《项目层析技术》ppt课件

1、层析技术层析技术层析技术层析技术层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是19061906年俄国植物学家发年俄国植物学家发现并命名的。他将植物叶子的色素经过装填有现并命名的。他将植物叶子的色素经过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后构成不同的色带而被分开，由此得名为构成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法色谱法。引言引言 后来无色物质也可利用吸附柱层析分别。后来无色物质也可利用吸附柱层析分别。 19441944年出现纸层析。年出现纸层析。 以后层析法不断开展，相继出现气相层析、高压液相以后层析法不断开展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析

2、、亲和层析、凝胶层析等。层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法的根本原理层析法的根本原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别如吸附力、分子外形及大小、分子亲和力、分配系如吸附力、分子外形及大小、分子亲和力、分配系数等，使各组分在两相一相为固定的，称为固定数等，使各组分在两相一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相中的分布程度相；另一相流过固定相，称为流动相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度挪动而到达分别的不同，从而使各组分以不同的速度挪动而到达分别的目的。目的。层析法的分类层析法的分类 按两相所处的形状分类：按两

3、相所处的形状分类： 流动相有两种形状：流动相有两种形状： * *液体作为流动相液体作为流动相 * *气体作为流动相气体作为流动相 固定相也有两种形状：固定相也有两种形状： * *固体吸附剂作为固定相固体吸附剂作为固定相 * *以吸附在固体上的液体作为固定相以吸附在固体上的液体作为固定相 按两相所处的形状分为：按两相所处的形状分为： 液相层析液相层析 液液- -固层析固层析 液液- -液层析液层析 气相层析气相层析 气气- -固层析固层析 气气- -液层析液层析 按层析过程的机理分类按层析过程的机理分类 吸附层析：利用吸吸附层析：利用吸附剂对不同组分吸附性能的附剂对不同组分吸附性能的差别，从而到

4、达分别鉴定的差别，从而到达分别鉴定的目的。目的。 分配层析：利用不同分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分别。的分配系数不同，使之分别。 离子交换层析：利用离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和不同组分对离子交换剂亲和力的不同，使之分别。力的不同，使之分别。 凝胶层析：利用某些凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同，使之分分阻滞作用的不同，使之分别。别。n按操作方式不同分类按操作方式不同分类n 柱层析：将固定相装于柱内，使柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向挪动从而到达分别。样品沿一个方向挪

5、动从而到达分别。n 纸层析：用滤纸做液体的载体，点纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以到达分别鉴样后，用流动相展开，以到达分别鉴定的目的。定的目的。n 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进展物成薄层，以纸层析类似的方法进展物质的分别和鉴定。质的分别和鉴定。柱层析柱层析 把吸附剂装在一支玻璃管中把吸附剂装在一支玻璃管中, ,做成色谱柱。然做成色谱柱。然 后将试液加在柱内，假设试液中含有后将试液加在柱内，假设试液中含有A A、B B两两种组分，那么种组分，那么A A和和B B便被吸附剂固定相吸附便被吸附剂固定相吸附在柱的上端。再用

6、一种洗脱剂流动相进展在柱的上端。再用一种洗脱剂流动相进展冲脱，这时在管内就延续不断发生溶解、吸附、冲脱，这时在管内就延续不断发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的景象。再溶解、再吸附的景象。 假设对假设对A A的吸附才干较弱，那么的吸附才干较弱，那么A A就较易溶解而就较易溶解而较难吸附，在柱中挪动就较快。当冲洗到一定较难吸附，在柱中挪动就较快。当冲洗到一定程度时，两者即可以完全分开，构成两个带。程度时，两者即可以完全分开，构成两个带。 在继续冲洗，在继续冲洗，A A物质便从柱中流出来，将流出液物质便从柱中流出来，将流出液承接于一个容器中。然后承接于一个容器中。然后B B物质被洗脱下来，用物质被洗脱

