分子医学技能：实验一 口腔黏膜细胞基因组DNA的制备

1、课堂秩序课堂秩序仪器设备与实验室安全环保仪器设备与实验室安全环保p微量移液器的正确使用微量移液器的正确使用p离心机的正确离心机的正确使用使用pDNADNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNADNA，如线粒体如线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA），叶绿体），叶绿体DNADNA（cpDNAcpDNA），质），质粒粒DNADNA。pRNARNA 存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。p除上述除上述DNADNA、RNARNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬外，还有非细胞形式存

2、在的病毒和噬菌体，其或只含菌体，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。1.1.核酸的分类核酸的分类染色体染色质纤维核小体组蛋白DNA核酸提取的主要步骤核酸提取的主要步骤主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。酸等。分离纯化基因组分离纯化基因组DNADNA的步骤的步骤 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提的提取方法有

3、所不同，分离方法也有差异。但原理相似，因此取方法有所不同，分离方法也有差异。但原理相似，因此它们有共同的步骤：它们有共同的步骤： 裂解细胞裂解细胞：SDS裂解细胞，裂解细胞，EDTA抑制核酸酶抑制核酸酶 除去蛋白质除去蛋白质：蛋白酶：蛋白酶K K水解蛋白质，酚和氯仿水解蛋白质，酚和氯仿/ /异戊醇异戊醇 抽提、分离蛋白质；抽提、分离蛋白质； 析出析出DNADNA：乙醇沉淀使：乙醇沉淀使DNADNA从溶液中析出。从溶液中析出。 应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等） 。减少化学因素

4、对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解p如过量酸碱如过量酸碱减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解p机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融p高温高温防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解p核酸酶的预防核酸酶的预防 实验目的及意义：实验目的及意义：p 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNADNAp 掌握基因组掌握基因组DNADNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理原理材料：材料：人口腔上皮细胞人口腔上皮细胞试剂：试剂：p 抽提缓冲液：抽提缓冲液：Tris-Cl pH8

5、.0 ，EDTA，NaCl，SDS，蛋白酶蛋白酶Kp Tris饱和酚饱和酚p 氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（V/V=24:1）p 70%乙醇、无水乙醇乙醇、无水乙醇p TE缓冲液：缓冲液：Tris，EDTA抽提缓冲液抽提缓冲液：由：由SDS、EDTA、蛋白酶蛋白酶K组成组成p SDS的作用是裂解细胞的作用是裂解细胞p EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对酶对DNA分子的降解作用。分子的降解作用。p 蛋白酶蛋白酶K的作用是水解蛋白质。的作用是水解蛋白质。酚和氯仿酚和氯仿/异戊醇异戊醇：抽提分离蛋白质：抽提分离蛋白质乙醇乙醇：沉淀：沉淀DNATE

6、：溶解：溶解DNA操作按钮容量刻度套头操作按钮容量刻度套头 20 l1000 l100 l1001002000.5-10l20-200l100-1000l1 0 . 02 0 01 0 0 0切记: 看着刻度调大小刻度刻度1 调节加样枪容量时调节加样枪容量时切勿超过最大容量切勿超过最大容量，否则加否则加 样枪将被损坏。样枪将被损坏。2 切勿自行拆卸加样枪切勿自行拆卸加样枪 3 对腐蚀性及毒性试剂等注意防范。对腐蚀性及毒性试剂等注意防范。取材取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水用生理盐水漱口后，口含生理盐水1015ml约约23min，用，用15ml离心管（离心管（4000rpm 10min）收集

7、细胞沉淀）收集细胞沉淀 （离心机的使用，平衡）（离心机的使用，平衡） 加入加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至，转移至1.5ml EP管管 （微量移液器的正确使用）（微量移液器的正确使用）混匀，混匀，65 温育温育30min 加入等体积的饱和酚加入等体积的饱和酚(0.5ml)（注意：取下层的酚溶液注意：取下层的酚溶液），），充分颠倒混匀充分颠倒混匀（不要剧烈震荡！）（不要剧烈震荡！）12000rpm 5min，上层水相转移至，上层水相转移至新的新的EP管管 （高速离心机的使用与安全意识）（高速离心机的使用与安全意识） 加入等体积加入等体积【氯仿氯仿/异戊醇异戊醇】，

8、颠倒混匀，颠倒混匀12000rpm 5min，上层水相转移到，上层水相转移到新的新的EP管管 加入加入2倍体积倍体积 无水无水乙醇，颠倒混匀乙醇，颠倒混匀12000rpm 10min 弃上清，沉淀中加入弃上清，沉淀中加入300 l 70%乙醇乙醇 12000rpm 2min 轻轻弃去上清，打开轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置盖，室温静置510min 加入加入50 l 0.1TE溶液，充分混匀后检测结果溶液，充分混匀后检测结果 n 变性不充分变性不充分(材料量太多，氯仿加入量太少，材料量太多，氯仿加入量太少，)n 关键过程反应时间过短关键过程反应时间过短(离心时间或速度不够离心时间或速度不够) n 操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作过程中用力