d6 酶固定化蛋白质工程

1、退出退出退出退出退出退出退出退出退出退出退出Understanding enzyme immobilisation nEnzymes are versatile catalysts in the laboratory and on an industrial scale. To broaden their applicability in the laboratory and to ensure their (re)use in manufacturing the stability of enzymes can often require improvement. Immobilisatio

2、n can address the issue of enzymatic instability. Immobilisation can also help to enable the employment of enzymes in different solvents, at extremes of pH and temperature and exceptionally high substrate concentrations. At the same time substrate-specificity, enantioselectivity and reactivity can b

3、e modified. However, most often the molecular and physical-chemical bases of these phenomena have not been elucidated yet. Chem Soc Rev. 2009 Feb;38(2):453-68. Hanefeld U, Gardossi L, Magner E.退出Recent advances in immobilized enzymatic reactors and their applications in proteome analysisnImmobilized

4、 enzymatic reactors recently have drawn much attention because of the striking advantages, such as high substrate turnover rate and ease in coupling with the separation and detection systems. Carrier materials, which have great effects on the development of the immobilized enzymatic reactors, have a

5、lways being the focus of study. In this paper, the contributions, mainly in the last 5 years, on the enzymatic reactors and their applications in proteome study are reviewed, with some newly developed inorganic and organic carriers for enzyme immobilization described in details. Moreover, the hyphen

6、ation of immobilized enzymatic reactors with the separation and identification systems is also summarized. By reviewing these achievements, it could be seen that enzymatic reactors have very bright future, especially in proteome analysis Anal Chim Acta. 2009 Jan 19;632(1):1-8. Ma J, Zhang L, Liang Z

7、, Zhang W, Zhang Y. 退出固定化酶的研究内容固定化酶的研究内容固定化方法载体酶学性质固定化酶的特性稳定性研究、改进最适温度最适pH底物特异性退出固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法（一）（一） 吸附法吸附法n1 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。n 选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面（3） 便于装柱进行连续反应。退出优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱，易解吸附。载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。退出（二）结合法（二）结合法n1 离子键结合法q酶分子 含有离子交换基团的固相载体n常用载体

8、:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶n使用注意：pH、离子强度、温度退出2 共价键结合法共价键结合法n（1）酶分子中可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键n（2）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体退出共价键结合法制备固定化酶的共价键结合法制备固定化酶的“通式通式”n首先载体上引进活泼基团n 关键 n 然后活化该活泼基团n 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键退出（4）载体活化的方法）载体活化的方法nA重氮法nB叠氮法nC烷基化反应法nD硅烷化法nE溴化氰法退出A重氮法重氮法n目前用的较多的载体是对氨

9、基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等退出A重氮法重氮法n反应式及原理退出B 叠氮法叠氮法n例n用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：n 酯化n 肼解n 叠氮化n(4) 偶联退出B 叠氮法叠氮法n对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联 退出C烷基化反应法烷基化反应法n含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。退出D硅烷化法硅烷化法n一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。n多孔玻璃特点：n机械强度好，表面积大。n耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。 退出D硅烷化法

10、硅烷化法退出D硅烷化法硅烷化法退出D硅烷化法硅烷化法退出E 溴化氰法溴化氰法n主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。n用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。退出E 溴化氰法溴化氰法退出（三）交联法（三）交联法n借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。退出（三）交联法常用试剂（三）交联法常用试剂n常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。n应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与

11、酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)退出双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间得到一种分子间交联的固定化酶交联的固定化酶退出图 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶退出表 常用于固定化酶的交联剂 交联剂 参考文献戊二醛1316二重氮联苯胺2，2二磺酸17，184，4二氟3，3二硝基二苯砜 19二苯基4，4二硫氰

12、酸2，2二磺酸 201，5二氟2，4二硝基苯 21酚2，4二磺酰氯 223甲氧基二苯基甲烷4，4二异氰酸盐 23退出（三）交联法的形式（三）交联法的形式n交联法有2种形式：酶直接交联法n 酶辅助蛋白交联n双重固定法 （1） 吸附交联法n（2） 交联包埋法退出酶直接交联法酶直接交联法n在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。n固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。退出酶辅助蛋白交联酶辅助蛋白交联n为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，n可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，n使酶与惰性蛋

13、白质共交联。退出（1） 吸附交联法吸附交联法n先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，n再用戊二醛等双功能试剂交联。n用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。退出（2）交联包埋法）交联包埋法n把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，n然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。n这样制得的固定化酶稳定性好。退出（四）（四） 包埋法（包埋法（entrapping method） n定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。n包埋法分为网格型和微囊型n1网格型n2微囊型退出1网格型网格型n(1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细

