电泳技术生化实验

1、Electrophoresis Theory ,Methods and Aplications第十八第十八 电泳技术电泳技术电泳的概念电泳的概念 电泳是指荷电的胶体颗电泳是指荷电的胶体颗粒在电场中的移动。粒在电场中的移动。 电泳技术的高度特异性，电泳技术的高度特异性，使混合物可以进行电泳使混合物可以进行电泳分析。甚至结晶纯化的分析。甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电分出两条带或更多的电泳带。泳带。 电泳方法的温和性，对电泳方法的温和性，对不稳定的生物大分子的不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、离技术如沉淀法、

2、离心、层析等更为方便，可靠，层析等更为方便，可靠，甚至可作为具有一定规甚至可作为具有一定规模的制备方法模的制备方法.第一节 基本原理 生物大分子如蛋白质、核酸、生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介中，它们的净电荷取决于介质的质的 H H浓度或与其它大分浓度或与其它大分子的相互作用。在电场中，子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即称的符号，这种迁移现象即称为电泳。为电泳。影响电泳速度的相关因素FE q V=1.1. 带电颗粒在电

3、场中泳动的速度和带电颗粒带电颗粒在电场中泳动的速度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径和介质的净电荷量成正比，与颗粒的半径和介质粘度成反比。粘度成反比。2.2. 电场强度电场强度 E E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈高，带电颗粒的泳动速度愈快，反之亦然。愈快，反之亦然。3.3. 溶液的溶液的 PH PH 偏离分子的等电点愈远，觧离偏离分子的等电点愈远，觧离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快。离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快。离子强度加大，电流加大，泳动速度加快。子强度加大，电流加大，泳动速度加快。f E q -SO4-SO4-SO4-SO4COO-Na+Na+吸附的反离子吸附的反离子固定基团

4、5.焦耳热：电场强度或电极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，焦耳热：电场强度或电极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，不仅降低分辨率，即电泳谱带的展宽和组分的热混和；严重时甚至不仅降低分辨率，即电泳谱带的展宽和组分的热混和；严重时甚至烧断或熔化支持介质。烧断或熔化支持介质。6.6.筛孔：人为控制电泳介质的有效筛孔。根据要求调节、控制、基筛孔：人为控制电泳介质的有效筛孔。根据要求调节、控制、基质中交联剂的浓度或筛孔的大小，影响颗粒移动的速度。质中交联剂的浓度或筛孔的大小，影响颗粒移动的速度。4.电渗：支持物周围的离子层在电场作用下移动。是支电渗：支持物周围的离子层在电场作用下移动。是支持物本身

5、所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。生物大分子迁移的方式生物大分子迁移的方式1. 分子的尺寸大小和形状；分子的尺寸大小和形状；2. 分子带电荷的性质与量；分子带电荷的性质与量；3. 分子的生物学与化学特性。分子的生物学与化学特性。电泳的基本分类电泳的基本分类1.移动界面电泳移动界面电泳 moving boundary electro.2.区带电泳区带电泳 zone electrophoresis3.稳态电泳稳态电泳 steady state electrophor

6、esis 界面移动电泳界面移动电泳: : 在界面移动在界面移动电泳仪的中间漏斗装上待测电泳仪的中间漏斗装上待测溶胶，溶胶，U U型管上端装电极，底型管上端装电极，底部两个活塞的内径与管径相部两个活塞的内径与管径相同。同。 实验开始时，打开活塞，实验开始时，打开活塞，使溶胶进入使溶胶进入U U型管，使两壁液型管，使两壁液面等高。接通电源，小心打面等高。接通电源，小心打开活塞，观察液面开活塞，观察液面 的变化。的变化。根据通电时间和液面升高或根据通电时间和液面升高或下降的刻度，计算电泳速度。下降的刻度，计算电泳速度。若是无色溶胶，用紫外吸收若是无色溶胶，用紫外吸收或其它光学方法读出液面的或其它光学

7、方法读出液面的变化，变化， 区带电泳区带电泳: : 区带电泳是将惰性的固区带电泳是将惰性的固体或凝胶作支持物，在其上面进行体或凝胶作支持物，在其上面进行电泳，而将电泳速度不同的各组成电泳，而将电泳速度不同的各组成分离。区带电泳实验简便易行，分分离。区带电泳实验简便易行，分离效率高，样品用量少，是分析和离效率高，样品用量少，是分析和分离蛋白质的基本方法。分离蛋白质的基本方法。 用滤纸用滤纸作为载体的称为纸上电泳作为载体的称为纸上电泳, ,聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳, ,琼脂糖凝胶电泳等琼脂糖凝胶电泳等. .各组分即以不同速度沿载体运动，各组分即以不同速度沿载体运动，经一经一 段时间后，

