氏杆菌约为5毫克，而根瘤菌豌豆共生体系可以达到270毫克。虽然自生固氮菌比活性（即每克细胞蛋白每小时固氮量）比根瘤菌高，但类菌体利用能量的效率高，特别是其固氮周期长，因此，它的总固氮效率显著高于其他固氮体系。一般认为，影响共生固氮有三个方面的因子：1）根瘤的数目；2）在每个根瘤中含菌组织的容积；3）含菌组织固氮持续的时间。在固氮效率上，以往的研究表明根瘤菌存在有效菌株和无效菌株。事实上，根瘤菌的有效性和无效性，不仅与菌株的本性有关，而且也与其共生的寄主植物的种类甚至品种有

22、关。8.5.3根瘤菌与豆科植物的关系豆科植物共生固氮占整个生物固氮量的1/2以上，而豆科植物是只有和根瘤菌形成的共生关系后，才能固定大气中的氮。大量的研究表明，豆科植物的固氮效率受到寄主、根瘤菌和两者相互作用三方面的影响。不同的根瘤菌株在不同品种的豆科植物上的固氮能力往往不一致。提高固氮效率的关键在于有一个使高效根瘤菌进入同时又有拒绝土壤中大量无效或低效根瘤菌的分子识别系统。而与豆科植物根瘤菌共生固氮有关的基因涉及根瘤菌基因和宿主基因，根瘤菌基因有结瘤基因(nodD、nodABCIJ和hsn基因),根瘤菌细胞表面结构基因(exs、lps和ndv基因)和固氮基因(nif、fix基因)和结瘤效率基

23、因（nfe）；宿主基因主要是结瘤素基因(ENOD和NOD基因)。根瘤菌结瘤基因表达后诱导产生结瘤因子，在根瘤发育过程中,这些基因在根瘤菌与植物之间进行着信息交换,并且具有不同表达水平的结瘤因子和植物激素对它们进行着调节。8.5.3.1 根瘤菌与豆科植物的互接种族关系根瘤菌的突出特点是能够进入豆科植物的根内，在其中繁殖并形成根瘤，同时能利用分子态氮作为氮素营养。根瘤菌的各个菌株只能感染一定的豆科植物。有的菌株只能感染一种豆科植物；而有的可以感染多种豆科植物。不论是何种根瘤菌，在与豆科植物根系上形成的根瘤上，根瘤菌对寄主植物的感染性具有专一性和有效性。由于根瘤菌与豆科植物的共生固氮特点以及这种共生

24、关系的重要农业意义，在根瘤菌的研究中，包括根瘤菌的分类学的研究，始终与研究它们和豆科寄主的关系联系在一起。根瘤菌在豆科植物根上形成根瘤的专一性，构成了“互接种簇”关系。在同一互接种簇内的植物，一般可以为本接种簇内的根瘤菌交叉感染形成根瘤，而不同互接种簇之间，则不能互接形成根瘤。目前对互接种簇的确切概念在看法上也有分歧。尽管如此，下面所列的豆科植物与根瘤菌互接种簇的分类，一般能为人们所接受。属于快生型根瘤菌类的可分为：1）紫花苜蓿簇：包括草木樨、紫花苜蓿、胡卢巴属在内。其共生菌为苜蓿根瘤菌；2）三叶草族：共生菌为三叶草根瘤菌；3）豌豆族：包括豌豆属，蚕豆属，刀豆属，香豌豆属、鹰咀豆属等；4）菜豆

25、族：包括菜豆属中的一些种，如菜豆、四季豆、扁豆、赤豆、绿豆、红花菜豆。共生菌为菜豆根瘤菌。属于慢生型根瘤菌类的可分为：1）羽扇豆簇：包括羽扇豆和乌足豆族植物。共生菌为羽扇豆根瘤菌；2）大豆族：大豆属的大豆、青豆。共生菌为大豆根瘤菌；3）豇豆族：包括豇豆、扁豆、刀豆、山扁豆、山绿豆、木蓝、花生、猪屎豆、赤豆、胡枝子、合欢、含羞草、野百合等植物。共生菌为豇豆根瘤菌；4）紫云英族：如紫云英属的红花草。共生菌为紫云英根瘤菌。以上列举的互接族仅仅是豆科植物的一小部分，即使是一小部分也表现出许多例外和交叉互接种现象。.2共生固氮相关的基因与作用1）与共生固氮有关的根瘤菌基因在豆科植物根瘤菌共生固氮体系中，