14、微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法退出2微囊型包埋法微囊型包埋法n是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 退出微囊化法制备固定化酶有两种方法微囊化法制备固定化酶有两种方法n 界面沉淀法n界面聚合法退出 界面沉淀法界面沉淀法n这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。退出界面聚合法界面聚合法n是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。退出各类固定化方法的特点比较各类固定化方法的特点比较

15、: 比较项目吸附法结合法 交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合 制备难易易难易 较难较难固定化程度弱强中等 强强活力回收率较高低高 中等高载体再生可能不可能可能 不可能不可能费用低高低 中等低底物专一性不变可变不变 可变不变适用性酶源多较广广泛 较广小分子底物、药用酶退出化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续退出选择方法依据：选择方法依据： n（1） 酶的性质n（2） 载体的性质n（3） 制备方法的选择退出固定化后酶的考察项目：固定化后酶的考察项目：n（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。n（2） 考察固定化酶稳定性n（3） 考察固定化酶

16、最适反应条件退出一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素1 酶本身的变化发生了变化n活性中心的氨基酸残基n高级结构n电荷状态等退出一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素2 载体的影响n（1）扩散限制效应n（2） 空间障碍效应退出二二固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化1 固定化对酶活性的影响：n酶活性下降，反应速度下降n原因？退出二二 固定化酶的性质固定化酶的性质2 固定化对酶稳定性的影响n（1） 操作稳定性提高n（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。n (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。n (4 ) 对分解酶的稳定性提高。n（5） 对变性剂的耐受力升高

17、退出2 固定化后酶稳定性提高的原因：固定化后酶稳定性提高的原因：na. 固定化后酶分子与载体多点连接。nb.抑制自降解，提高了酶稳定性。退出3 pH的变化的变化nPH对酶活性的影响：n（1） 改变酶的空间构象n（2）影响酶的催化基团的解离n（3）影响酶的结合基团的解离n（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。退出4 最适温度变化最适温度变化n一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。n5 底物特异性变化n作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化n既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。退出6 米氏常数米氏常数Km的变化，的变化，Km值随载体值随

18、载体性质变化性质变化n（1） 载体与底物带相同电荷，KmKm固定化酶降低了酶的亲和力。n（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，KmKm退出三、评价固定化酶的指标：三、评价固定化酶的指标：n1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。n 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。n2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）退出三、评价固定化酶的指标：三、评价固定化酶的指标：n3. n4. n或称偶联效率，活力保留百分数。n5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称

19、为相对酶活力n 退出细胞固定化细胞固定化n固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.n该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。退出固定化细胞的特点固定化细胞的特点n类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞n生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）n 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞）n形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。n 最多使用：颗粒状珠体n使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。退出固定化培养优点固定化培养优点 n细胞可维持在较小体积培养液中生长； n细胞损

20、伤程度低； n易于更换培养液； n细胞和培养液易于分离； n培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。 退出退出细胞固定化培养法细胞固定化培养法 n动物细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术谓之细胞固定化培养法。动物细胞几乎都可采用固定化方法培养。固定化方法有：q吸附法（所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 ）q包埋法 （将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中）退出吸附法吸附法n它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。 退出影响吸附法的主要因素影响吸附法的主要因素 n（1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表

21、面电荷密度的大小n（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质n（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料退出包埋固定法包埋固定法 n包埋法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。n包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。 退出包埋法分类包埋法分类n常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺n常用凝胶包埋法退出举例海藻酸钙包埋法举例海藻酸钙包埋法n基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入

22、一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞退出通过改变载体溶液参数包埋细胞通过改变载体溶液参数包埋细胞 n改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。退出研究热点研究热点光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法 n例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得退出固定化培养装置固定化培养装置n多层平板装置n螺旋卷膜培养器n多层托盘式培养器n卷带式培养器n中空纤维及流化床式培养器 退出中空

23、纤维培养器优点中空纤维培养器优点 n细胞生长密度高，可达l08个毫升以上，细胞处于接近生理状态的理化梯度中；n营养物质可有效分布，代谢废物可及时排除；n细胞培养可达数月，易于实现连续培养；n细胞分泌的蛋白质浓度高。产品纯度可高达60一90；利于降低成本；n反应器体积小并可用于培养多种细胞。 退出微载体培养方法微载体培养方法 n将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法称为微载体培养法或微珠培养法。 n制备微载体的材料主要有：q葡聚糖（DEAESephadex A50及A25 ） q塑料q明胶q玻璃q纤维素 退出微载体培养优点微载体培养优点 n兼具单

