生物化学教学-rna biosynthesisppt课件

1、 第十六章第十六章 RNA的生物合成的生物合成 转录转录 RNA Biosynthesis，transcription定义：定义： 在在RNA聚合酶的催化下，生物体聚合酶的催化下，生物体以以 DNA为模板合成为模板合成RNA的过程。的过程。 转录产物转录产物: mRNA, rRNA, tRNA等等 转录的选择性：转录的选择性： 不对称转录不对称转录(asymmetric transcription)构造基因：能转录出RNA的DNA区段 不对称转录不对称转录在特定的生长发育阶段，转录只在某些在特定的生长发育阶段，转录只在某些DNA 区段进展区段进展DNA双链中仅有一条单链可作为模板指点双链中仅有

2、一条单链可作为模板指点转转 录的进展录的进展 ,且模板链并非总在同一条单且模板链并非总在同一条单链上链上RNA生物合成体系生物合成体系原料原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板模板: DNA 酶酶: RNA聚合酶聚合酶 (RNA polymerase, RNA-pol)其他蛋白质因子其他蛋白质因子第一节第一节 转录的模板和酶转录的模板和酶1.模板 (template) 模板链 (template strand) 编码链 (coding strand)2. RNA聚合酶聚合酶 (DNA dependent RNA polymerase, RNA-pol)a.原核生物的原核

3、生物的RNA聚合酶聚合酶 (以以E.coli为例为例) 2 (中心酶中心酶,core enzyme)：2 (全酶全酶,holoenzyme) 亚基：识别转亚基：识别转录起始点录起始点 特异抑制剂特异抑制剂: 利福平利福平催化催化NTPNTP按模板的指引合成按模板的指引合成RNARNA 36512 决定哪些基因被转录决定哪些基因被转录 150618 催化功能催化功能 155613 结合结合DNA模板模板 70263 辨认起始点辨认起始点亚亚 基基分分 子子 量量功功 能能b.真核生物的RNA聚合酶 RNA-pol : 45S-rRNA RNA-pol : hnRNA, lncRNA, piRNA

4、, miRNA RNA-pol : 5S-rRNA,tRNA,snRNA 特异抑制剂: 鹅膏蕈碱真核生物真核生物RNA聚合酶的亚基组成聚合酶的亚基组成 各有2个不同的分子量超越100 kD的大分子量的亚基都含有多个小分子量的亚基 某些小分子量的亚基一样，可同时出如今两种或三种酶上 3. RNA聚合酶识别结合DNA模板的启动子 原核生物的转录单位: 支配子(operon)TTGACATATAATPribnow Box5335RNA-pol识别位点识别位点(recognition site) RNA聚合聚合酶维护法酶维护法转录过程转录过程起始起始 (initiation)延伸延伸 (elongat

5、ion)终止终止 (termination)第二节第二节 原核生物的转录过程原核生物的转录过程转录起始转录起始 (Initiation) 需求处理两个问题需求处理两个问题:RNA聚合酶必需准确的结合在转录模聚合酶必需准确的结合在转录模板板 的启动序列区域的启动序列区域DNA双链解开，其中的一条单链作为双链解开，其中的一条单链作为转转 录模板录模板转录起始过程转录起始过程:构成闭合转录复合体：全酶靠构成闭合转录复合体：全酶靠亚基识别结合亚基识别结合启动序列的启动序列的-35区区, 构成闭合的全酶构成闭合的全酶-DNA复合物复合物DNA双链翻开双链翻开(开放转录复合体开放转录复合体)：全酶随即：全

6、酶随即滑动至滑动至-10区，在区，在亚基的作用下，启动序亚基的作用下，启动序列区域的列区域的DNA双链迅速翻开，构成开放转双链迅速翻开，构成开放转录复合体。录复合体。 转录起始复合物构成：在转录起始点，转录起始复合物构成：在转录起始点，RNA聚合酶催化发生第一次聚合反响，构成转聚合酶催化发生第一次聚合反响，构成转录起始复合物。录起始复合物。 (igm uunit) llow (igm uunit) llow RNA polymere to RNA polymere to recognize nd ind recognize nd ind pecificlly to promoter pecif

