细胞衰老与死亡管倩楠课件

1、LOGO细胞衰老与死亡管倩楠第十八章第十八章 细胞衰老与凋亡细胞衰老与凋亡cell senescence and apoptosis细胞衰老与死亡管倩楠细胞衰老与凋亡细胞衰老与凋亡v衰老衰老是指年龄老化及其器官或细胞功能的衰退。它是生物的基本特征，是不以人的意志为转移的自然规律。 时光流逝时光流逝岁月不饶人岁月不饶人青春永驻青春永驻长命百岁长命百岁v现代人类面临的三种衰老：心理性衰老心理性衰老生理性衰老生理性衰老病理性衰老病理性衰老v现代人类面临的三种衰老：生理性衰老生理性衰老病理性衰老病理性衰老v现代人类面临的三种衰老：生理性衰老生理性衰老细胞衰老与死亡管倩楠细胞衰老与凋亡细胞衰老与凋亡衰老

2、及其机制衰老及其机制细胞凋亡细胞凋亡机体和组织器官的衰老衰老的机制基因的调控作用细胞凋亡检测技术细胞凋亡与疾病细胞衰老与死亡管倩楠第一节第一节 衰老及其机制衰老及其机制 v概念：正常环境下发生的细胞的生理功能和增殖能力的减弱，以及细胞形态结构发生改变并趋向于死亡的现象，又称老化。v后果：机体衰老、老年病 人体的代谢功能是由不同的组织细胞相互配合共同完成的。这种互补性造成了不同组织细胞相互依存的现象，某一组织细胞功能衰退将直接或间接影响到其他组织细胞功能。因此，对高等动物或人体来说，衰老发生在整体水平。细胞衰老与死亡管倩楠第一节第一节 衰老及其机制衰老及其机制 v细胞衰老的特征：v细胞内多种酶的

3、活性降低，细胞膜的通透性改变，物质运输的功能降低。（白发）v细胞内色素增多，妨碍细胞内物质的交流和传递。（老年斑）v细胞内水分减少，细胞萎缩，体积变小。（皱纹）一、机体和组织器官的衰老一、机体和组织器官的衰老细胞衰老与死亡管倩楠第一节第一节 衰老及其机制衰老及其机制 v从细胞和分子水平阐述衰老的机制的学说已达从细胞和分子水平阐述衰老的机制的学说已达300余余种，目前比较盛行的是种，目前比较盛行的是 差错差错/损害学说损害学说、遗传程序学说遗传程序学说、自由基学说自由基学说。二、衰老的机制二、衰老的机制细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（一）差错（一）差错/ /损害学说损

4、害学说v1963年Orgel提出“差错成灾”学说，认为在机体细胞合成蛋白质时，转录和翻译的过程中随时可发生差错，有个别氨基酸错误的掺入蛋白质（种类、位置），因而产生出差错的蛋白质或差错的聚合酶。如果差错出现在酶的活性中心，将引起酶活性或特异性聚合酶功能上的改变，继而产生有差错的DNA或RNA，在此基础上又继续产生新的差错。 如此循环下去，在差错堆积成灾时则使机体代谢障碍，导致衰老。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v根据中心法则的推断，认为在DNA复制，转录和翻译中随时可能发生差错，这种差错可以不断扩大，造成细胞衰老、死亡。如DNA转录mRNA的过程发生微小的差异，带有该

5、微小差异的mRNA会翻译出进一步偏离的蛋白质，该蛋白质如果属于DNA聚合酶会合成差异程度更大的DNA，v这样的差错经过每一次信息传递都扩大一些，形成恶性循环，使细胞内积累许多差错分子造成灾难，细胞正常功能不能发挥，致使细胞衰老、死亡。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制vSmith提出交联假说交联假说认为，机体中蛋白质、核酸等大分子可以通过共价交叉结合，形成巨大分子。这些巨大分子难以酶解，堆积在细胞内。随着增龄，在有害因子自由基的作用下，交联反应增多，又不能及时修复，损害细胞的正常功能，生物分子的理化性质就会发生改变，导致衰老。v这种交联反应可发生于细胞核DNA链之间，也可

