酶工程：第一章 绪论

1、酶 工 程第一章 绪论 二十一世纪是生物的世纪二十一世纪是生物的世纪？产业革命 第一次工业革命，是以机器取代人力（蒸汽技术革命） 第二次工业革命，以电力的大规模应用（电力技术革命） 第三次工业革命，以信息技术为代表 第四次产业革命，以生物技术、新能源为代表第一节 生物技术生物工程(Bioengineering)又称生物技术或生物工艺学(Biotechnology). 20世纪70年代发展起来的一门新的综合性技术学科。综合运用生物学、化学和工程学技术，改造物种、创造新物种，改造生物体中的某些组分(如酶、蛋白质、核酸、细胞器)，利用生物体的某些特殊机能(如酶的催化功能、抗体的免疫功能等) 为工农业

2、生产以及医疗卫生服务。生物学生物学化学化学工程工程工程学工程学化学化学生物生物工程工程生物生物化学化学生物生物技术技术第一节第一节 生物技术生物技术新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生1. 酶工程地位 生物技术主要分为发酵工程(微生物工程)、酶工程、基因工程和细胞工程。酶工程是重要组成部分。相互联系如下：生物技术的“第一次浪潮” 20世纪70年代 , 生物医药工程产业。 应用基因工程技术 , 从生物细胞内获得所需基因 , 将其并转入受体细胞 , 从而生产具有生理活性的蛋白质、多肽、酶、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等 。 产品用作疾病诊断、治疗诊断、治疗和预防预

3、防。“第二次浪潮” 1983年转基因植物问世 , 1986年被批准进入田间试验 。 应用基因工程技术和细胞工程技术基因工程技术和细胞工程技术建立了一系列快速高效的动植物育种新方法。 1996年转基因植物进入市场。预计21世纪农业生产品种的90%将通过生物技术改良 , 生物技术对农业生产技术总贡献率会高于70%。生物技术“第三次浪潮” Barry Marrs etal 1999 “Current Opinion of Microbiology” 继医药和农业之后，工业生物催化已经被广 泛看作 是生物技术的“第三次浪潮”。三次生物技术浪潮的特点第一次第二次第三次技术基因工程细胞工程酶工程产品蛋白质

4、或多肽药物优良品质的农作物各种小分子或大分子用途医药农业几乎涉及各行业生物经济的未来 比尔盖茨预言，超过他的下一个世界首富必出自生物技术领域。 全球生物经济总量每5年翻一番，增长率为25%30%，是世界经济增长率的10倍 2020年超过信息经济工业生物技术 含意：在工业规模的生产过程中使用或含意：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务提供产品和服务 核心目标：大规模利用生物体系（如细核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化胞或酶）作

5、为催化剂实现物质转化 工业生物技术是生物技术的重要组成部分工业生物技术是生物技术的重要组成部分工业生物技术发展空间工业生物技术发展空间提升传统产业提升传统产业生物能源生物能源环境生物技术环境生物技术生物材料生物材料底物底物生物反应器生物反应器检测控检测控制仪表制仪表培养基培养基（灭菌）（灭菌）经加工经加工原料原料酶酶细胞细胞生物催化剂生物催化剂（游离或固定化）（游离或固定化）机械能机械能除除菌菌空气空气产品提取纯化产品提取纯化副产品副产品产品产品废物废物热能热能原材料原材料营养物营养物典型工业生物技术过程典型工业生物技术过程2. 酶是什么？ 酶:具有催化反应功能的蛋白质。19世纪中叶，巴斯德认

6、为活的酵母细胞内有一种可以将糖发酵为乙醇的物质。1878年，Kunne将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。希腊文的意思是“在酵母中”1926年，Sumner首次从刀豆提取液中得到尿酶结晶，并证明其为蛋白质。 核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子,是生物催化剂。1982年，Cech在四膜虫中发现核酶。酶的发展史 4000多年前，酿酒， 1833年，分离淀粉酶 1878，Kunne首次定义酶 1913，米氏方程 1926年，Sumner首次得到脲酶结晶，并证明其为蛋白质。 1947年的诺贝尔奖。 1950s，Koshland提出诱导契合学说。 1969年，Jacob和Monod提出操纵

7、子学说。 1982年，Cech发现四膜虫的核酶Ribozyme。 获得1989年诺贝尔奖。 1980s，非水相催化3.1 酶学理论研究 脲酶结晶的获得与蛋白质本质 锁匙学说与诱导契合学说 中间络合物学说与酶促反应动力学 酶作用机理（酶理化性质及催化性质）的研究 酶蛋白质一级结构测定方法 酶蛋白分子结构与功能的关系 酶学是生物化学的重要分支3.2 酶工程应用研究1、酶制剂的分离、提纯、大批量生产及新酶的开发；、酶制剂的分离、提纯、大批量生产及新酶的开发；2、酶生产中的基因工程技术的应用；、酶生产中的基因工程技术的应用；3、酶分子的改造、酶分子的改造(修饰、模拟与抗体酶等）；修饰、模拟与抗体酶等）