26、参与根瘤发育的根瘤菌基因可分为以下四类。第一类是结瘤基因(nod、nol、noe)，其主要功能是共生关系早期信号分子的形成与交换。它们位于根瘤菌的共生质粒(symplasmid)上，包括3组：调节基因(nodD)，共同结瘤基因(nodABCIJ)和宿主专一性基因(又叫基因hsn)，如nodH。调节基因nodD存在于所有根瘤菌中，一般是组成型表达，其产物可激活其它nod基因的表达，但它的激活又受到宿主植物专一的黄酮类物质的调节。原因是nod蛋白在类黄酮的存在下能够和nodD基因启动子中的3060bp长的高度保守的核苷酸序列（即nodbox）结合。一般认为，nodD是一转录结合物，调节其它nod基

27、因的表达。共同结瘤基因nodABCIJ存在于所有根瘤菌中，具有较高同源性，并且在功能上是互补的，它对豆科植物根毛卷曲和皮层细胞分裂是必须的。宿主专一性基因控制根瘤菌的宿主范围。第二类是与细菌细胞表面结构有关的基因(exs、lps、ndv)。根瘤菌的结瘤基因表达后,将合成并分泌一类脂寡糖化合物（即结瘤因子），作为根瘤菌返还给宿主植物的信号分子。所有根瘤菌分泌的结瘤因子都具有相似的骨架结构：一个由35个N-乙酰氨基葡萄糖组成的糖骨架和在还原糖末端C2上连的一脂肪酸链构成。但不同根瘤菌来源的结瘤因子在侧链上羟基的取代基团、脂肪酸链的长度和不饱和方面表现出较大的差异，而这些结构的差异是与根瘤菌的宿主范

28、围紧密相关的。与根瘤菌细胞表面结构有关的基因，即与胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)和中性葡聚糖合成有关的基因，分别称exs、lps和ndv基因。它门对建立共生固氮关系是很重要的，这类基因突变导致不能形成侵染线或形成空瘤。第三类是固氮基因(nif、fix)，分为固氮酶基因（nif基因）和共生固氮基因（fix基因）。nif基因是固氮微生物所共有的，有高度的保守性，它与肺炎克氏杆菌(KPneumoniac)有同源性的固氮酶结构或调节基因。其中nifA是转录调节基因，它对其它nif基因和某些基因进行正调控；nifDH是固氮酶的结构基因；nifL是负调节基因。fix基因是只在根瘤菌中发现的、控制共生

29、固氮作用的基因，其中fixABC在电子传递中可能具有作用；已报导fixC对膜嵌入有一个信号序列；fixLJ对nifA基因转录调节。第四类是结瘤效率基因（nfe）。这是一个控制竞争结瘤的基因，如nfeA，B，D。在苜蓿根瘤菌的一个隐晦大质粒pRmeGR4b上，发现了约5kb的新的共生片段，该区域的突变导致结瘤的延迟，其结瘤效率较野生型菌株低。nfeC基因的表达需要有功能的nifA基因的存在。2）与共生固氮有关的植物基因在根瘤发育的各个阶段，一些植物基因得到特异性表达，这些在根瘤发育中特异表达的植物基因被称为结瘤素(nodulin)基因。通过对根瘤菌发育的不同时期的cDNA文库进行差异筛选，已经从

30、多种植物中分离鉴定出了许多结瘤素基因。在根瘤固氮开始之前，表达的植物基因被叫做早期结瘤素基因(ENOD)，相反在固氮开始时和之后，表达的植物基因则称为晚期结瘤素基因(NOD)。Enod一般在根瘤接种数小时后到根瘤具有固氮能力之前发生作用。而Nod大多数在根瘤有固氮活性后才开始表达，与固氮作用具有密切关系。研究最多的是豆血红蛋白(Lb)。3）共生固氮各阶段的信息传递和基因表达豆科植物与根瘤菌共生形成根瘤的过程可分为5个阶段。第一阶段是根际的殖民化。根瘤菌趋向性地接近根毛细胞，并在植物根际繁殖的过程称根际的殖民化。根瘤菌对豆科植物根际的殖民化是由细菌的趋向性和根分泌物刺激根瘤菌生长的潜力来决定的。