6、以发生在DNA与蛋白质之间和胶原纤维之间。 交联学说在本质上并未超出“差错成灾”学说的范围，只不过是对其做了进一步的说明和解释。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v实验表明，从Wistar系老年大鼠（18月龄）和年轻大鼠（5月龄）的研究中发现，取鼠肝提取DNA，测其溶解温度和增色效应，取鼠尾腱分别测定胶原纤维收缩起始温度、胶原蛋白含量及可溶性胶原含量，发现大鼠衰老后DNA交联损伤增加，胶原纤维交联损伤增加。v实验结果对“差错成灾”的有力支持，但也有很多实验结果不支持此学说。随着分析方法的改进和分析技术的提高，目前认为衰老细胞中出现的DNA和蛋白质的改变，大部分是随细胞衰老

7、出现的变化而不是细胞衰老的原因。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v线粒体DNA（mtDNA）与衰老和某些老年性疾病关系的研究，近期发展较快。研究认为，mtDNA突变造成线粒体氧化磷酸化功能障碍，能量产生不足与器官老化和多种老年性疾病有关。 mtDNA是由碱基对构成的双股环状DNA，一条为轻链，一条为重链，均有编码功能，其编码的产物涉及氧化磷酸化所需的细胞色素b、细胞色素c，NADH脱氢酶亚单位等。mtDNA因不与组蛋白结合，所以易受活性氧等自由基侵害，造成氧化损伤，另外由于其内不含内含子，没有修复系统，所以任何形式的突变均可能影响线粒体的功能。细胞衰老与死亡管倩楠( (

8、二二) )衰老的机制衰老的机制vmtDNA突变有3种类型：点突变、缺失、重复突变。有人认为这3中突变方式都可能导致人和动物的衰老和疾病的发生。大量研究表明，mtDNA缺失突变较为普遍，引起的后果较严重。v有资料证明，人心脏和脑细胞中mtDNA多缺失5.0kb和7.4kb片段，且随年龄增加明显增加。35岁以前几乎检测不到mtDNA缺失，6374岁缺失片段比35岁增长14倍，80岁又比6374岁增高4倍。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制vmtDNA突变不仅与衰老有关，而且会导致多种老年病。有人认为mtDNA的结构特点使其容易受到自由基侵害，导致突变，引起细胞代谢出现异常，

9、mtDNA损伤积累越来越多，正常细胞呼吸链被干扰，与呼吸有关的酶系统退化，氧化磷酸化作用越来越弱，并出现缺陷，结果导致神经退化性疾病如帕金森病、阿尔海默病，大脑、骨骼肌、肾和内分泌腺等退化性疾病的发生和加剧。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（二）遗传程序学说（二）遗传程序学说v20世纪60年代，由Hayflick等提出，该学说的基本观点认为，衰老与发育、生长和成熟相似，都是由遗传基因调控的程序化过程所控制，按照一定的时间顺序所表现出来的生命现象。v不同种属生物有不同的寿命是由各自的遗传基因所决定的。（机体寿命与细胞寿命相关性）v近年来，随着端粒、端粒酶的发现和研究的深

10、入，为这一学说丰富了内容。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v端粒端粒是真核细胞染色体自然末端的一种特殊结构，起着固定DNA双螺旋，防止DNA链被解开的作用。人类端粒由位于染色体末端的重复序列(TTACCG)n及一些结合蛋白所组成。v1986年，Cooke发现，每次细胞分裂后，其端粒就缩短一些，直至最后其减少至几十个bp。此时若细胞进一步分裂会导致染色体的磨损，因而细胞进入黄昏时期直到最终死亡。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v研究表明，端粒具有重要的作用，端粒决定了细胞的寿命，因为DNA复制过程中，与模板3端配对的引物降解后，没有上游引物延长序列

11、填补。所以，DNA每复制一次，端粒即丢失50200bp，当它缩短到一定程度时，细胞则停止分裂，进而衰老、死亡。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v端粒序列的复制依赖于一种特殊的DNA聚合酶，即称为端粒酶端粒酶的核蛋白酶。该酶能够合成端粒DNA，修复被损伤了的端粒并使其延长，但机制仍然不是十分清楚，有待进一步研究。v在85%95%的常见肿瘤细胞中，存在高表达的端粒酶活性，而在大多数正常细胞中，一般测不到端粒酶活性。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v有研究发现，在未分化的成纤维细胞中，细胞分裂次数越多，端粒长度越短。随着细胞衰老，血液及结肠粘膜细胞中端