8、形成距起点不同段时间后，形成距起点不同距离的区带，区带等于样品中的组距离的区带，区带等于样品中的组分数。再用适当方法，进行分析。分数。再用适当方法，进行分析。 第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis)一一. .原理原理 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。 由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子混由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如电荷、合物，而且可以研究生物大分子的特性；如电荷、分子量、等电点及分子构型。分子量、等电点及分

9、子构型。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个优点；聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个优点；A A：可以在天然状态分离生物大分子；：可以在天然状态分离生物大分子；B:B:可以分析蛋白质与别的生物分子的混合物；可以分析蛋白质与别的生物分子的混合物；C:C:电泳分离后仍然保持生物活性。电泳分离后仍然保持生物活性。+蛋白质分子在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素蛋白质分子在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素蛋白质的电荷量起主要作用蛋白质的电荷量起主要作用蛋白质的分子大小起主要作用蛋白质的分子大小起主要作用蛋白质分子的构形起主要作用蛋白质分子的构形起主要作用1.聚丙烯酰胺凝胶的合成聚丙烯酰胺凝胶的合成丙稀酰胺丙稀酰胺N,N

10、-N,N-甲基双丙稀甲基双丙稀酰胺酰胺聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶催化剂催化剂聚合反应聚合反应聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构烯溶液烯溶液浓溶液浓溶液 交联剂交联剂 凝胶凝胶 结点结点T= X100%a+bmC= x100ba+bC=6.5-0.3T2.2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素聚丙烯酰胺的聚合及影响因素 化学聚合：以过硫酸铵化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺为催化剂，以四甲级乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。连锁反应形成网状的聚合物。 丙稀酰胺由过硫酸铵丙

11、稀酰胺由过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自由在碱性条件下产生游离氧自由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH 时，时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率减慢。减慢。 在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在25 聚合的凝胶则较透明和有弹性。聚合的凝胶则较透明和有弹性。 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵使过硫酸铵（AP）分解。故在做胶后常要用水进行封闭；分解

12、。故在做胶后常要用水进行封闭； 金属离子也干扰凝胶的化学聚合。金属离子也干扰凝胶的化学聚合。光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下, ,分解成无分解成无色的还原型，在少量的色的还原型，在少量的O2条件下，还原型的核黄素氧化条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。成有游离基的黄素环，聚合反应发生。 用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；故常用于用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；故常用于样品胶的聚合；样品胶的聚合； 聚合的时间可以自由控制聚合的时间可以自由控制 缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好；缺点：光照的量不容易掌握，重

13、现性不太好； 光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合各种凝胶光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合各种凝胶的聚合。的聚合。核黄素B1 还原型 游离基 聚合反应光照光照O23.聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径和分子筛效应聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径和分子筛效应 凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。把扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。 大分子在凝胶中的分离是受其电荷、尺寸、和形状因素的影响大分子在凝胶中的分离是受其电荷、尺寸、和形状因素的影响 凝胶的这种用于分离不同尺寸分

14、子的特性是由于它的尺寸筛分能凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力力（Size sieving capacity），故将此现象称为分子筛效应，故将此现象称为分子筛效应（Molecular sieving effect）. 有效孔径取决于凝胶的总浓度有效孔径取决于凝胶的总浓度 T，孔径随着孔径随着 T% 的增加而减的增加而减小小。 甲基双丙稀酰胺的浓度为甲基双丙稀酰胺的浓度为5%5%时，有效孔径最小；时，有效孔径最小；T= 5%时，甲时，甲基双丙稀酰胺的浓度为基双丙稀酰胺的浓度为5%时，孔径为时，孔径为20nm。 T T是凝胶溶质的总百分浓度，是凝胶溶质的总百分浓度，C C是