8、；4、酶与细胞的固定化；、酶与细胞的固定化；5、酶制剂的应用性开发；、酶制剂的应用性开发；6、生物催化；、生物催化；7、酶抑制剂、激活剂开发及应用研究；、酶抑制剂、激活剂开发及应用研究；8、酶反应器的研究（包括反应检测、酶传感器）；、酶反应器的研究（包括反应检测、酶传感器）； 酶工程（酶工程（Enzyme EngineeringEnzyme Engineering）是生物工程的主要内容之）是生物工程的主要内容之一，是随着酶学研究迅速发展、特别是酶的应用推广，使一，是随着酶学研究迅速发展、特别是酶的应用推广，使酶学和工程学相互渗透结合，发展而成的一门新的技术科酶学和工程学相互渗透结合，发展而成的

9、一门新的技术科学。学。4. 酶催化作用的特点 酶催化作用的专一性强 酶催化作用的效率高 酶催化作用的条件温和5. 酶的分类和命名 1961年国际生物化学学会酶学委员会推荐了一套新的系统命名方案及分类方法，已被国际生物化学学会接受。决定每一种酶应有一个系统名称和一个习惯名称。六大类（记住）1. 氧化还原酶 Oxido-reductasesOxido-reductases2. 转移酶 TransferasesTransferases3.3. 水解酶水解酶 hydrolaseshydrolases4. 裂合酶 LyaseLyase5. 异构酶 IsomerasesIsomerases6. 合成酶 L

10、igases or SynthetasesLigases or Synthetases国际命名 EC (Enzyme Commision) 大类 亚类 亚亚类 编号EC 3.1.1.3举例：乳酸脱氢酶（E C 1 . 1 . 1 . 27） 催化乳酸脱氢生成丙酮酸。 其编号中：第一个1，表示该酶属于第1大类，即氧化还原酶类；第二个1，表示该酶属于氧化还原酶类中的第一亚类，催化醇的氧化；第三个1，表示该酶属于氧化还原酶类中第一亚类的第一亚亚类；受氢体为NAD+ ； “27” ；表示乳酸脱氢酶在此亚亚类中的顺序号。6. 米氏方程 Michaelis & Menten根据中间产物学说推导出表

11、示酶促反应中底物浓度与反应速度关系的公式称为米氏方程：Km + SVmax SV = 米氏方程的推导：米氏方程的推导： 根据中间产物学说：根据中间产物学说：式中式中K1,K2,K3分别为各反应常数，可知：分别为各反应常数，可知： ES形成速度形成速度= K1 E S ES分解速度分解速度=(K2, + K3 ) ES当反应达恒稳态时当反应达恒稳态时,二速度相等二速度相等,即即: K1 E S =(K2, + K3 ) ESS + E ES E + PK1K3K2整理并令：整理并令： 由于由于E 与与ES之和为总的酶浓度之和为总的酶浓度E0 , 即即: E0= E +ES E = E0ES 将代

12、入将代入: ESK1=E S (K2, + K3 )KmES=(E0ES) SKm 整理得整理得:酶促反应速度由酶促反应速度由ES决定决定,而而v= K3 ES ES=将代入整理得将代入整理得:ES=E0SKm+SvK3=E0SKm+SvK3 此时达到最大反应速度此时达到最大反应速度Vmax: Vmax= K3 E0 将代入将代入 即为米氏方程即为米氏方程 当当S 升高升高,所有所有E为为S所饱和时所饱和时,即即: E0 =ES=SKm+SvVmax 关于米氏方程的讨论关于米氏方程的讨论1、 Km S 时时： v=VS/ Km 初速度与初速度与S成正比成正比的的一级反应一级反应。2、若若Km

13、100KmS100Km时：时：v= Vmv= Vm S / (Km +S) S / (Km +S) VmVm，即反，即反应初速度接近于最大速度。而应初速度接近于最大速度。而Vm Vm = = K K3 3 EE0 0 ，即，即酶活性直酶活性直接正比于接正比于EE0 0 ，而与，而与SS无关无关（表明酶活性部位全部被底（表明酶活性部位全部被底物占据）。物占据）。在测定酶活性时，一般选择此条件。在测定酶活性时，一般选择此条件。 vSS或或PS0SPS0/2t1/2=S0/2Vmt 测定酶活力的基本要求测定酶活力的基本要求1 1、要使反应系统中要使反应系统中除除待测酶浓度待测酶浓度是影响反应速度的是