12、粒平均长度也不断缩短。v胚胎细胞、永生化细胞和其他一些表达端粒酶活性的干细胞寿命均比无端粒酶活性的细胞长。因而有人认为端粒的缩短是启动衰老的分子钟，端粒失去DNA这一过程向细胞发出信号以停止其分裂，从而决定细胞有限的生命时限。 细胞衰老的端粒假说虽然被大多实验研究证明，但并不是在所有细胞中都适用，人角膜内皮细胞就不受端粒酶的影响。尽管端粒和端粒酶的研究并不能解释所有的衰老机制，但它却是是衰老-抗衰老研究领域的一项重要内容，如延长细胞生命或肿瘤的发生。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（三）自由基学说（国际公认学说）（三）自由基学说（国际公认学说）v1954年Harman

13、提出了衰老的自由基学说，他认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。其反应能力很强，可使细胞中的多种物质发生氧化，损害细胞的正常功能。还能够使蛋白质、核酸等大分子交联，影响其正常功能。v生物体的衰老过程是机体的组织细胞不断产生的自由基积累结果，自由基可以引起DNA损伤从而导致突变，诱发肿瘤形成。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v自由基及其衍生自由基是指具有未配对电子的原子、原子团、离子、基团或分子，他们的共同特征是最外层的电子不成对，这有别于过渡性金属电子层内层存在的不成对电子，后者不属于自由基，没有强氧化作用。v自由基包括羟自由基

14、、氯原子、超氧阴离子、NO分子等，是参与人体内氧化还原反应的最重要最广泛的的反应成分。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v活性氧是指从氧衍生出来的自由基及其产物，不仅免疫细胞能释放大量活性氧，许多正常细胞和癌细胞也同样能释放活性氧。产生的主要部位是线粒体的电子传递链上泛半醌/细胞色素b区域产生超氧阴离子自由基与过氧化氢。v实验表明，人的成纤维细胞在5%95%氧浓度的环境中培养，细胞寿命缩短；将成纤维细胞放在含特丁基氢过氧化物的培养基中数分钟，可加速细胞衰老。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v通过对大量研究结果的深入分析，人们发现最大寿命与抗氧化力/

15、活性氧生成量呈相关性。由此看出，提高抗氧化力和降低活性氧生成量都有助于延长寿命，但这并不是充足条件，提高抗氧化力/活性氧生成量的比比值值才是满足延长最大寿命的条件。v自由基学说与前两种学说有交叉，在差错/损坏学说中，利用自由基的作用解释蛋白质或核酸交联产生的原因以及线粒体损伤的原因；在端粒研究中，稍高氧压下与正常氧压下培养细胞，端粒缩短速率增快。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（四）细胞凋亡学说四）细胞凋亡学说v细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。衰老是具有累积性、渐进性、内生性的生命过程。在衰老过程中，机体各组织器官功能逐渐

16、衰退和丧失，最终死亡。v细胞凋亡是维护内环境稳态，由基因控制的细胞自主的有序性死亡，与衰老过程中组织器官功能的退化、衰老相关疾病的发生密切相关。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v差错理论认为，导致衰老的诱因来自于外界，差错缺乏修复或不可修复，差错累积，造成衰老，认为衰老是一种被动过程。而程序理论认为，衰老是细胞自发的，主动的过程，由基因程序按照“生物钟”的安排所决定。v近年来研究发现，自由基也参与细胞凋亡。在诸种细胞凋亡的诱因中，体内代谢或外源性因素产生活性氧自由基如O O2 2 、OH OH 、 H H2 2O O2 2等被证实可诱导细胞凋亡。羟自由基可引起蛋白质氧化

17、、DNA链断裂、细胞膜发泡等，这些正是细胞凋亡的特征。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v维尔纳综合征（Werners syndrome）是一种遗传性成年早老症，是编码一种类似DNA解旋酶的基因发生突变所致，研究表明其患者Fas基因介导的淋巴细胞凋亡大大增加。v阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，淀粉样蛋白在脑中的沉积，可增加胞内钙离子浓度，造成神经细胞凋亡；AD患者脑内细胞丢失可能与细胞凋亡有关。氧自由基也参与老年痴呆的病理过程，脑内缺乏保护性抗氧化物质，容易受氧自由基攻击，氧自由基可能通过细胞凋亡来加重对AD的损伤。细胞衰老与死亡管倩楠成人早衰症成人早衰症 细胞

