农业生物技术教学大纲

1、指导教师：韩英鹏教学大纲-基础植物分子生物技术（一）实验课程简介（实验课程的特点，发展现状）农业生物技术实验课程的开设，是建立在理论课基础上。在分子水平进行生物学操作是目前很多学科、领域共同关心并十分重视的问题。农业生物技术实验课程就是明确生物技术的一般原理在该实验中所涉及的技术方法，原理和策略，增强学生对生物技术尤其是基因操作中基本原理与技术的认识，并锻炼学生科研动手能力，挖掘其创造意识。随着生物科学和生物技术的日益发展，人们越来越重视对生物学研究手段的了解和掌握。特别是二十世纪八十年代以来，以分子生物学为代表的学科领域取得了翻天覆地的变化。农业生物技术实验开展是东北农业大学农学院农学系专业

2、适应学科发展应运而生的特色课程，将使学生真正了解并深层次体会生物技术的神奇与奥妙。目前农业生物技术实验课程刚刚开设，实验条件、实验项目开设还处在初级阶段，它的学时数及开设内容还有待进一步丰富。（二）实验教学目标及基本要求实验课的培养目标与理论课的培养目标视一致，通过实验课进一步加深对基因操作原理的认识和掌握，从实践的角度让学生掌握基因是怎样去研究的、基因工程是如何实现的，如何设计研究基因的基本方案，为学生进入研究生阶段开展分子生物学研究打好理论和思维基础，为本科毕业从事生物技术和生物科学工作强化基因操作的认识。（三）教材及主要参考书农业生物技术实验指导（四）考核办法实验结果正确度30%操作态度

3、30%实验报告填写20%动手能力20%（五）开出实验个数：（验证实验个；综合实验一个；设计实验1个）（六）应开实验学期：2010-2011学年第一学期实验项目质粒DNA的小量制备1 .实验特点实验类型：验证实验类别：专业基础计划学时：4每组人数：7首开日期：2006.6.5说明：实验类别指基础、专业基础、专业实验类型指验证、综合、设计。每组人数指教学实验项目中在每套仪器设备上完成本实验项目的人数。2 .实验目的与要求学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。3.主要仪器设备厅P主要仪器设备名称型号规格数量1超净工作台12旋涡混合器13恒温摇床14微量移液取样器44.实验内容提要通过溶液I、溶

4、液II、溶液III的加入及离心等操作，得到质粒DNA,溶于无菌水中。5 .实验操作要点(1)取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min,弃上清液，留沉淀备用。(2)在沉淀中加入100巴溶液I,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。(3)加入200溶液II,盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。(4)加入150蚂溶液III,盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。(5) 15000rpm离心5min,小心吸取400H上精液于另一个干净的1.5ml离心管中，加入800H95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。(6

5、) 15000rpm离心10min,小心弃掉上精液，加入500巴70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋?M合器上混匀。15000rpm离心10min,小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净(7) 再加入500H70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min,小心弃掉上精液，尽量倒置弃干净(8) 离心管倒置于37七培养箱中(或室温)空气干燥。(管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！)0(9)每管加入10国蒸储水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认。用记号笔标记后放入冰箱中备用。(10)清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告6.注意事项(

6、1)试剂添加顺序不能弄混，尤其是溶液I、溶液II、溶液III的加入顺序。(2)离心时间要控制，使用时离心机要注意对角线上离心管要配平，防止离心机非正常工作。(3)写作实验报告和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻(包括操作的错误)。实验项目二质粒DNA电泳鉴定1 .实验特点实验类型：验证实验类别：专业基础计划学时：4每组人数：7首开日期：2006.6.8说明：实验类别指基础、专业基础、专业实验类型指验证、综合、设计。每组人数指教学实验项目中在每套仪器设备上完成本实验项目的人数。2 .实验目的与要求学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳。3.主要仪器设备厅P主要仪器设备名称型号规

7、格数量1电泳仪12分光光度计13微波炉14微量移液取样器44 .实验内容提要将实验一所提取的质粒通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。5 .实验操作要点(1)称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml1父TAE电泳缓冲液，放入微波炉中1min,待完全熔化。(2) 冷却致不烫手(约50-60七)力口1N1EB。(3)把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。静置10-20分钟待胶完全凝固。(4)在水平电泳槽中加满1MTAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm),注意正负电极的位置连接正确。(5)待胶完全凝固后(15-20分钟)，小心拔出梳子。凝胶上有样品孔

8、的一侧要朝向电泳槽的负极。(6)剪1片光面纸(或封口膜)，点6巴蒸储水、1四10M加样缓冲液，再加入3H质粒DNA溶液制成10HDNA样品，进行加样。(7)电泳将进行约30min,关闭电源，取出凝胶进行观察。6 .注意事项(1)上样液各成分及加入量要准确2）使用EB要小心，防止弄到皮肤及衣物上。3）凝胶在电泳槽中正负极的位置要明确。实验项目三感受态菌的制备1 .实验特点实验类型：设计实验类别：专业基础计划学时：4每组人数：7首开日期：2006.6.12说明：实验类别指基础、专业基础、专业实验类型指验证、综合、设计。每组人数指教学实验项目中在每套仪器设备上完成本实验项目的人数。2 .实验目的与要

9、求学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。3.主要仪器设备厅P主要仪器设备名称型号规格数量1超净工作台12台式冷冻离心机13制冰机14微量移液取样器44.实验内容提要应用CaCl2法将大肠杆菌DH5u菌种制备成感受态细胞5 .实验操作要点(1)将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min,然后于4C,5000rpm离心10min。(2)将离心管倒置以倒尽上精液，加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。(3) 4C,5000rpm离心10min,弃上精液后，用1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放

10、置30min。(4) 4C,5000rpm离心10min,弃上精液后，用200卜L冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100叱分装到1.5mL离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80C超低温冰柜中保藏(可存放数月)。(5)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。6 .注意事项(1)密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来检测。DH5a菌株OD600为0.5时细胞密度为5x107/ml。)(2)所有操作都在无菌条件和冰上进行（3）所有器皿必须干净。迹量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。

11、实验项目四质粒DNA勺转化1 .实验特点实验类型：设计实验类别：专业基础计划学时：4每组人数：7首开日期：2006.6.12说明：实验类别指基础、专业基础、专业实验类型指验证、综合、设计。每组人数指教学实验项目中在每套仪器设备上完成本实验项目的人数。2 .实验目的与要求学会热击法转化质粒DNA3.主要仪器设备厅P主要仪器设备名称型号规格数量1超净工作台12台式冷冻离心机13制冰机14微量移液取样器44.实验内容提要应用学会热击法转化质粒DNA5 .实验操作要点(1)将含有50ng重组DNAf口200四的感受态细胞的Eppendorf管置冰浴中30min以上，在这过程中，可轻轻旋转以混匀内容物，但振荡不要太激烈和次数太多，以免影响已连接好的DNA&受体菌表面的吸附。(2)把上述样品置42c水浴中，热击90sec,不要摇动管。这使受体菌极短暂热刺激，以利于DNA勺吸收，提高转化效率；(3)冰上放置，使细胞冷却1-2min,并加入500囚的新鲜的LB液体培养基；(4)在涂皿之前，先放37c100rpm/h摇床上，振荡