7、iclly to promoter region.region.转录起始复合物转录起始复合物5pppGpN-OH3转录延伸a. 转录延伸的化学反响RNA聚合酶的反响机制聚合酶的反响机制mRNAmRNAb. 转录空泡转录空泡 (transcription bubble)转录终止 (termination) 1依赖Rho因子的转录终止 2非依赖Rho因子的转录终止1依赖Rho因子的转录终止a. Rho works by chasing RNA polymerase and knocking it off the templateb. This is an active process that r

8、equires the hydrolysis of ATP.依赖依赖Rho因子的转录终止方式：因子的转录终止方式： 1.Rho因子识别结合新生因子识别结合新生RNA链上的链上的Rho因因子识别位点，借助水解子识别位点，借助水解ATP获得的能量推获得的能量推进其沿着进其沿着RNA链由链由5-3端挪动到达端挪动到达RNA聚聚合酶区域，并使合酶区域，并使RNA聚合酶构象发生变化聚合酶构象发生变化而停顿；而停顿； 2.Rho因子利用其解螺旋酶的活性在因子利用其解螺旋酶的活性在ATP供供能的情况下，使能的情况下，使DNA：RNA杂化双链解离，杂化双链解离，从而使从而使RNA链和链和RNA聚合酶从转录复合

9、物聚合酶从转录复合物上零落下来，转录过程随即终止。上零落下来，转录过程随即终止。 2 2非依赖非依赖RhoRho因子的转录终止因子的转录终止非依赖非依赖Rho因子的转录终止方式：因子的转录终止方式：1.当当RNA链延伸至接近终止区时，该区域链延伸至接近终止区时，该区域附近的转录产物构成特殊的茎环构造，阻附近的转录产物构成特殊的茎环构造，阻止止RNA聚合酶继续向前挪动，并促进转录聚合酶继续向前挪动，并促进转录复合物的解体；复合物的解体；2.茎环构造末端的一段寡聚茎环构造末端的一段寡聚U与与DNA链之链之间构成的间构成的U-A配对极不稳定，亦有助于配对极不稳定，亦有助于RNA链从转录复合物上零落链

10、从转录复合物上零落 Termination(6-7)Initiation(1-3)Elongation(4-5) 转录过程转录过程起始起始 (initiation)延伸延伸 (elongation)终止终止 (termination)第三节第三节 真核生物的生物合成真核生物的生物合成转录延伸转录延伸RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小体核小体转转录录延延伸伸中中的的核核小小体体移移位位转录方向转录方向5 -AAUAAA-5 -AAUAAA-核酸酶核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAA GTGTGTG转录终止的修饰点转录终止的修饰点5 5 3 3 3 3 加尾加尾AAAAAA

11、A 3 mRNA 和转录后修饰亲密相关和转录后修饰亲密相关转录终止 第四节第四节 真核生物真核生物RNA的加工的加工 Eukaryotic post-transcriptional modification几种主要的修饰方式几种主要的修饰方式: :1. 剪接剪接(splicing)2. 剪切剪切(cleavage)3. 修饰修饰(modification)4. 添加添加(addition)真核生物真核生物mRNA的转录后加工的转录后加工 1. 5 帽子构造帽子构造 2. 3 poly (A) 尾巴尾巴 3. mRNA剪接剪接 (mRNA splicing) 4. mRNA编辑编辑 (mRNA

12、editing)1. 5 帽子构造帽子构造(m7GpppG)(G)7-7-甲基鸟苷酸甲基鸟苷酸加帽过程需求加帽酶和加帽过程需求加帽酶和甲基转移酶的参与。甲基转移酶的参与。5 pppGp5 GpppGppppG ppi鸟苷酸鸟苷酸转移酶转移酶5 m7GpppGp甲基转移酶甲基转移酶+CH3帽子构造的生成帽子构造的生成5 ppGp磷酸酶磷酸酶 Pi帽构造的作用帽构造的作用 对对mRNAmRNA的的5/-5/-端端起维护作用，防止酶起维护作用，防止酶解解 在蛋白质合成在蛋白质合成中促进中促进mRNAmRNA翻译翻译2. 3 poly (A) 尾巴尾巴 poly A尾不是模板编码，基因中没有相应序列，