7、下来，用另一个容器承接。这样便可将另一个容器承接。这样便可将A A、B B两种物质分两种物质分别。别。 如以下图所示如以下图所示纸层析纸层析 这是一种微量分别方法。这是一种微量分别方法。 用滤纸做载体，利用纸上吸着的水分作为固定相，将用滤纸做载体，利用纸上吸着的水分作为固定相，将滤纸条点试液的一端浸在有机溶剂中留意不要把原滤纸条点试液的一端浸在有机溶剂中留意不要把原点浸入有机溶剂中该有机溶剂为流动相展开剂。点浸入有机溶剂中该有机溶剂为流动相展开剂。由于滤纸条毛细管的作用。流动相将不断上升，当流由于滤纸条毛细管的作用。流动相将不断上升，当流动相上升的时候，与点在滤纸条上的试样相遇，这时动相上升的

8、时候，与点在滤纸条上的试样相遇，这时试样中欲分别的组分就溶解在流动相中并随之上升。试样中欲分别的组分就溶解在流动相中并随之上升。当欲分别的组分遇到上面的固定相时，又溶解在固定当欲分别的组分遇到上面的固定相时，又溶解在固定相中而停下来，接着又被不断上升的流动相所溶解。相中而停下来，接着又被不断上升的流动相所溶解。 于是就在两相之间一次又一次地发生分配过程相当于是就在两相之间一次又一次地发生分配过程相当于一次又一次的萃取，从而将各组分逐个分开。于一次又一次的萃取，从而将各组分逐个分开。薄层层析薄层层析 利用吸附剂对化合物吸附才干的不同而到达分别，吸利用吸附剂对化合物吸附才干的不同而到达分别，吸附剂

9、吸附才干的大小与化合物极性大小有关。由于硅附剂吸附才干的大小与化合物极性大小有关。由于硅胶或氧化铝薄层的毛细管作用，展开剂将沿着薄层逐胶或氧化铝薄层的毛细管作用，展开剂将沿着薄层逐渐上升。在上升过程中，当遇到新的吸附剂时，又被渐上升。在上升过程中，当遇到新的吸附剂时，又被吸附下来。接着又被不断流过的展开剂溶解，再随着吸附下来。接着又被不断流过的展开剂溶解，再随着展开剂继续上升。展开剂继续上升。 试样中的各个组分将按照它们对硅胶或氧化铝吸附才试样中的各个组分将按照它们对硅胶或氧化铝吸附才干强弱的不同而别分开来。干强弱的不同而别分开来。 化合物极性大，被吸附剂吸附得牢，化合物极性大，被吸附剂吸附得

10、牢，RfRf值小，反之，值小，反之，化合物极性小，化合物极性小，RfRf值大。值大。 特点：薄层层析法分别迅速，普通特点：薄层层析法分别迅速，普通1560min1560min内内可以完成，操作简便，灵敏度高。可以完成，操作简便，灵敏度高。 近年广泛应该在制药、农药、染料、抗生素等近年广泛应该在制药、农药、染料、抗生素等工业中。工业中。薄层层析操作方法薄层层析操作方法 1、硅胶、硅胶CMCNa薄层板的制备：薄层板的制备： 称取称取CMCNa(羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠)0.15g溶于溶于30mL蒸蒸馏水中馏水中搅拌搅拌(如不溶可加热如不溶可加热)至全部溶解至全部溶解参与层析用参与层析用硅胶硅胶

11、10g充分搅拌均匀，研磨成糊状充分搅拌均匀，研磨成糊状倒入玻璃板，倒入玻璃板，用食指和拇指拿住玻片，作前后左右悄然摇动，至流用食指和拇指拿住玻片，作前后左右悄然摇动，至流动的硅胶均匀地铺在玻璃片上动的硅胶均匀地铺在玻璃片上,程度放置，室温阴干程度放置，室温阴干至无水气存在至无水气存在于于105烘箱中活化烘箱中活化2h枯燥器中冷枯燥器中冷却备用却备用 2、点样、点样 选取制备好的薄板一块，在距底边选取制备好的薄板一块，在距底边2cm 的程度直线上的程度直线上选几个点，各点间距选几个点，各点间距1.5或或2cm，离板边约有，离板边约有lcm的间的间隔。用毛细管分别点上不同的样品于各个点，样品量隔。