15、与总浓度相关的交联百分浓度。是与总浓度相关的交联百分浓度。故故T T是决定是决定C C，分离物的分子量的大小又决定了，分离物的分子量的大小又决定了T T的浓度。的浓度。 5 7 9 11 13 15 T%A B凝胶浓度凝胶浓度T对样品迁移率的影响对样品迁移率的影响例：混合蛋白质例：混合蛋白质A,BA,B，A A分子量较小，分子量较小，B B分子带电荷较多，分子带电荷较多，T T5 5时，电泳行为主要以电荷起作用，时，电泳行为主要以电荷起作用，B B 迁移速度快。当迁移速度快。当 T T 增加，分子筛效应增加，增加，分子筛效应增加，B B的迁移速度减慢；的迁移速度减慢；T T 9 9 时，时，A

16、 A，B B的迁移率相同，不能分开，的迁移率相同，不能分开，T T 再增加，凝胶孔径更小，再增加，凝胶孔径更小，A A分子比分子比B B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。迁移率迁移率异常样本异常样本:快快Hb(HbH,HbJ) 慢慢Hb (HbG,HbI,HbE二二.仪器的进展仪器的进展 电泳槽是凝胶电泳的核心电泳槽是凝胶电泳的核心部分，所以变化主要是电部分，所以变化主要是电泳槽的变革。泳槽的变革。水平板状水平板状垂直的滤纸条垂直的滤纸条滤纸连接的滤纸连接的水平

17、凝胶水平凝胶园盘电泳槽园盘电泳槽垂直夹心板状垂直夹心板状三三. .不连续凝胶电泳（不连续凝胶电泳（discdisc）的分离原理）的分离原理(一一).原理原理不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的 电荷效应电荷效应，还具有，还具有浓缩效应浓缩效应与与分子筛效应分子筛效应，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密分子量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时度有差

18、别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。亦可分离。 碱性不连续分离酸性样品碱性不连续分离酸性样品不连续凝胶电泳系统不连续凝胶电泳系统 酸性不连续分离碱性样品酸性不连续分离碱性样品 大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。. .浓缩效应浓缩效应 1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（烯）（烯） T T5 5，分离胶一般为小，分离胶一般为小孔径（浓）孔径（浓）T T7.57.5。样品在较烯。样品在较烯的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时，的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时，便形成一道栅

19、栏，所有的样品分子便形成一道栅栏，所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得到到浓缩浓缩，然后，再，然后，再依依据分子量的大据分子量的大小进行小进行筛分筛分电泳分离。电泳分离。 2.2.缓冲液的组成缓冲液的组成: :图示。图示。PHPH系统的系统的不连续，各种分子的不连续，各种分子的电荷电荷之间的差之间的差异进行分离。异进行分离。 3.3.缓冲体系的不连续，其中各组成缓冲体系的不连续，其中各组成的离子、反离子迁移快慢的差别是的离子、反离子迁移快慢的差别是影响样品浓缩效应的重要因素。影响样品浓缩效应的重要因素。 4.4.离子的迁移速率及浓度的不连续离子的迁移速率及

20、浓度的不连续又造成电场强度与电导率的变化。又造成电场强度与电导率的变化。分子筛效应分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和分离移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的胶界面时，凝胶的PHPH变化明变化明显，缓冲液中甘氨酸的觧离显，缓冲液中甘氨酸的觧离迅速增加，直至迅速增加，直至50%50%觧离成觧离成 Gly-,-,其分子量小，迁移超其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和电压梯度和PH PH 值中泳动，值中泳动，依其分子量

21、的大小而分开。依其分子量的大小而分开。电荷效应电荷效应 蛋白质所带的净电的蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子性质和电荷量与分子的迁移率的关系，在的迁移率的关系，在同一电场强度中，在同一电场强度中，在单位时间内各分子迁单位时间内各分子迁移的距离的差别而到移的距离的差别而到达分离。达分离。（二）（二）. .操作操作1.垂直柱状，板状的垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系不连续凝胶电泳系统的组成和配制；统的组成和配制；2.均一凝胶与梯度凝均一凝胶与梯度凝胶配制；胶配制；3.电极缓冲液系统；电极缓冲液系统；4.样品的准备；样品的准备；5.加样要求加样要求6.电泳电泳7.检测检测PH 8.3PH 6.7P

