majun-基因工程-基因文库的构建 目的基因的获取

1、第六章第六章 基因文库的构建基因文库的构建生物科学与技术学院生物科学与技术学院基因文库基因文库基因文库（gene librarygene library）也称也称DNADNA文库，是指某一生物体全部或部文库，是指某一生物体全部或部分基因的集合。具体来讲，某个生物的基因组分基因的集合。具体来讲，某个生物的基因组DNADNA或或cDNAcDNA片段与适当的载片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集

2、合即为该生物的基因文基因文库库。用于基因克隆的用于基因克隆的DNADNA材料的来源材料的来源从特定组织提取的染色体基因组DNA-基因组文库基因组文库mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNAcDNA文库文库用于基因克隆的用于基因克隆的DNADNA材料的选择材料的选择如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推导出来； 如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。 第一节第一节 基因组文库的构建基因组文库的构建基因组文库 (GENOMIC LIBRARY) 定 义：

3、某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中，这个群体就称为该生物基因组的文库。即指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落或噬菌斑。目 的： a）分离有用的目的基因 b）保存某种生物的全部基因基因组基因组DNADNA文库的类型文库的类型构建基因文库的载体类型决定了插入片段的大小和用途。每类载体构建基因文库的载体类型决定了插入片段的大小和用途。每类载体适合构建不同的基因文库，满足不同的研究目的。适合构建不同的基因文库，满足不同的研究目的。1 1、质粒文库、质粒文库质粒载

4、体是最早用于构建基因组文库的载体。质粒载体是最早用于构建基因组文库的载体。质粒载体所容纳的外源质粒载体所容纳的外源DNADNA片段一般在片段一般在10kb10kb以内。以内。质粒文库一般应用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。质粒文库一般应用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。2 2、噬菌体文库、噬菌体文库噬菌体载体是噬菌体文库中应用最广泛的载体，其利于用分子杂噬菌体载体是噬菌体文库中应用最广泛的载体，其利于用分子杂交的方法进行筛选，因此常用于构建小基因组物种的基因克隆。交的方法进行筛选，因此常用于构建小基因组物种的基因克隆。M13M13单链噬菌体载体一般用于构建单链噬菌体载体一般用于构建BACBAC

5、和和PACPAC亚克隆文库或亚克隆文库或cDNAcDNA文库。文库。3 3、黏粒文库（柯斯质粒文库）、黏粒文库（柯斯质粒文库）黏粒载体与噬菌体载体类似。黏粒载体与噬菌体载体类似。主要用于构建小基因组物种的基因组主要用于构建小基因组物种的基因组DNADNA文库。有时也用于构文库。有时也用于构建大基因组物种的基因组建大基因组物种的基因组DNADNA文库，利用他们在筛选上的优势文库，利用他们在筛选上的优势来分离单个基因或构建一定区间范围的亚基因组来分离单个基因或构建一定区间范围的亚基因组DNADNA文库。文库。4 4、人工染色体文库、人工染色体文库也称为大片段基因组也称为大片段基因组DNADNA文库

6、，容纳的外源文库，容纳的外源DNADNA片段为片段为100kb-100kb-1Mb1Mb。主要用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组主要用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序等。测序等。5 5、亚基因组文库、亚基因组文库亚基因组文库亚基因组文库是相对于基因组文库提出的，文库的对象不是是相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组DNADNA某一特某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段。定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段。一般而言，亚基因组文库主要应用在基因组较小的物种

7、基因一般而言，亚基因组文库主要应用在基因组较小的物种基因克隆和大基因组物种的后期研究。克隆和大基因组物种的后期研究。文库的代表性和随机性文库的代表性和随机性为保证能从基因组文库中筛选到某个特定的基因，基因组文为保证能从基因组文库中筛选到某个特定的基因，基因组文库必须具有一定的代表性和随机性。库必须具有一定的代表性和随机性。代表性指文库中所有克隆所携带的代表性指文库中所有克隆所携带的DNADNA片段可以覆盖整个基因片段可以覆盖整个基因组，也就是说，可以从文库中分离任何一段基因组组，也就是说，可以从文库中分离任何一段基因组DNADNA。代表。代表性是衡量文库质量的一个重要指标。性是衡量文库质量的一