18、衰老与死亡管倩楠婴幼儿早衰症婴幼儿早衰症 细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v不同的细胞由不同的基因调控凋亡的发生。与细胞分化和衰老有关基因v诱导细胞凋亡的有：c-fos、e-jun、c-myc、P53、Rb、Fas等，v抑制细胞凋亡的有：Bcl-2、Adeovirus E3基因等。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（五）体细胞突变学说（五）体细胞突变学说v由Failla于1958年提出，该学说认为体细胞中的遗传物质发生了改变，结果使其形态、功能失调，引起衰老发生。形象的说，体细胞的衰老是由于某种衰老性的“打击”造成的，如同衰老之箭击中了细胞内的靶

19、子而导致衰老。此学说有其局限之处，细胞突变不一定指向衰老。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（六）免疫功能下降学说（六）免疫功能下降学说v该学说认为，由于免疫系统功能下降或异常导致其他器官、细胞的功能异常，引起衰老。v免疫功能异常确实与衰老的表现有非常密切的关系，但是确定免疫系统功能异常与衰老之间的因果关系，仍需进一步深入研究。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（七）内分泌功能降低学说（七）内分泌功能降低学说v也称其为神经内分泌阶段式调节学说，是衰老学说中重要的一种，该学说认为，衰老的内分泌系统有一个中枢在大脑。脑内有一组控制身体功能而使其他物质

20、不能代替的调节系统，如下丘脑-垂体轴。v当内分泌功能减退时，机体的内环境失去平衡，功能发生紊乱，代谢出现障碍，衰老随之而来，严重则导致死亡。v一些学者认为，衰老不会仅由下丘脑功能的改变或激素调节的障碍所致，而是整个内分泌器官功能性降低（内分泌-神经控制系统障碍）的结果。细胞衰老与死亡管倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（八）有害物质积蓄学说（八）有害物质积蓄学说v该学说中有害物质是指脂褐素，因而也称脂褐素学说。细胞中脂褐素随年龄增加而增多是一个显而易见的事实。v有学者认为脂褐素在细胞中积蓄，扰乱了细胞空间，改变了扩散渠道，影响了亚细胞结构，对细胞产生不良影响，引起衰老。细胞衰老与死亡管

21、倩楠( (二二) )衰老的机制衰老的机制v（九）微量元素学说（九）微量元素学说v微量元素学说是以体内必须微量元素含量异常或代谢失调，非必需的以及有害微量元素过量来解释衰老的发生机制。v机体通过体内的自身平衡机制来保证体内微量元素的平衡，保持正常生理状态时，可达到自然寿限，如果发生异常则会导致疾病。v一般情况下，人体内的必须微量元素随年龄增加在体内逐年增加，故老年人体内含量较低；而非必需微量元素和有害微量元素随年龄增加在体内逐年增加。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v细胞凋亡细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。v细胞脱落离体或裂解为若干

22、由单位膜包裹的凋亡小体，被其他细胞吞噬。现在很多情况下，细胞凋亡亦成为程序化细胞死亡（PCD）。 细胞凋亡的特殊的生物学特征：细胞核的DNA被核酸内切酶在核小体单位之间降解，产生若干大小不一的寡核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现DNA“梯形带梯形带”，这些区带由180200个碱基对整数倍的寡核苷酸片段组成。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v 细胞凋亡细胞凋亡和细胞坏死细胞坏死是多细胞生物中细胞死亡的两种不同形式，它们在形态学、分子机制和生物学意义等方面有着本质的区别。比较：比较：细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v凋亡细胞的形态学特征：v细胞体积缩小，核染色质

23、浓缩呈半月形，胞浆浓缩，线粒体无大变化，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，细胞膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整的膜结构，不出现溶酶体酶等细胞内涵物外泄，故不引起炎症反应和次级损伤。v细胞凋亡是单个细胞的丢失，结局是被吞噬细胞或邻近细胞所识别、吞噬。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v细胞坏死的形态学特征：v由于膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化，内质网扩张，核染色质不规则位移，进而线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂，细胞质的内容物外溢，引起严重的炎症反应。v坏死的细胞常常是成群的细胞一起丢失。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v近年来有人认为，凋亡与坏死没