22、H 8.9PH 8.3 垂直柱状，板状的垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系不连续凝胶电泳系统的组成和配制统的组成和配制均一凝胶与梯度凝胶配制均一凝胶与梯度凝胶配制连续均一凝胶电泳效果连续均一凝胶电泳效果不连续均一凝胶电泳效果不连续均一凝胶电泳效果不连续梯度凝胶电泳效果不连续梯度凝胶电泳效果均一凝胶是指整块凝胶为同一均一凝胶是指整块凝胶为同一浓度或者分离胶为均一浓度的浓度或者分离胶为均一浓度的凝胶。凝胶。梯度胶是指分离胶由一定的浓梯度胶是指分离胶由一定的浓度组成，一般是线性梯度，通度组成，一般是线性梯度，通常从阴极至阳间，梯度浓度逐常从阴极至阳间，梯度浓度逐渐加大，孔径变小，利用分子渐加大，孔径变

23、小，利用分子筛作用提高分辨率，适合复杂筛作用提高分辨率，适合复杂样品的分离。样品的分离。缓冲液系统缓冲液系统 浓缩凝胶缓冲液浓缩凝胶缓冲液0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 分离凝胶缓冲液分离凝胶缓冲液1.5mol/L Tris-HCl,PH8.9 电极缓冲液系统电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷）（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨甘氨酸酸) PH8.3 样品缓冲液样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、甘油、0.05mg/ml溴酚蓝溴酚蓝 样品缓冲液的要求：样品缓冲液的要求： 选择合适的选择合适的P

24、H与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。PH 8.3PH 6.7PH 8.9PH 8.3不连续电泳浓缩胶和分离胶的配方不连续电泳浓缩胶和分离胶的配方 贮存液贮存液 凝胶终浓度凝胶终浓度T 4% 7.5% 10% 15% 20% 单体贮液（单体贮液（14.55:0.55） 0.65 3.8 5.0 7.5 10浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液(ml) 0.1 0 0 0 0分离胶缓冲液分离胶缓冲液(ml) 0 0.3 0.3 0.3 0.3dd H2O(ml) 4.25 10.9

25、 9.7 7.2 4.7真空抽气真空抽气10%AP(过硫酸铵过硫酸铵) (ul) 5 15 15 15 15TEMED四甲基乙二胺四甲基乙二胺(ul) 2.5 7 7 7 7总体积总体积 5ml 15ml标准蛋白质样品标准蛋白质样品标准蛋白质样品：是一组（标准蛋白质样品：是一组（5 57 7种）已知的合适的分子量范围的、种）已知的合适的分子量范围的、构形相近的一套蛋白质，溶解在构形相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。样品缓冲液中备用。样品的浓度样品的浓度分析目的、检测方法和样品的组分析目的、检测方法和样品的组成是关键；成是关键；未知样品浓度：未知样品浓度： 0.10.120mg/ml20

26、mg/ml考玛斯亮篮染色：考玛斯亮篮染色： 1 12mg/ml2mg/ml银银 染染 色色 : 0.02: 0.020.2mg/ml0.2mg/ml 高纯度样品：高纯度样品： 0.50.52mg/ml2mg/ml加样加样电泳电泳 光吸收光吸收检测检测 考玛斯亮篮染色考玛斯亮篮染色 染色染色 银银 染染 色色 第三节第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，主十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，主要用于测定要用于测定蛋白质亚基的分子量蛋白质亚基的分子量。强还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇能使半光氨酸强还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇能使半光氨酸

27、残基之间的二硫键断裂。残基之间的二硫键断裂。 是目前用于测定蛋白质亚基的分子量的一种最好是目前用于测定蛋白质亚基的分子量的一种最好的方法。的方法。 在蛋白质样品和凝胶中加入在蛋白质样品和凝胶中加入SDSSDS和还原剂后分子被解聚成多肽链，它们与和还原剂后分子被解聚成多肽链，它们与SDSSDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质SDSSDS复合物胶束，所带的电荷大大超复合物胶束，所带的电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子原有的电荷差异。电泳的迁移率不过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子原有的电荷差异。电泳的迁移率不再受电荷的影响，而只与蛋白质或亚基的分子量大小有

28、关。再受电荷的影响，而只与蛋白质或亚基的分子量大小有关。SDS-PAGESDS-PAGE的几种方式的几种方式影响影响SDS-SDS-蛋白质蛋白质结合的因素结合的因素1.溶液中溶液中SDSSDS单单体的浓度体的浓度2.样品缓冲液的样品缓冲液的离子强度离子强度3.二硫键是否二硫键是否完全被还原完全被还原操操 作作SDSSDS凝胶电泳扫描与染色图谱凝胶电泳扫描与染色图谱 蛋白质分子的电泳迁蛋白质分子的电泳迁移率与分子量的计算移率与分子量的计算蛋白质分子量的计算蛋白质分子量的计算1.1.要求一组标准蛋白质，其分子要求一组标准蛋白质，其分子量应包含欲测分子的大小；量应包含欲测分子的大小；2.2.欲测分子