8、个重要指标。采用部分酶切或随机切割的方法来打断染色体采用部分酶切或随机切割的方法来打断染色体DNADNA，以保证克，以保证克隆的随机性，使包装每段基因组隆的随机性，使包装每段基因组DNADNA在文库中出现的频率均等。在文库中出现的频率均等。一、原核生物基因组一、原核生物基因组DNADNA的提取的提取染色体DNA质粒DNA要求：制备的DNA的长度为100-200kb，防止在制备过程中的机械断裂二、基因组二、基因组DNADNA的不完全酶切的不完全酶切1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/10242、分

9、离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因族：99%对于人-珠蛋白基因的例子，N值应是： N =（0.99）/1 -（ 1.5 100 / 3106 ） = 9.2 106基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系例：期望值为例：期望值为0.99，插入片断为，插入片断为20kb的的 E.coli (4.6106 bp) 和和 human (3109 bp) 基因组基因组的克隆数的计算。的克隆数的计算。364.101 . 1)106 . 4/102(1ln)99. 01ln(coliEN594109 . 6)103/102(1

10、ln)99. 01ln(humanN三、酶切片段与克隆载体连接三、酶切片段与克隆载体连接、酶切片段的分离与纯化、酶切片段的分离与纯化低熔点琼脂糖回收目的片段试剂盒回收目的片段2 2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为10kb)载体可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为15 kb)Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有效的范围为1同聚物加尾法：同聚物加尾法：cDNAcDNA和载体末端添加同聚物和载体末端添加同聚物质粒质粒载体载体酶切酶切CTGACGGACGTC加同聚物尾加同聚物尾CT

11、GACGGGGGGGGGGGGACGTC双链双链cDNA加同聚物尾加同聚物尾CCCCCCCCCC连接连接转化转化2 2 接头法：在接头法：在cDNAcDNA末端添加含有限制性内切酶位点的接头末端添加含有限制性内切酶位点的接头质粒质粒载体载体酶切酶切CTGACGGACGTC双链双链cDNA加接头加接头GACTGCTGACACGTCTGCAG连接连接酶切酶切CGACTGTGCAGC转化转化3 3 衔接头法：特殊的接头，一端可以和衔接头法：特殊的接头，一端可以和cDNAcDNA平末端连接，另一端可以直接和酶切后平末端连接，另一端可以直接和酶切后的载体粘末端结合。的载体粘末端结合。质粒质粒载体载体酶切

12、酶切CTGACGGACGTC双链双链cDNA加接头加接头连接连接TCGACAGCTGACTGTGCAGTCGCCAGCG转化转化基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组DNA文库的优点基因组DNA文库包括了基因组的全部信息，如间隔序列、非转录区段序列等，能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。CDNA文库的优点cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。cDNA文库的筛选比较简单易行。cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。基因组文库和基因组文库和c

13、DNAcDNA文库的扩增和保存文库的扩增和保存保存保存-80度度转印转印NC膜膜噬菌体噬菌体123混合菌液混合菌落第七章第七章 目的基因的获取目的基因的获取生物科学与技术学院生物科学与技术学院n基因工程或基因工程或DNADNA重组技术的目的是从生物体基因组中分离克重组技术的目的是从生物体基因组中分离克隆目的基因。隆目的基因。n目的基因获得之后，通过基因工程要完成：目的基因获得之后，通过基因工程要完成：1、确定其表达调控机制和生物学功能2、建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌3、将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。n目的基因的克