14、影响反应速度的唯一限制性因素唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；（反应速度定量酶活力）；2 2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）；力）； 所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下几方面做工作：几方面做工作： 底物？底物？ pHpH？ 温度？温度？ 样品？样品？ （二）（二）、测定条件选择：、测定条件选择： 1 1、底物、底物 种类选择：最适底物，如种类选择：最适底物，如- a a）对于绝对专一的酶无可选择；若相对专一）对于绝对专一的酶无可选择；若相对专一则选则选KmKm最小的底物，即所谓最适

15、底物；一般选最小的底物，即所谓最适底物；一般选工作底物（胰凝乳蛋白酶对肽键、酯键、酰胺工作底物（胰凝乳蛋白酶对肽键、酯键、酰胺键）；键）； b b）要求）要求反应前后有可测定的理化性质变化，反应前后有可测定的理化性质变化，如：如： 脱氢酶的脱氢酶的NADNAD+ +、溶菌酶、溶菌酶 c c）稳定）稳定 浓度选择：浓度选择： a a） s=100Kms=100Km； b b） 有时不宜采用高底物浓度（有有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等酶反应等) )则根据具体条件，通则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。过实验选一适当浓度。 2、最适最适

16、pH a a）选择最适）选择最适pHpH并维持在这一范围。并维持在这一范围。 b b）pHpH的稳定通常借助缓冲系统来控制，的稳定通常借助缓冲系统来控制，要要 求稳定、无干扰、价廉。求稳定、无干扰、价廉。 C C）离子种类和强度。）离子种类和强度。 如：柠檬酸、磷酸系统等。可查表选取。如：柠檬酸、磷酸系统等。可查表选取。 3 3、 最适温度最适温度 酶反应温度系数为每变化酶反应温度系数为每变化 1 1 摄氏度，反应速度相差摄氏度，反应速度相差10%10%以上。以上。所以测酶活力时温度保持恒定十分所以测酶活力时温度保持恒定十分重要，一般应控制在正负重要，一般应控制在正负1 1摄氏度摄氏度以内。以

17、内。 4 4、样品、样品 对某一待测样品测定前对某一待测样品测定前, ,除了上述因素除了上述因素需考虑外，还有一个重要问题是对样品的需考虑外，还有一个重要问题是对样品的了解，要确定样品中有无干扰测定结果的了解，要确定样品中有无干扰测定结果的因素因素（与待测酶作用同一底物或生成同一（与待测酶作用同一底物或生成同一产物的其它酶）。产物的其它酶）。 空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、自发空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、自发反应）引起的变化量反应）引起的变化量 空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加而预空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加而预先使酶失效而测定先使酶失效而测定 例如：

18、例如： GPT GPT 测定中测定中 先不加底物；先不加底物； 酸性磷酸酯酶中酸性磷酸酯酶中 先不加酶；先不加酶； 对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样品酶对照来定量。品酶对照来定量。（三）、测定方法三）、测定方法（测产物增加量）（测产物增加量） 取样测定法取样测定法 在酶反应开始后不同时间，从反应系统在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，并用适当方法停止其中取出一定量反应液，并用适当方法停止其反应后（酸、碱、热；变性剂等），再根据反应后（酸、碱、热；变性剂等），再根据产物与底物在物化性质上的差别进行分析，产物与底物在物化性质上的

19、差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量的方法；求得单位时间的酶促反应变化量的方法； 连续测定法连续测定法 根据底物产物的理化性质不同，在反应根据底物产物的理化性质不同，在反应过程中对系统进行直接、连续观察的方法。过程中对系统进行直接、连续观察的方法。 化学法化学法: : 是取样法的一种是取样法的一种, ,比较古老比较古老, ,但目前仍普遍但目前仍普遍使用。一是因为此法不需要特殊仪器，而且几使用。一是因为此法不需要特殊仪器，而且几乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学性质找出具体的有特异性的测定方法。性质找出具体的有特异性的测定方法。 例：腈水合酶丙

20、烯酰胺测定例：腈水合酶丙烯酰胺测定 （工作量大、含误差大、不够准确）（工作量大、含误差大、不够准确） 光学法光学法（灵敏度高、快速、简便）（灵敏度高、快速、简便） 它是一种连续测定法，是根据底物它是一种连续测定法，是根据底物和产物在某一波长或波段上有明显特征和产物在某一波长或波段上有明显特征吸收差别而建立起来的方法。吸收差别而建立起来的方法。 光学法又可分为三种：光学法又可分为三种： 光吸收法；光吸收法； 荧光法；荧光法； 旋光测定法。旋光测定法。 光吸收法：光吸收法： 这是几乎所有氧化还原酶都可采用的方法。这是几乎所有氧化还原酶都可采用的方法。1 1、脱氢酶的、脱氢酶的辅酶辅酶NADHNAD