31、豆科植物分泌的黄酮和类黄酮能够特异性识别根瘤菌产生的胞外多糖等物质，导致根瘤菌向根际运动。第二阶段是根毛细胞变形和卷曲。通过比较接种野生型根瘤菌和nodABC突变体或未接种的根毛细胞mRNA的体外翻译蛋白图谱，发现接种根瘤菌的根毛细胞中，mRNA在根毛发育早期也显示出较高水平，反映根瘤菌能促进根毛细胞发育。结瘤因子的脂肪酸链是其诱导根毛变形所必需的，但脂肪酸的结构并不是很重要。第三阶段是侵染和侵染线的形成。在根瘤菌的作用下，豆科植物根毛卷曲部位植物细胞壁局部水解，细胞质膜向内生长，同时新的细胞壁物质沉积在内陷的质膜处，形成一种管状结构，即侵染线。细菌就是通过侵染线传递到根内皮层的植物细胞中。随

32、着侵染线向根毛基部生长，在被侵染部位高度液泡化的根皮层细胞被激活，这些活化的细胞进行细胞质重排，形成横跨中央大液泡的辐射状胞质桥，这种胞质桥被认为是为侵染线通过作准备，因而被称为前侵染线。RNA原位杂交研究表明，寄主的PsENOD12基因特异地在根瘤菌接种后的根毛细胞和含侵染线的根皮层细胞中表达，而PsENOD5基因只在侵染线前部的皮层细胞中表达。而对根瘤菌突变的研究也表明，细菌表面物质在侵染过程中起重要作用。EPS、LPS和葡聚糖是根瘤菌侵染植物的重要物质，其突变体一般不能有效地侵染植物细胞。其中LPS的O-抗原基因对细菌的释放非常重要，其突变体只能形成小的无效根瘤。不能分泌环化葡聚糖的根瘤

33、菌虽诱导植物形成小根瘤，但这种根瘤只有少量侵染细胞。环化葡聚糖可避免植物防卫反应中起作用，并在细菌的渗透适应中起作用，它为细菌创造适当生长环境。第四阶段是根瘤原基和分生组织的形成。在根瘤菌侵染根毛细胞的同时，根皮层细胞也被激活并开始细胞分裂。皮层细胞分裂，以及形成什么样的根瘤是由宿主植物决定的，而不是由根瘤菌决定的。在根皮层细胞分裂形成根瘤原基时，一些植物基因得到特异性表达，如早期结瘤基因ENOD12，ENOD40。PsENOD12不仅在含侵染线的细胞中表达，而且也在根瘤原基细胞中表达。PsENOD40的表达模式和PsENOD12相似。这2个基因都不在分生组织中表达，除了在根瘤原基的诱导表达外

34、，PsENOD40也在面对根瘤原基的根中柱鞘细胞中表达，因此该基因有可能控制中柱和根皮层之间的物质运输和信息传递。结瘤因子能够诱导根内皮层，特别是对着原生木质部的部分，形成根瘤原基。早期结瘤素基因PsENOD12和PsENOD5的表达模式与结瘤因子诱导根瘤原基的形成是一样的。因此，结瘤因子可能是根瘤原基形成和早期结瘤素基因表达所需的唯一的细菌信号分子。第五阶段是根瘤发育。在根瘤的生活周期中，分生组织连续不断地向基部分化形成中央组织和外周组织。中央组织是被根瘤菌侵染的组织，而外周组织包括根瘤皮层、内皮层和根瘤薄壁组织，是根瘤维管束存在的地方。分生组织不断地分化形成根瘤组织，其结果中央组织含有处于

35、不同发育时期的细胞，苜蓿根瘤可分为5个区段：顶端分生区、固氮前区、间隔区、固氮区和衰老区。目前为止还未发现在顶端分生组织中特异性表达的基因。PsENOD12只在固氮前区的上部表达，而PsENOD5在所有固氮前区的侵染细胞中表达，且在该区的基部达到最高，而PsENOD40则在整个固氮前区具有相同的表达水平。在固氮前区的上部，根瘤菌nod基因表达了，而在其基部不表达。这表明nod基因在侵染线或刚释放的根瘤菌中是表达了的，进而结瘤因子可能是在根瘤的该区合成的。固氮前区向间隔区的过渡区，其淀粉积累的开始与根瘤菌基因ropA和几个结瘤素基因表达的急骤下降，及几个晚期结瘤素基因PsENOD6和根瘤菌基因n

36、ifH开始表达。在固氮区，结瘤素基因，如PsENOD6、Lb、根瘤菌基因nifH都在固氮区表达了。在衰老区可能表达其他植物器官衰老相似的基因（如编码水解酶基因）。大部分结瘤素基因是在根瘤中央组织中表达的，只有2个早期结瘤素基因，即ENOD2和ENOD40在外周组织中表达，其中ENOD2特异地在根瘤薄壁组织中表达。8.5.4固氮机制豆科植物根瘤菌共生体系的生物固氮是生物界重要的生理现象。共生固氮效率是多种因子综合作用的结果。8.5.4.1 固氮的酶学机制固氮酶所催化的反应通过两个步骤来完成。组分是一个多聚蛋白，由两个相当分子量各为5.0×104的亚基和两个相当分子量各为6.0×