29、的性质欲构形与标准欲测分子的性质欲构形与标准分子类似；分子类似；3.3.标准蛋白与被测分子在同一块标准蛋白与被测分子在同一块凝胶上电泳。并绘制标准曲线。凝胶上电泳。并绘制标准曲线。电泳过程中不正常现象电泳过程中不正常现象 纹理现象纹理现象 拖尾现象拖尾现象 蛋白带歪斜现象蛋白带歪斜现象 微笑与皱眉现象微笑与皱眉现象 蛋白带过宽，邻近泳道蛋白带过宽，邻近泳道 相连的现象。相连的现象。微笑与皱眉微笑与皱眉第四节第四节 等电点聚焦等电点聚焦-在在PH梯度中的电泳梯度中的电泳 利用蛋白质分子和其它两性分子的等电点不同，利用蛋白质分子和其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的在一个稳定的、

30、连续的、线性的PH梯度中进行蛋梯度中进行蛋白质的分离和分析。白质的分离和分析。 等电点聚焦技术分析的对象只限于蛋白质和两性等电点聚焦技术分析的对象只限于蛋白质和两性分子。分子。 利用载体两性电解质在通电的条件下，能够形成利用载体两性电解质在通电的条件下，能够形成连续的、线性的连续的、线性的PH梯度，但拆除电源后梯度，但拆除电源后PHPH梯度消梯度消失，因此在聚丙烯酰胺凝胶中加入载体两性电解失，因此在聚丙烯酰胺凝胶中加入载体两性电解质变可形成稳定的质变可形成稳定的PHPH梯度，通过电泳进行蛋白质梯度，通过电泳进行蛋白质的分离和分析。的分离和分析。-+两性电解两性电解质载体质载体样品的加入样品的加

31、入接通电源，接通电源，开始聚焦开始聚焦聚焦完成聚焦完成蛋白质的等电点蛋白质的等电点等电点的聚焦效应等电点的聚焦效应等电点聚焦的分辨率等电点聚焦的分辨率载体两性电解质和载体两性电解质和PHPH梯度范围的选择梯度范围的选择载体两性电解质的特点载体两性电解质的特点1.1.分子量小；分子量小；2.2.可溶性好；可溶性好；3.3.缓冲能力强；缓冲能力强；4.4.电导性均匀；电导性均匀；5.5.紫外吸收低，不发荧光；紫外吸收低，不发荧光；6.6.容易从聚焦的蛋白带中除去；容易从聚焦的蛋白带中除去；7.7.无毒、无生物学效应。无毒、无生物学效应。操 作1. .凝胶制备系统用凝胶制备系统用H H2 2O O配

32、制（不含缓冲系统配制（不含缓冲系统）；并含载体两并含载体两性电解质性电解质；2.样品不含盐；样品可以加在凝胶的任何部位，或与凝胶样品不含盐；样品可以加在凝胶的任何部位，或与凝胶一起聚合；一起聚合；3.3.电极溶液是单一的酸和碱分别为阳极与阴极；电极溶液是单一的酸和碱分别为阳极与阴极；4 4. .聚焦时，电泳为稳压，聚焦时间在聚焦时，电泳为稳压，聚焦时间在4 4小时以上，随着时间小时以上，随着时间的延长，聚焦效果愈好；聚焦完成时，电流趋近于的延长，聚焦效果愈好；聚焦完成时，电流趋近于0 0。而。而一般的电泳是随着时间的延长，电泳带有扩散效应。一般的电泳是随着时间的延长，电泳带有扩散效应。5 5.