12、用毛细管分别点上不同的样品于各个点，样品量控制在控制在510g，斑点直径普通为，斑点直径普通为23 mm，干后再点，干后再点一次。一次。 3、展层、展层 点样终了，待薄层上样品自然枯燥后，将薄板点样终了，待薄层上样品自然枯燥后，将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，薄板与液面成置于盛有层析溶剂的层折缸中，薄板与液面成15左右的夹角，点有样品的一端浸入溶剂中，左右的夹角，点有样品的一端浸入溶剂中，深达深达0.5cm左右、扩展剂液面应低于点样线，左右、扩展剂液面应低于点样线，盖好层析槽盖，自下向上展层，当展层溶剂到盖好层析槽盖，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约达离薄板顶端约1cm 处时取出薄板

13、，标出溶剂处时取出薄板，标出溶剂前沿位置，用热风吹干。前沿位置，用热风吹干。 4、显色：、显色： 除尽溶剂后用喷雾器均匀地喷上显色剂，烘干除尽溶剂后用喷雾器均匀地喷上显色剂，烘干使其显色，计算使其显色，计算Rf值。值。或使之出现各种有色的斑点，与规范进展对照或使之出现各种有色的斑点，与规范进展对照比较，可确定其成分。比较，可确定其成分。 Rf= 起始线到样品斑点中心间隔起始线到样品斑点中心间隔 /起始线到溶起始线到溶剂前沿的间隔剂前沿的间隔 1 1、吸附层析技术、吸附层析技术吸附层析法液吸附层析法液- -固色谱法，固色谱法，LSCLSC原理原理 利用固定相的固体吸附剂外表对不利用固定相的固体吸

14、附剂外表对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用解吸作用的差别进展分溶解作用解吸作用的差别进展分别。别。 特点特点 适宜分别不同种类的化合物适宜分别不同种类的化合物( (醇类醇类和芳香烃和芳香烃二、吸附剂二、吸附剂吸附剂是具有大外表积的活性多孔固吸附剂是具有大外表积的活性多孔固体，活性多孔固体与待分别物质的体，活性多孔固体与待分别物质的极性官能团作用。极性官能团作用。常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等。铝、羟基磷灰石等。羟基磷灰石羟基磷灰石HAHACa10(PO4)6.(OH)2,Ca10(PO4)6.(OH)2

15、,可用于分别蛋可用于分别蛋白质与核酸。其外表有白质与核酸。其外表有Ca2+Ca2+和和PO43-PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与可与Ca2+Ca2+结合；碱性蛋白质可与结合；碱性蛋白质可与PO43-PO43-结合。结合。HAHA柱层析最重要的用途柱层析最重要的用途之一是分别单链之一是分别单链DNADNA和双链和双链DNADNA，由，由于它对双链于它对双链DNADNA的亲和力大于单链的亲和力大于单链DNADNA。2 2、分配层析技术、分配层析技术分配层析法液分配层析法液- -液层析法，液层析法，LLCLLC原理原理 利用混合物在两种不相混溶的液相固定相利

16、用混合物在两种不相混溶的液相固定相和流动相之间的分配系数的不同而到达分和流动相之间的分配系数的不同而到达分别各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载别各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体外表，流动相流过固定相。体外表，流动相流过固定相。分配系数：分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在两种溶剂中的浓度之比是个常数，称为它在两种溶剂中的浓度之比是个常数，称为分配系数。分配系数。K=c1/c2K=c1/c2 分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，挪动快；分配系数大的溶质在固定相分多，挪动快；分配系数大的溶