21、H(NADPH)(NADPH)在在340nm340nm有吸收峰的有吸收峰的特征；特征；2 2、双键的变化双键的变化常伴随光吸收的变化，所以催化双常伴随光吸收的变化，所以催化双键饱和或双键形成的酶反应，也可用光吸收法；键饱和或双键形成的酶反应，也可用光吸收法；3 3、催化、催化环状结构变化环状结构变化的酶反应也常用此法测定。的酶反应也常用此法测定。 许多酶本身不能采用光吸收法，但其产物中有许多酶本身不能采用光吸收法，但其产物中有脱氢酶底物，则因此可用酶偶联进行测定。脱氢酶底物，则因此可用酶偶联进行测定。 荧光法：荧光法： 其原理是酶反应的底物或产物具有其原理是酶反应的底物或产物具有荧光性，用荧光

22、变化速度即可测出反应荧光性，用荧光变化速度即可测出反应速度。荧光法的灵敏度比光吸收法高速度。荧光法的灵敏度比光吸收法高2-2-3 3个数量级，特别适于酶或底物量低的个数量级，特别适于酶或底物量低的分析。但荧光法干扰多，需要校正。分析。但荧光法干扰多，需要校正。 旋光测定法：旋光测定法： 某些酶反应过程中常伴随有底物或产某些酶反应过程中常伴随有底物或产物旋光性质变化。可用物旋光性质变化。可用自动旋光仪自动旋光仪来测定来测定这类酶的反应。此法准确度、灵敏度不高，这类酶的反应。此法准确度、灵敏度不高，不方便，但在没有其它更好的方法时，可不方便，但在没有其它更好的方法时，可考虑采用此法。考虑采用此法。

23、 如在蔗糖酶催化蔗糖转化为葡萄糖或如在蔗糖酶催化蔗糖转化为葡萄糖或果糖的反应中，可采用旋光测定法。果糖的反应中，可采用旋光测定法。 电化学法电化学法: : 也是一类连续测定法，其灵敏度和也是一类连续测定法，其灵敏度和准确度都很高，可和光学法相比；而且准确度都很高，可和光学法相比；而且测定系统被污染也不会影响结果，主要测定系统被污染也不会影响结果，主要用电极进行测定，常用的是离子选择性用电极进行测定，常用的是离子选择性电极和氧电极。电极和氧电极。 量气法量气法: : 主要用于有气体吸收或释放的反应，主要用于有气体吸收或释放的反应，如氧化酶反应如氧化酶反应耗气耗气、脱羧酶、脲酶等催、脱羧酶、脲酶等

24、催化的化的产气产气反应。常用瓦氏呼吸仪测定恒反应。常用瓦氏呼吸仪测定恒定体积内压力变化。此法主要缺点是准定体积内压力变化。此法主要缺点是准确度、灵敏度不太高，且操作麻烦。确度、灵敏度不太高，且操作麻烦。 放射化学测定法放射化学测定法: : 测定时用同位素标记底物，在酶反测定时用同位素标记底物，在酶反应进行中，导致放射性标记产物定量形应进行中，导致放射性标记产物定量形成，分离产物与底物，进行产物的放射成，分离产物与底物，进行产物的放射性测定或未反应底物的放射性测定，这性测定或未反应底物的放射性测定，这样就可测知反应进行的速度或酶的活性。样就可测知反应进行的速度或酶的活性。 用于标记的同位素通常有

25、：用于标记的同位素通常有： 3 3H H、1414C C、3232P P、3535S S、131131I I 酶偶联分析法酶偶联分析法: : 某些酶本身不能应用上述几种方法测定时，某些酶本身不能应用上述几种方法测定时，则可偶联一个酶反应进行测定。所谓酶偶联法则可偶联一个酶反应进行测定。所谓酶偶联法是应用过量、高度专一的是应用过量、高度专一的“偶联工具酶偶联工具酶”使被使被测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。便、准确测定阶段的方法。 A B CE1E2 A B CE1E2 被测反应的产物是某脱氢酶的底物被测反应的产物是某脱氢酶的底物, ,即即B B是脱氢酶是脱氢酶E2E2的底物的底物, ,测定系统中加入足量的测定系统中加入足量的脱氢酶脱氢酶E2E2和和NADHNADH, ,使反应进行到使反应进行到C C, ,然后通过然后通过NADHNAD