13、转录生成尾不是模板编码，基因中没有相应序列，转录生成的的mRNA在核内以在核内以ATP为底物，在为底物，在poly A聚合酶催化下逐个加聚合酶催化下逐个加上去，构成上去，构成poly A尾构造。尾构造。 真核细胞内真核细胞内mRNA的的poly A可长达可长达100-200个腺苷酸。个腺苷酸。 5/ m7GpppG 3/ AAAAAAAAAAA poly A尾的作用：尾的作用： 添加添加mRNA本身的稳定性本身的稳定性 维持维持mRNA翻译模板的活性翻译模板的活性3/-3/-端多聚腺苷酸端多聚腺苷酸(poly A)(poly A)尾的构成：尾的构成：3. mRNA 剪接 断裂基因断裂基因(sp

14、lit gene) 真核生物构造基因，由假设干个编码真核生物构造基因，由假设干个编码区和非编码区相互间隔开但又延续镶区和非编码区相互间隔开但又延续镶嵌而成，这些基因称为断裂基因。嵌而成，这些基因称为断裂基因。 编码区：外显子编码区：外显子 (exon) 非编码区：内含子非编码区：内含子introna. 剪接信号剪接信号3. mRNA3. mRNA的剪接机制的剪接机制 U1snRNP U1snRNP和和U2snRNPU2snRNP分别结合在内含子的分别结合在内含子的33和和55末端末端 U4 U4、U5U5、U6U6参与，构参与，构成剪接体，内含子弯曲成剪接体，内含子弯曲构成套索状，构成套索状，

15、E1E1、E2E2间间隔拉近隔拉近 U2 U2和和U6U6构成催化中构成催化中心，发生转酯反响，心，发生转酯反响，即磷酸二酯键的转移即磷酸二酯键的转移反响反响 UACUACA - AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA - AGUGU6E1E2U1、U4、U5U2pG-OH(ppG-OH, pppG-OH)-OHGpXpGpG第一次转酯反响第一次转酯反响第二次转酯反响第二次转酯反响GpGGpX外显子外显子1内含子内含子外显子外显子2G-OHGpXpGpG剪接过程的二次转酯反响剪接过程的二次转酯反响 (twice transesterification) U1-snRNAU2-snR

16、NA4. mRNA4. mRNA的编辑的编辑(mRNA editing)(mRNA editing)：转录后：转录后mRNAmRNA上的修饰和加工使其携带的遗传信息发生改动上的修饰和加工使其携带的遗传信息发生改动 人类人类apo B基因基因 mRNA14500个核苷酸个核苷酸肝脏肝脏apo B100分子量为分子量为500 000肠道细胞肠道细胞apo B48分子量为分子量为240 000mRNA编辑编辑补：内含子的分类补：内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为子分为4 4类。类。 I I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等：主要存在于线

17、粒体、叶绿体及某些低等真核生物的真核生物的 rRNA rRNA基因；基因；IIII：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNAmRNA； IIIIII：是常见的构成套索构造后剪接，大多：是常见的构成套索构造后剪接，大多数数mRNAmRNA基因有此类内含子；基因有此类内含子； IVIV：是：是tRNAtRNA基因及其初级转录产物中的内含基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及子，剪接过程需酶及ATPATP。 真核生物真核生物tRNAtRNA的转录后加工的转录后加工tRNA前体前体RNA pol TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNARNAas

18、eP、D内切酶内切酶衔接酶衔接酶tRNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶ATPADP碱基修饰碱基修饰2 2复原反响复原反响 如：如：U U DHU DHU 3核苷内的转位反响核苷内的转位反响 如：如：U U 4 4脱氨反响脱氨反响 如：如：A A I I 如：如：A Am1 1甲基化甲基化1 11 13 32 24 4真核生物rRNA的转录后加工四膜虫四膜虫rRNArRNA的二级构造的二级构造四膜虫四膜虫rRNArRNA的剪接采用自我剪接方式的剪接采用自我剪接方式5 5- -端核苷酸序列端核苷酸序列核核 酶酶 (ribozyme): 具有酶促活性的分子。普具有酶促活性的分子。普通是指无需蛋白质参与或不