14、隆战略分为两大类：目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。n目的基因用途很广，主要有以下几个方面：目的基因用途很广，主要有以下几个方面：研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。研究生物种系进化与相关同源性。应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。在农、林、牧、副、渔

15、业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。目的基因的获取目的基因的获取对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。分离的基因分离的基因promoter or terminatorpromoter or terminator编码区：只分离编码区：只分离ORFORF操纵子：启动子、功能相关的编码基因和终止子操纵

16、子：启动子、功能相关的编码基因和终止子有功能的基因：启动区、编码区和终止区有功能的基因：启动区、编码区和终止区目的基因的分离和获取目的基因的分离和获取是基因工程研究和应用的关键内容是基因工程研究和应用的关键内容不同基因组类型的不同基因组类型的基因组大小基因组大小、基因组成基因组成和和基因排列基因排列各不相同各不相同根据不同的实验要求，采用不同的途径和方法分离目的基因。根据不同的实验要求，采用不同的途径和方法分离目的基因。直接分离法直接分离法化学合成法化学合成法聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）分离法）分离法基于基因文库的分离法基于基因文库的分离法直接分离法（1 1）限制性核酸内切酶

17、酶切分离法）限制性核酸内切酶酶切分离法对已知序列的DNA分子；对已知定位的目的基因；其它DNA分子可与基因组文库相结合；缺点：该方法适于从基因组简单的生物体中分离目的基因，如病毒等（2 2）物理化学法）物理化学法根据基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等的差异，从生物基因组中分离目的基因。密度梯度离心法单链酶解法分子杂交法物理化学法物理化学法-密度梯度离心法：密度梯度离心法：其原理是GC含量高DNA片段的浮力密度较高，而富含AT的DNA片段的浮力密度低，利用密度梯度超速离心技术可以分离GC含量较高的目的基因片段。海胆基因组海胆基因组DNAGC含量含量63%的的rDNAR

18、E酶切酶切离心离心方射性标记方射性标记 mRNA 杂交杂交分离分离rRNA基因基因物理化学法物理化学法-单链酶解法：单链酶解法：DNA分子中某基因片段GC碱基含量高，则其热稳定性高，即其解链温度（Tm）值就高。因此可通过控制解链温度使富A=T区变性解链，而富GC区的DNA的片段不变性解链。然后通过S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA。GC63%rDNAGC63%rDNATm1Tm1Tm2Tm2Tm3Tm3Tm2Tm2：9797S1S1酶切酶切得到得到rDNArDNA1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪

19、氨酸tRNA基因的论文。化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有：1、磷酸二酯法2、磷酸三酯法3、亚磷酸液三酯法具体操作过程又有液相合成液相合成和固相合成固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的化学合成法固相磷酸三酯合成过程DNA合成仪（1）戊糖上5羟基被DMT保护，3磷酸基团其中一个单价的羟基被对氯苯保护，此外与固相支持物结合。（2）三氯乙酸处理，5羟基上DMT脱落，暴

20、漏5羟基。（3）合成DNA的原料与活化剂四氮唑混合，得到反应活性很高的核苷亚磷酸活化中间体（其3端被活化，5-羟基的仍然被DMT保护），与固定在支持物上的核苷酸的5-羟基发生缩合反应。（4）缩合反应中可能极少数5-羟基没有参加反应，带帽反应中使用乙酸酐和1-甲基咪唑使这些核苷5-羟基反应形成酰，终止其继续发生反应而成为短片段，这种短片段在纯化时分离掉；化学合成DNA片断的组装化学合成的DNA片断一般在200bp以内。长片段的化学合成方法：1、互补连接法：、互补连接法：预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。T4 DNA连接酶将不同的互补片段连接。T4 DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5-OH磷酸化完整的DNA双链2. 互补延伸连接法互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。355353T4DNA连接酶Klenow片段引物PCR扩增获得目的基因PCR 可以把 数量放大染色体PCR 基因放大连琐反应基因文库、CDNA文库获取目的基因大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