37、;104的亚基组成，和亚基分别由nifD和nifK基因编码。由于组分含有4个4Fe-4S连接桥和两个铁-钼辅因子（FeMo-Co）组成，所以称为铁钼蛋白（FeMo-protein）。组分含有两个完全相同、分子量为3.0×104的亚基，由nifH基因编码。它只有一个4Fe-4S连接桥，称为铁蛋白，位于两个亚基之间，一次只可送出一个电子，是固氮反应的“瓶颈”，固氮酶的结构如图8-2。固氮酶（nitrogenase）的有三个活性部位，具有不同的功能：1）铁蛋白，如铁氧还蛋白（ferredoxin）或黄素氧还蛋白（flavodoxin）的还原物，他们是电子携带者。2）电子转移部位，将单一电子

38、从铁蛋白转移到铁钼蛋白，是依赖MgATP过程,，随着2MgATP水解转移一个电子。3）电子转移的受体，其键结合在铁钼蛋白的活性位置，其作用是将将氮气转移至受体。氮固定的反应式如下：N2 + 8H+ + 8e¯ + 16MgATP 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi固氮酶不仅可将氮气分子还原为氨，亦可将氢离子还原为氢气，还可还原不饱和的乙炔、叠氮化物、氰化物等不饱和分子。图8-2 固氮酶的结构（引自 尤崇杓等，1987）对于固氮酶的所有底物还原反应来讲，MgATP是不可缺少的重要物质。MgADP既是固氮酶的产物，又是固氮酶的生理抑制剂，能抑制固氮酶的各种底物还原活性。

39、固氮酶的活性受ADP/ATP比例变化调节，当ADP/ATP1/2时，则固氮酶活性完全受到抑制。目前认为MgATP的作用主要有：1）ATP提供电子转移时所需的能量（活化电子），作为电子传递的能量供应者；2）移去电子活化中心上的OH-而使之较易变为还原态；3）改变酶蛋白的构型，其功能之一首先是和铁蛋白并使铁蛋白的构型发生特异的变化，从而使其适应底物还原；4）ATP水解供给氮还原所需的质子；5）与钼氧化态作用生成有活性的钼还原态；6）参与形成酶金属氢化物。并且ATP在生物固氮中的作用是专一的。而MgADP的功能主要是1）使铁蛋白发生限速构象变化，抑制从SO2.-到铁蛋白以及从铁蛋白到铁钼蛋白的电子转

40、移；2）对固氮酶的底物还原活性部位起负的别构调节作用。8.5.4.2 固氮的基因及其调控实验已经证明根瘤菌的结瘤、固氮和编码氢化酶的基因都位于根瘤菌质粒上，通过质粒在不同根瘤菌菌系间转移，可以改变根瘤菌的结瘤固氮作用。而根瘤菌的基因中，nifAL基因控制着整个固氮酶系统的表达活性。事实上，nifA和nifL基因产物分别是nif操纵子的正和负调控因子。但细胞内没有NifL蛋白质时，即使在有NH3和O2存在的情况下，nifA基因产物足可激活其他nif基因的表达。并且nifA基因对固氮活性的影响是通过反式作用因子实现的。很多不能固氮的突变体突变位点在nif区以外，因为在nif区外存在氮调控（nitr

41、ogen regulation, ntr）位点，而nifA基因产物只有在ntrA、ntrC基因产物的共同作用下才能正常工作，激活nif操纵子群。看起来，ntr系统像一个粗调开关，而nifAL系统则像一个微调开关，两者共同作用，调控nif基因的表达。8.5.4.3影响固氮效率的因素1）土壤因素通常豆科植物仅依靠共生固氮难达到高产目的，一般仍需要配合施用少量化学氮肥。在苗期施用少量氮肥可加强植株光合作用，促进根系生长，为根瘤菌感染和结瘤创造较好条件。在籽粒形成后期追施少量氮肥有助于维持大豆营养生长和延长根瘤菌固氮作用，促进籽粒形成。另一方面，土壤环境中较高浓度的化合态氮(主要为硝态氮和铵态氮)能影