19、与蛋白质通是指无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的结合，就具有催化功能的RNA分子。分子。l1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的来源一文中提到“能够第一个酶是具有复制才干的RNA时，没有人予以留意。l20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又反复了20年前Francis Crick的话，会议留意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。核酶的发现核酶的发现l1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专注地催化寡聚核苷酸底物的切割与衔接，具有分子内催化的活性。 l1983年，Altm

20、an等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度Mg2+存在下，留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶一样的催化活性。l1986年，Cech又证明rRNA前体的内含子能催化分子间反响。 l 2019年6月，Cuenoud等设计了具有衔接酶活性的DNA分子，它可以催化两个DNA片段的衔接。l 同年10月，Usman等人化学合成了一个由14个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA片段，可以较弱地水解RNA磷酸二酯键。利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和构造识别才干的单链DNA片段，称为酶性DNA，又称脱氧核酶T.CechT.Cech的研讨任务的研讨任务: : 研讨目的：细胞中

21、DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意义的序列，或“内含子intron，如何从RNA分子中剪切下来的。根据过去传统的概念，这一过程必需求有蛋白质酶来完成。研讨对象：四膜虫，其含有一种rRNA前体，其组成中除了核糖体RNA的固有序列外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列interveningsequence，IVS。重要发现开场于1981年研讨发现： a.转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除本身的413个核苷酸的内含子IVS，使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。催化反响是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的，称为自我剪接。 b. IVS具有类似蛋白酶的功能，可以打

22、断及重建磷酸二脂键。rRNA前体能靠本人完成剪接过程。在一定条件下rRNA前体可以按一定方式环绕，进而本人切割本人，然后把保管的rRNA部分的末端衔接起来。即它是可以催化自有底物切割的具有酶活性的RNA。RNA分子具有本身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反响。研讨目的：研讨目的：t-RNAt-RNA分子的剪接过程分子的剪接过程研讨发现：研讨发现： 在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核糖核酸酶核糖核酸酶P P RNase PRNase P中的中的 RNA RNA可以切割可以切割tRNAtRNA前体的前体的5 5端。端。 S.Al

23、tman的研讨任务的研讨任务核糖核酸酶P是一种核糖核蛋白, 含有一个单链RNA分子, 长度为375个碱基，结合一个相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基)。过去都以为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。 (Thomas Robert Cech) (SidneyAltman) 核酶的发现对于一切酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。最简单的核酶二级构造最简单的核酶二级构造槌头状构造槌头状构造(hammerhead

24、structure)底物部分底物部分通常为通常为6060个核苷酸左右个核苷酸左右同一分子上包括有催化同一分子上包括有催化部份和底物部份部份和底物部份 催化部份和底物部份组催化部份和底物部份组成锤头构造成锤头构造 人工设计的核酶人工设计的核酶粗线表示合成的核酸分子粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列表示一致性序列箭头表示切断点箭头表示切断点一运用于生命来源的研讨一运用于生命来源的研讨核酶的运用核酶的运用生命的来源？新的观念：生命从RNA开场目前曾经找到了一些催化根本生化反响如RNA剪切、衔接、合成以及肽键合成等的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前

25、核酶能够参与催化最初的新陈代谢的想象。二在医学领域中的运用二在医学领域中的运用经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割恣意给定的RNA分子，从而抑制目的基因的表达，抑制效率高，专注性强； 利用核酶的剪接才干，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷；免疫源性低，很少引起免疫反响；针对锤头核酶而言，催化构造域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸方式在体内转运。核酶技术面临的问题核酶技术面临的问题核酶催化切割反响的可逆性问题提高催化效率寻觅适宜载体将核酶高效、特异地导入靶细胞使核酶在细胞内有调控地高效表达加强核酶在细胞内的稳定性对宿主的损伤问题有待进一步调查 转录是基因表达的重要环节转录是基因表达的重要环节, ,转录产物转录产物进进 一步参与和调控基因表达一步参与和调控基因表达( (翻译环节翻译环节) )DNARNAProtein 转录具有非常重要的生物学意义转录具有非常重要的生物学意义科恩伯格科恩伯格 59 59岁岁, ,美国斯坦福大学美国斯坦福大学医学院医学院研讨领域研讨领域: : 真核生物转录的分真核生物转录的分子根底