33、PH .PH 梯度的测定及绘制梯度的测定及绘制PHPH曲线；曲线；6 6. .固定染色，对样品等电点的测定。固定染色，对样品等电点的测定。PH梯度对凝胶长度梯度对凝胶长度( (cm)的关系的关系序号序号123456789101112131415cm0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5PH4.04.24.44.64.85.05.25.45.65.86.06.26.46.66.8电泳方法的比较电泳方法的比较电泳方法 PAGEDISCSDS-PAGEIEF特征以电荷为主；以电荷为主；以分子量为主；以分子量为主；样品的结构特样品的结构特征。征。不连

34、续的凝胶浓不连续的凝胶浓度；不连续的缓度；不连续的缓冲系统；不连续冲系统；不连续的的PH；不同的；不同的离子强度离子强度阴离子去污阴离子去污剂还原剂剂还原剂使蛋白质聚使蛋白质聚集体解开集体解开两性电解两性电解质载体质载体浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应结果分析的蛋白分析的蛋白质有活性质有活性分析的蛋白分析的蛋白质有活性质有活性测定蛋白质测定蛋白质亚基的分子亚基的分子量（变性）量（变性）测定蛋白质测定蛋白质的等电点的等电点第五节第五节.双向电泳双向电泳 生物体中蛋白质的数量与其功能的复杂性密生物体中蛋白质的数量与其功能的复杂性密切相关，在大肠杆菌中有切相关，在大肠杆菌中有54

35、54种不同的蛋白质，而种不同的蛋白质，而在典型的人类细胞中，可表达的基因约在典型的人类细胞中，可表达的基因约50005000个个; ;同同时各种蛋白质的含量存在巨大的差异，从时各种蛋白质的含量存在巨大的差异，从1010 0.0010.001 总蛋白量，因此对纯化、鉴定的要求总蛋白量，因此对纯化、鉴定的要求必须是必须是高分辨，高效率高分辨，高效率及及速度快速度快。 以前介绍的方法技术中唯一能到达上述要求以前介绍的方法技术中唯一能到达上述要求的是高效液相色谱，但由于仪器的昂贵以及需要的是高效液相色谱，但由于仪器的昂贵以及需要标准品，技术操作员的专业知识等受到限制。因标准品，技术操作员的专业知识等受

36、到限制。因此此双向电泳技术可以有效的克服这些问题。双向电泳技术可以有效的克服这些问题。基基 本本 原原 理理 传统的单向电泳方法最多只能分析传统的单向电泳方法最多只能分析100 100 余种蛋白质样品，余种蛋白质样品，故不适合分析细胞和亚细胞中蛋白质的混合物。当采用两种故不适合分析细胞和亚细胞中蛋白质的混合物。当采用两种不同原理的电泳程序，就能使分辨率提高几个数量级。不同原理的电泳程序，就能使分辨率提高几个数量级。 利用利用SDS-PAGE及及等电点聚焦等电点聚焦相结合的电泳技术，将组分复相结合的电泳技术，将组分复杂的蛋白质样品在一块凝胶上进行互为垂直的两次电泳，使杂的蛋白质样品在一块凝胶上进

37、行互为垂直的两次电泳，使各组分依其分子量及等电点的差异，以点的形式分步，再配各组分依其分子量及等电点的差异，以点的形式分步，再配以高灵敏度的（银染色或标记法）检测技术，使一块以高灵敏度的（银染色或标记法）检测技术，使一块30X40cm的凝胶是可分辨的凝胶是可分辨10000个蛋白质点及个蛋白质点及110ng的量。的量。 双向电泳图解双向电泳图解操操 作作 双向电泳一般是指第一向为等电点聚焦双向电泳一般是指第一向为等电点聚焦, ,第二向为第二向为梯度梯度SDSSDS电泳电泳. .样品通过电荷和质量的两次分离后样品通过电荷和质量的两次分离后, ,可以得到分子的等电点、分子量等信息可以得到分子的等电点

38、、分子量等信息. .分离的结分离的结果不是带果不是带, ,而是点而是点. .根据坐标系统作图根据坐标系统作图, ,从左到右是从左到右是等电点等电点PIPI的变化的变化( (增加或降低增加或降低),),从上到下是分子量从上到下是分子量的增加的增加. . 这是目前所有电泳技术中分辨率最高这是目前所有电泳技术中分辨率最高, ,信息最信息最多的技术多的技术. .聚丙烯酰胺凝胶电泳在测序方面应用聚丙烯酰胺凝胶电泳在测序方面应用第六节第六节 蛋白质印迹蛋白质印迹（Protein blotting） 蛋白质印迹法是把电泳和层析分离的蛋白质蛋白质印迹法是把电泳和层析分离的蛋白质转移到固定膜上的过程；虽然在转移