24、有绝对的区别界限，在一定的条件下，凋亡可以转化为坏死。v体外实验发现，适量的诱导剂可以诱导出细胞凋亡，继续增加诱导剂的用量则诱导出坏死的改变。v在体内，如果凋亡小体不被识别，吞噬功能障碍，不能及时清除凋亡小体，凋亡小体的完整膜结构破坏后，内含的溶酶体释放出来，可引起组织的坏死。细胞衰老与死亡管倩楠凋亡、坏死比较凋亡、坏死比较细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死能量能量ATPATP不依赖不依赖ATPATP细胞形态细胞形态皱缩皱缩肿胀肿胀细胞膜细胞膜完整完整破裂破裂细胞器细胞器形态完整形态完整肿胀破裂肿胀破裂细胞核细胞核染色质凝集断裂染色质凝集断裂固缩，核膜破裂固缩，核膜破裂凋亡小体凋亡小体有有无无D

25、NADNA规律断裂，规律断裂，梯状条带梯状条带随机降解随机降解分子机制分子机制多基因参与，有序调控多基因参与，有序调控无基因调控无基因调控蛋白质合成蛋白质合成有有无无代谢反应代谢反应蛋白酶逐次参与蛋白酶逐次参与无秩序反应无秩序反应周围组织炎性反应周围组织炎性反应无无有有对机体的影响对机体的影响生长发育代谢需要生长发育代谢需要有损伤破坏作用有损伤破坏作用细胞衰老与死亡管倩楠图图A：细胞坏死；图：细胞坏死；图B,C：细胞凋亡：细胞凋亡细胞衰老与死亡管倩楠左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞 细胞衰老与死亡管倩楠细胞凋亡过程细胞凋亡过程细胞衰老与死亡管倩楠A. Nor

26、mal cell B. Apoptosis C. Apoptotic bodies细胞衰老与死亡管倩楠细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死炎症反应炎症反应细胞衰老与死亡管倩楠细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v细胞凋亡是一个正常的生理过程，它对于维持多细胞生物的生命过程中，细胞增殖与细胞死亡的平衡具有至关重要的意义。v目前已知，细胞凋亡在动物的机体发育过程中、在人类免疫系统淋巴细胞分化成熟过程中、在机体清除受损或衰老细胞过程等方面起到重要作用。另外，细胞凋亡还与肿瘤的发生、发展有密切关系，肿瘤的发生发展可能由于细胞增殖与细胞死亡速度之间的平衡失调所致。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二

27、节 细胞凋亡细胞凋亡v细胞凋亡机制在动物进化过程中高度保守。v影响细胞凋亡的基因：一、基因的调控作用一、基因的调控作用 ICE家族基因Fasc-mycP53Bcl-2细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v（一）ICE酶系家族v白介素-1转换酶（ICE），是一种半胱氨酸蛋白酶，由两个大亚基和两个小亚基组成。此酶系家族的前体必须在本身肽链的天冬氨酸基团处断裂加工才具有活性，这类酶本身具有催化肽链在天冬氨酸基团断裂的功能，这表明这类酶可能具有自身加工活化和互相作用加工活化的能力。vICE家族基因的过度表达可诱发细胞凋亡，在细胞凋亡中起着中心作用。当这类前体活化后，在无蛋白酶基因转录的情

28、况下便可诱发细胞凋亡。细胞衰老与死亡管倩楠ICE家族成员（切冬酶基因家族）家族成员（切冬酶基因家族） * *细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v（二）FasvFas也称CD95或Apo-1，属于TNF受体家族成员。这类受体是跨细胞膜的蛋白，膜外是富含丝氨酸的功能区，膜内部分含有被称为死亡功能域（DD）的传递细胞死亡信号的同源功能区。vFas在各种组织中都表达，尤其是胸腺、肝脏、心脏和肾脏中表达量很大，实验表明， Fas在T淋巴细胞凋亡过程中起作用。vFas和配体结合后启动形成三聚体受体，使Fas蛋白的胞质部分召集其他几种蛋白形成一个复合体，称为死亡起始信号复合体（DISC）发挥

29、使细胞凋亡的作用。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v（三）c-mycc-mycv体外实验已证明，c-myc的重要功能是促进细胞分裂。其过度表达可使细胞不再对生长滞留信号做出反应，并使休眠期的细胞进入继续增殖状态。v体外实验也发现，c-myc过表达不仅会促进细胞增殖，也会促进细胞凋亡。目前认为，激活c-myc的转录同时启动了细胞增殖和凋亡两种状态，其他信号的参与决定了细胞的选择方向。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v（四）P53vP53蛋白是一个转录调节因子，现已知它可促进P21、Bax、MDM2、周期素G等至少6个基因的转录。v在细胞中，P53以不具转录活性