17、质在固定相分配的数量多，挪动慢。因此可彼此分开配的数量多，挪动慢。因此可彼此分开特点：液特点：液- -液层析法适宜于分别同系物或同分液层析法适宜于分别同系物或同分异构体异构体A ABCDE321616 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8 层析柱分别物质的表示图层析柱分别物质的表示图固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm5cm，固定相周围充溢液体流动相，每，固定相周围充溢液体流动相，每厘米柱中液相体积为厘米柱中液相体积为1cm31cm3。假设在柱顶参与。假设在柱顶参与1cm31cm3溶剂溶剂, ,其中含其中含32mg32mg样品，同时样品，

18、同时应有一样体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中应有一样体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A A位置。假设样品的分配位置。假设样品的分配系数是系数是1 1，那么它在固相与液相间等量分配。假设再有，那么它在固相与液相间等量分配。假设再有1cm31cm3的溶剂加到柱上，的溶剂加到柱上，A A部分中的溶剂带着部分中的溶剂带着16mg16mg的物质向下挪动到的物质向下挪动到B B，A A和和B B中的物质都将发生再分配中的物质都将发生再分配. .3 3、凝胶过滤层析技术、凝胶过滤层析技术根本原理根本原理概念概念 排阻层析，分子筛层析：排阻层析，分子筛层析：当生物大分子经过装有凝胶颗当生物大分子经

19、过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进展分别的技术。大小不同而进展分别的技术。原理原理 凝胶颗粒内部具有多孔网状凝胶颗粒内部具有多孔网状构造，被分别的混合物流过层构造，被分别的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下挪动，并最粒之间的空隙向下挪动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自在出入凝胶子能不同程度的自在出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较孔内外，在柱内经过的路程较长挪动速度较慢，最后被洗脱长挪动速度较慢，最后被洗脱出来。出来

20、。凝胶颗粒凝胶颗粒凝胶过滤在实验室中的运用凝胶过滤在实验室中的运用1 1生物大分子物质的分别纯化生物大分子物质的分别纯化2 2分子量的测定分子量的测定3 3分级分别分级分别4 4溶液浓缩溶液浓缩5 5平衡常数的测定平衡常数的测定6 6细胞及颗粒的分别细胞及颗粒的分别LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测LogM=k1-k2VeLogM=k1-k2Ve蛋白质经过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关，蛋白质经过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关，VeVe为洗脱体积为洗脱体积先测得几种规范蛋白质的先测得几种规范蛋白质的VeVe，并以其分子量对数对，并以其分子量对数对VeV

21、e作图得不断线，再测出作图得不断线，再测出待测样品的待测样品的VeVe，查规范曲，查规范曲线即可确定分子量。线即可确定分子量。原理原理 根据离子交换树脂对需求分别的根据离子交换树脂对需求分别的各种离子的亲和力不同而到达分别的各种离子的亲和力不同而到达分别的目的。目的。将离子交换树脂装入层析柱。将离子交换树脂装入层析柱。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团物质，分子中含有可解离的基团. .含含有酸性可解离基团的称为阳离子交换有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出树脂，可解离出 H+H+，含有碱性可解离基团的称，含有碱性可解离基团

22、的称 为阴离子交换树脂，可解离出为阴离子交换树脂，可解离出 OH-OH-4 4、离子交换层析法、离子交换层析法离子交换层析的根本原理离子交换层析的根本原理+假设选择阳离子交换树脂，那么带正电荷的物质与假设选择阳离子交换树脂，那么带正电荷的物质与H+H+发生交换而发生交换而结合在树脂上。假设选择阴离子交换树脂，那么带负电荷的物质可结合在树脂上。假设选择阴离子交换树脂，那么带负电荷的物质可与与OH-OH-发生交换而结合在树脂上。发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的结实程度即亲和力大小有差别，因此选用适物质在树脂上结合的结实程度即亲和力大小有差别，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，到达分别纯化的当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，到达分别纯化的目的。目的。+原理原理 利用生物大分子间特异的亲和才干来纯利用生物大分子间特异的亲和才干来纯化生物大分子化生物大分子 如：抗原和抗体如：抗原和抗体 ； 酶酶和底物或辅酶或抑制剂和底物或辅酶或抑制剂 ； 激素和受体；激