39、到固定膜上的过程；虽然在PAGE对蛋对蛋白质有很好的分离效果及良好的分辨率而广白质有很好的分离效果及良好的分辨率而广泛应用，但进一步的分析受到限制。即探针泛应用，但进一步的分析受到限制。即探针分子很难通过凝胶的网孔而达到与嵌和在凝分子很难通过凝胶的网孔而达到与嵌和在凝胶中的目标蛋白质进行特异性结合或检测。胶中的目标蛋白质进行特异性结合或检测。通过转移后，二者的结合变得容易，并且可通过转移后，二者的结合变得容易，并且可以进行多种分析，因此在免疫检测中是非常以进行多种分析，因此在免疫检测中是非常重要的手段。重要的手段。操作步骤操作步骤1.SDS电泳的蛋白质；电泳的蛋白质；2.蛋白质样品直接点样蛋白

40、质样品直接点样 转转 膜膜（PVDF聚偏氟聚偏氟乙烯膜）乙烯膜）封闭硝酸纤维素膜，防止封闭硝酸纤维素膜，防止蛋白质的非特异性结合蛋白质的非特异性结合 封封 阻（淬灭）阻（淬灭）抗原、抗体的抗原、抗体的特异性反应特异性反应 反反 应应 标记的抗体与低物标记的抗体与低物的显色反应的显色反应 显显 色色定量、定性分析定量、定性分析 检测分析检测分析基基 本本 慨慨 念念1.探针：用化学方法将有识别能探针：用化学方法将有识别能力的物质（抗原，激素，核酸力的物质（抗原，激素，核酸等）和酶或同位素或荧光物质等）和酶或同位素或荧光物质结合成的复合物的通称。结合成的复合物的通称。2.固相载体：硝酸纤维素膜，尼

41、固相载体：硝酸纤维素膜，尼龙膜等。龙膜等。3.淬灭（封阻）：与印迹的成份淬灭（封阻）：与印迹的成份亲缘关系很远的，不与待测物亲缘关系很远的，不与待测物起反应的，将印迹区域以外全起反应的，将印迹区域以外全部吸附的物质。使探针除了与部吸附的物质。使探针除了与印迹物结合，再无其他结合的印迹物结合，再无其他结合的地方。背景干净，反应清晰。地方。背景干净，反应清晰。4.印迹：凝胶电泳后的组分，通过印迹：凝胶电泳后的组分，通过吸附或电转移，也可直接点样吸附或电转移，也可直接点样品到固相膜上。品到固相膜上。 抗原抗体的特异性反应抗原抗体的特异性反应2.二抗体二抗体上结合酶上结合酶二抗体二抗体上结合胶上结合胶

42、体金颗粒体金颗粒3.生物素标生物素标记二抗体记二抗体1.抗体上抗体上结合酶结合酶抗生物素朊抗生物素朊生物素应用例应用例3. 豚鼠血清豚鼠血清 兔兔 血清血清 兔抗豚鼠抗体（二抗体）兔抗豚鼠抗体（二抗体） 标记二抗体标记二抗体 病毒病毒 豚鼠豚鼠 血清血清 抗体（一抗体）抗体（一抗体）2.病毒病毒 SDS-PAGE 转膜（抗原）转膜（抗原） 封闭封闭显色反应：染色、放射自显影显色反应：染色、放射自显影点印迹的暴光点印迹的暴光点的颜色深浅显示样品的定量结果点的颜色深浅显示样品的定量结果应用方面应用方面 定性研究：确定病毒的哪定性研究：确定病毒的哪些结构蛋白起到抗原的作些结构蛋白起到抗原的作用；用；

43、 定量分析：测定抗体的效定量分析：测定抗体的效价。价。第七节第七节 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳适用小分子聚丙烯酰胺凝胶电泳适用小分子DNADNA（5 5500 bp500 bp）的分）的分离，琼脂糖凝胶适用离，琼脂糖凝胶适用20020050 Kb DNA50 Kb DNA片段的分离。片段的分离。 琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物, ,为白色的小颗为白色的小颗粒或粉末状粒或粉末状, ,在水中加热在水中加热90-100 3-590-100 3-5分钟融化成清亮的分钟融化成清亮的液态液态. .其凝固点约其凝固点约 45 .45 .并且可以根据