30、的休眠形式存在，接受上游信号后C末端形成的一个开放结构域出现结构变化，P53被激活，具有结合DNA的活性。虽然P53对于正常的有丝分裂和减数分裂并不是必需的，但P53蛋白的活性和稳定性总是以细胞周期相关的方式变化。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡vP53介导的下游事件主要有两个途径：细胞周期停滞和细胞凋亡。1、细胞周期停滞 作为对DNA的应答，P53被激活并影响下游p21基因的转录，使DNA损伤的细胞停滞在G1期。2、细胞凋亡 P53在细胞凋亡启动中具有重要作用。如辐射P53缺乏鼠，其胸腺细胞、小肠和大肠的干细胞不会发生凋亡。对病毒或细胞癌基因表达以及缺失关键性抑癌基因Rb时

31、做出应答，引起细胞凋亡。细胞衰老与死亡管倩楠第二节第二节 细胞凋亡细胞凋亡v（五）Bcl-2Bcl-2vBcl-2基因（长寿基因）：抑制凋亡vBcl-2的蛋白产物具有保护多种细胞免于多种诱因所致的细胞凋亡，它是细胞凋亡的重要抑制基因。v用微注射法将含有Bcl-2的重组体注入交感神经细胞中，使其过量表达，寿命较对照组明显延长，并发现体外培养的衰老细胞能抵抗去除血清所诱导的细胞凋亡。细胞衰老与死亡管倩楠bcl-2基因基因家族家族 * *细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v（一）形态学观察v（二）流式细胞术分析v（三）DNA降解分析v（四）酶学分析v（五）细胞内钙浓

32、度的分析细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v（一）形态学观察v细胞凋亡的形态学观察有普通光学显微镜、电子显微镜和荧光显微镜观察方法。v1、普通光学显微镜观察 凋亡细胞的共同特征是细胞容积收缩，以细胞核的形态改变尤为突出，看不到炎症反应。在组织内，细胞凋亡的典型特征是出现单个细胞，且凋亡细胞周围有环状带。凋亡细胞体积缩小，染色质致密聚集成斑块状。 染色方法可用HE染色、甲基绿-派洛宁染色或吉姆萨染色。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v2、电子显微镜观察 在电子显微镜下观察，开始时凋亡细胞体积缩小，失去细胞连接和一些特殊膜表面结

33、构，染色质靠近核膜，形成新月状体。然后，核体积进一步缩小，并可裂解为一或数个致密体，其与一定的核糖体及各种细胞器成分形成具有完整膜性结构的凋亡小体。随之，凋亡小体由邻近正常细胞或吞噬细胞识别、吞噬。典型表现为凋亡细胞染色质固缩，常靠近核膜呈明显的块状或新月状小体，胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片，胞质内可见完整的细胞器。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v3、荧光显微镜观察 经吖啶橙染色后，凋亡细胞细胞核或细胞质可见致密浓染的黄绿色或枯黄色碎片。细胞坏死时，胞质内黄绿色或枯黄色荧光减弱或消失。 现有人利用缩时摄影术对细胞凋亡发生的整个过程进行动态观察，这被认为是

34、检测细胞凋亡形态学的“金标准”，因其可排除其他形态学观察中，固定所造成的的人为假象而使形态学指标不能重复。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v（二）流式细胞术（FCM）分析 FCM是当前广泛应用的一种细胞凋亡的检测手段，具有快速灵敏、结果准确客观、重复性好、可同时检测多种指标等优点。可采用多种方法分析细胞凋亡。v1、细胞形态分析 v2、细胞膜结构与功能的改变v3、细胞器改变v4、细胞DNA含量分析 v5、凋亡相关蛋白的分析细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v1、细胞形态分析 凋亡早期细胞体积缩小，形成前相散射（FSC）低，侧相

35、散射（SSC）高的特殊光散射型；细胞凋亡后期，由于染色质浓缩和核碎裂致使FSC和SSC均减弱。 缺点是由于其他原因引起的细胞形态改变也可出现这种变化，因而特异性较差。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v2、分析细胞膜结构与功能的改变 一种方法是利用细胞膜完整的活细胞对阳离子染料如台盼蓝拒染的特点，区分活细胞与凋亡细胞。另一种方法是针对细胞凋亡时出现的细胞膜结构的改变，使用荧光素标记的抗体或配体进行染色后，通过流式细胞仪测定。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v3、细胞器改变的分析 使用绿色荧光染料罗丹明123（Rh123）作为