42、响根瘤菌对根毛的侵染，降低结瘤数量，抑制类菌体固氮酶活，从而对其固氮效率表现出明显抑制作用。土壤pH对接种根瘤菌的共生固氮效率也有明显影响。研究结果表明，pH对根瘤菌生长的影响是一个相对渐进的过程，并依据其受影响程度不同可分为酸敏感型和酸耐受型两大类，随着土壤的酸化，根瘤菌结瘤和植物生长均会受到不同程度的抑制。除土壤理化因子外，生物因素如土壤微生物(特别是土著根瘤菌)、噬菌体、菌根等也会影响根瘤菌的占瘤率，从而影响其共生固氮效应。2）宿主植物已有的研究表明，要获得固氮作用的根瘤，至少有100个宿主植物的基因在起作用。其中已经从11种豆科植物中鉴定了60个基因，这些基因的突变表现出四种表现型：1

43、）不结瘤（抑制侵染、侵染发生但不形成瘤）；2)不固氮的瘤，瘤内只有很少的细菌；3)瘤内有细菌，但早期衰老的无效瘤；4)在使用氮肥时超结瘤。在根瘤菌的作用下，豆科植物至少有20多种多肽特异性表达，这些蛋白质统称为根瘤素。根据其生理功能分为3类：1)根瘤的结构蛋白；2)将类菌体固定的氮素同化并转移到植物体内的酶系统；3）维持类菌体功能所必需的蛋白质。豆血红蛋白（leghemoglobin, Lb）属于第三类根瘤素。豆血红蛋白在体内的主要功能是调节根瘤细胞氧含量，但其血红素辅基可能是细菌编码。固氮酶在高氧压下钝化或失活，但固氮作用需要能量，这种能量有类菌体中的有氧呼吸提供，豆血红蛋白对氧的高亲和力能

44、解决这一矛盾。但目前豆血红蛋白在根瘤中的位置还不清楚，有人认为是存在于根瘤细胞与类菌体之间的质膜包处，也有人认为是位于寄主原生质体中。植物的其它基因也能控制固氮效率，例如提高植物光合效率或采用高光合效率的品种能加强固氮过程的碳源和能源供应，从而提高根瘤菌的共生固氮效率。3）根瘤菌a. 四碳二羧酸转移酶基因dct苹果酸和琥珀酸等四碳二羧酸是植物供给类菌体以支持共生固氮所需要的直接碳源及能源，加强四碳二羧酸转移酶基因(dctABD)的表达可以加强光合产物向类菌体的传递，以充分满足其固氮作用和氨同化吸收过程对能量及碳源的需求，从而提高其共生固氮效率。dct基因能明显地影响根瘤菌的固氮效率和植物生长。

45、在受体根瘤菌中导入dct基因可显著提高受体菌的共生固氮效率。b. 固氮酶正调节基因nifAnifA除了作为固氮酶的正调节基因外，还与根瘤发育、类菌体分化及竞争结瘤有关。加强nifA的表达水平也是提高根瘤菌共生固氮效率和结瘤能力的途径之一。把含有nifA基因的质粒导入到根瘤菌中，固氮能量增强。c. 吸氢酶基因hup研究表明若能利用部分根瘤菌所具有的吸氢酶基因hup来循环利用固氮酶还原H放出的H2，则有可能因减少能量损失而提高固氮效率。hup基因定位于共生质粒上，它可以随质粒共转化。8.5.5生物技术在改良豆科牧草共生固氮上的应用现代生物生物技术的飞速发展，使通过基因的改良提高固氮能力成为可能。这

46、些研究已经在许多豆科牧草上得到了相应的应用。要提高豆科牧草的固氮能力，首先要有高效和强竞争结瘤能力的根瘤菌菌株。一个优良共生体的建立需要适应环境条件的宿主品种和与之相匹配的根瘤菌菌株。人们正在努力通过生物技术的改良来找到更加匹配的组合。8.5.5.1 豆科牧草的改良目前国内外已经利用杂交及染色体工程、细胞及组织培养、基因工程等技术应用于豆科牧草的遗传改良上。1972年美国率先开始了对苜蓿花药和组织培养技术的研究。与此同时，前苏联也进行了类似的研究，并进行百脉根、红三叶、红豆草的花药培养、组织培养和细胞培养技术的研究。加拿大等国还研究了紫花苜蓿原生质体培养技术。70年代末到80年代初，美国等又开始了牧草基因工程的研究，并取得了突破，1991年转基因苜蓿植株已移至田间种植。我国牧草生物技术的研究是在70年代末开始起步的，一个重要标志是：1970-1980年黑龙江畜牧研究所和中国农业科学院草原研究所分别运用花药培养获得了