24、层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养。n细胞所处环境均一，放大容易。n培养操作可系统化、自动化，障低了污染发生的机会。退出退出退出固定化原生质体固定化原生质体n何为原生质体？n有何优点？退出退出一一 原生质体的制备原生质体的制备n将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中加入水解酶分离得到原生质体退出高渗缓冲液高渗缓冲液n高渗缓冲液处理指对细胞或组织进行渗透压调节，即受体组织或细胞在适当浓度的高渗液进行一定时间的浸泡处理。n靶体经过高渗液一定时间的处理，体积缩小到原来的80%左右，细胞膜内外形成一个渗透压梯度。退出n渗透压调节能导致细胞发生质壁分离，阻止细胞质外渗，减少细胞的损

25、伤，提高细胞的活性，在基因枪法、电击穿孔法、微注射法等直接转化方法都有应用。退出n首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍。通常采用蜗牛酶除去细胞壁，n缓冲液(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。(2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。退出n原生质体稳定液(SMM)0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。n(一) 原生质体的制备1活化菌体将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接新鲜斜面。自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30培

26、养16 h 至对数期。退出n2离心洗涤、收集细胞分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。n将菌体分别悬浮于5 mL 高渗缓冲液中，振荡均匀，分别取样0.5 mL，用生理盐水稀释至10-6，分别各取0.1 mL 10-4、10-5、10-6 稀释液。n于相应编号的完全培养基平板上(每个稀释度做两个平板)，用刮棒涂布，30培养48 h 后进行总菌数测定。退出n3. 酶解脱壁各取3 mL 菌液于无菌小试管中，300

27、0 r/min 离心10 min，弃上清液，加入3 mL 含2.0 mg 蜗牛酶的高渗缓冲液(此高渗缓冲液含有0.1EDTA 和0.3SH-OH）于30振荡保温，定时取样镜检观察至细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成。退出n(二) 原生质体再生及剩余菌数的测定1再生分别吸取0.5 mL 原生质体(经酶处理)加入装有4.5 mL 高渗缓冲液及4.5 mL 无菌水试管中。经高渗缓冲液稀释至10-5；分别吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5。稀释液于相应编号的再生培养基平板上，30培养48 h 后，进行再生菌数测定(用双层再生培养基)。退出n2. 未脱壁菌数测定分别取0.5 mL 原

28、生质体至装有无菌水试管中，稀释到10-4；各取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 的稀释液于相应编号的完全培养基平板上，30培养48 h 后，进行未脱壁菌数测定。退出二二 原生质体固定化的方法原生质体固定化的方法n将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。退出四四 辅酶固定化辅酶固定化n1 原因n有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应n有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生n有机辅因子价格昂贵n工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生退出辅酶固定化的方法：辅酶

29、固定化的方法：n2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。n3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 退出辅酶的固定化辅酶的固定化退出辅酶固定化的形式：辅酶固定化的形式：退出生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇吸附包埋交联化学连续材料膜固定酶液凝胶吸附化学连接物固定化再循环系统凝胶吸附连续半连续分批间歇 连续活塞模式搅拌连续反应器间歇连续活塞模式搅拌连续反应器图 生物催化剂作用方式示意退出固定化酶（细胞）的应用固定化酶（细胞）的应用 n固定化酶和细胞的应用（工农业、医药、分析化学、酶电极、

30、亲和色谱、环境保护、能源开发、基础理论研究）退出退出二固定化酶（细胞）的应用二固定化酶（细胞）的应用n1. 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用n2 固定化酶在医药治疗上的应用n3 固定化酶在分析化学中应用n4 固定化酶和亲和色谱n5 固定化酶与环境保护n6 新能源开发中的应用n7 固定化酶在基础理论研究中应用退出1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用n葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。n利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶n固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类n热点：固定化原生质体的应用退出固定化酶在工业生产上的应用乙酰乙酰 -DL Al

31、a L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶退出泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala退出2 固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医药治疗上的应用n例1n固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。退出酶促合成头孢类抗生素酶促合成头孢类抗生素n - Reversible reaction n - Hydrolysis of substrate or product by biocatalystn - Difficulty of separation of product from reactantsCHCOOCH3NH2CH