36、线粒体探针。细胞凋亡时线粒体膜电位降低，线粒体结合Rh123能力下降，使用流式细胞仪测定时可见Rh123荧光强度降低。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v4、细胞DNA含量分析 这是目前最常用的凋亡分析技术之一，还可以同时分析细胞周期。细胞凋亡时激活核酸内切酶，使核小体连接区出现广泛DNA断裂，产生很多小DNA片段。细胞在染色前的处理过程中，细胞膜通透性增加，小片段DNA溢出，再用流式细胞仪测定时，在DNA直方图上显示G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰，亦称凋亡峰。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v5、凋亡相关

37、蛋白的分析 用荧光素标记的单克隆抗体与凋亡相关蛋白相互作用，应用流式细胞仪可定量测定凋亡相关蛋白。v6、应用流式细胞仪在混合细胞中分选出凋亡细胞作进一步的研究，是流式细胞术的一个独特的优点。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v（三）DNA降解分析v这一检测方法是基于细胞凋亡时，DNA被核酸内切酶降解，形成以180200bp为最小单位的单体或寡聚体片段的特点而设计的检测方法。其检测方法有：v1、超速离心 DNA进行氯化铯连续梯度离心，结合溴化乙啶染色，可看到DNA片段的分带。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v2、琼脂糖凝胶电泳

38、 此方法是最早用于研究细胞凋亡生物化学改变特性的传统经典方法。典型的细胞凋亡图谱出现“阶梯带”，坏死细胞为“涂片带”。 将末端标记的DNA电泳后进行放射自显影，检验敏感性可提高至少50倍以上。 用此方法研究分析细胞凋亡具有较强的特异性，但不用于定量分析。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v3、TUNEL （DNA 断裂的原位末端标记法） 是一种灵敏度和特异性都较高的细胞凋亡检测技术。可用于检测细胞悬液、细胞涂片及冷冻或石蜡包埋的组织切片。 其基本原理是首先用蛋白酶消化法在标本细胞上打孔，把标本与TdT酶和荧光素或生物素标记的dUTP放在一起温育，TdT将标记的

39、dUTP连接到凋亡细胞DNA片段的3末端，可用流式细胞仪测定或用荧光显微镜观察荧光强度；以生物素作为标记物的需进一步与亲和素标记的酶及相应底物作用显色，用普通光学显微镜观察。细胞衰老与死亡管倩楠二、细胞凋亡检测技术概述二、细胞凋亡检测技术概述v（四）酶学分析 由于caspase（半胱氨酸天冬氨酸-特异性蛋白酶）在细胞凋亡发生过程中起到十分关键的作用，分析其活性比其他方法更有利于检测细胞凋亡的早期事件。大多数caspase的作用底物不是由一种特异的caspase裂解，因此建立检验特异性caspase活性的技术方法对于凋亡的检测有重要意义。v（五）细胞内钙离子浓度分析 细胞中CaCa2 2浓度的变

40、化是细胞凋亡的一个特征。凋亡早期CaCa2 2浓度快速、持续升高。细胞衰老与死亡管倩楠三、三、 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病 肿瘤 获得性免疫缺陷综合征 动脉粥样硬化细胞凋亡可导致 肿瘤 获得性免疫缺陷综合征 动脉粥样硬化细胞衰老与死亡管倩楠三、三、 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病v（一）细胞凋亡与肿瘤 肿瘤的发生是一个非常复杂的过程，我们已知肿瘤的发生是癌基因的激活与抑癌基因被抑制或失活共同作用的结果，同时，细胞周期调控异常也与肿瘤发生有关，细胞凋亡也与肿瘤关系密切。v1、Bcl-2家族在细胞凋亡与肿瘤发生中的作用 现已证明Bcl-2是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因，Bcl-2基因的过度表达并不影响细胞增殖和加速细胞分裂，而是阻止肿瘤细胞凋亡，延长肿瘤细胞的生存。细胞衰老与死亡管倩楠三、三、 细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病v2、c-myc在细胞凋亡与肿瘤发生中的作用 c