44、需要配制一定的并且可以根据需要配制一定的浓度浓度. .原理原理: :1.1.线状双链线状双链 DNADNA在一定浓度琼脂糖凝胶中的泳动距离与分在一定浓度琼脂糖凝胶中的泳动距离与分子量的对数成反比子量的对数成反比; ;2.2.不同的凝胶浓度分离不同的凝胶浓度分离DNADNA片段有不同的有效范围片段有不同的有效范围; ;3.3.具有相同分子量具有相同分子量, ,不同构型的不同构型的DNADNA以不同的速率通过凝胶以不同的速率通过凝胶: :闭环闭环(型型)开环开环(型型)线型线型(型型););4.4.在低电压时在低电压时, ,线状线状DNADNA片段的迁移率与所用的电压呈正比片段的迁移率与所用的电压

45、呈正比关系关系; ;5.5.在变性条件电泳时在变性条件电泳时, ,核酸的二级结构打开核酸的二级结构打开, ,不论不论DNADNA或或RNARNA分子均以单链形式迁移分子均以单链形式迁移, ,其迁移率与分子量直接相关其迁移率与分子量直接相关. .琼脂糖的种类琼脂糖的种类1.1. 高纯度或超纯琼脂糖高纯度或超纯琼脂糖: :应用回收的应用回收的DNADNA进行进行克隆克隆, ,酶切酶切, ,标记等标记等; ;2.2. 低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖(65)(65):保持回收凝胶中的保持回收凝胶中的样品的稳定性与活性样品的稳定性与活性; ;3.3. 高强度琼脂糖高强度琼脂糖: :进行大分子的分离或低于进行大

46、分子的分离或低于0.5%0.5%时采用时采用; ;4.4. 高筛分琼脂糖高筛分琼脂糖: :主要分离主要分离100-1200bp100-1200bp的小的小片段片段DNA,DNA,对相差对相差4 4个碱基的个碱基的DNADNA可以分辨可以分辨. .不同浓度琼脂糖的不同浓度琼脂糖的凝胶的浓度凝胶的浓度(%wv)dsDNA片段的分离范围片段的分离范围(kb) 0.35-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2缓冲液系统缓冲液系统1.电极缓冲液电极缓冲液:TAE 0.04molL Tris-乙酸乙酸,0.001mol

47、L EDTA,PH8.0TBE 0.045molL Tris-硼酸硼酸,0.001mol L EDTA,PH8.0 TPE 0.09molL Tris-磷酸磷酸,0.002mol L EDTA,PH8.02.加样缓冲液加样缓冲液: (6x)0.25%溴酚蓝溴酚蓝+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+40%(w v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液;0.25%溴酚蓝溴酚蓝+40%(w v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液;0.25%溴酚蓝溴酚蓝+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+15%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液;0.25%溴酚蓝溴酚蓝+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+0.4%哑叮橙哑叮橙+30%甘油水甘油水溶液溶液;(不宜用于

48、不宜用于TBE系统系统) (二甲苯青二甲苯青)-天蓝天蓝-4kb (溴酚蓝溴酚蓝)-兰色兰色-300bp (哑叮橙哑叮橙)-黄色黄色-50bp核酸的染色核酸的染色 凝胶中的核酸经染色后再进行观察与牌照记录凝胶中的核酸经染色后再进行观察与牌照记录. .溴乙锭溴乙锭(EB)(EB)能能嵌入嵌入DNADNA碱基碱基, ,在紫外光激发呈现橙红色荧光在紫外光激发呈现橙红色荧光. .灵敏度达灵敏度达1-1-10ngDNA.10ngDNA.用非污染性的染料也可进行用非污染性的染料也可进行.(.(Goldview) )染色方法染色方法: :1.1.凝胶在凝胶在1-5ug EB1-5ug EBmlml的水溶液中

49、浸泡的水溶液中浸泡3030分钟分钟; ;2.2.在在0.1%0.1%焦宁的焦宁的0.5%0.5%乙酸乙酸,1mmol,1mmol柠檬酸溶液中浸泡柠檬酸溶液中浸泡; ;3.3.在在0.2%0.2%甲烯蓝的甲烯蓝的0.2mmolNaAc(PH7.4)0.2mmolNaAc(PH7.4)过夜过夜; ;4.4.固定后固定后,0.2%AgNO,0.2%AgNO3 3浸泡浸泡1212分钟分钟, ,漂洗漂洗,1.5%NaOH,1.5%NaOH和和0.4%0.4%甲醛显甲醛显色色,0.75%Na,0.75%Na2 2COCO3 3终止终止. .应应 用用1. 核酸分子片段大小鉴定核酸分子片段大小鉴定;2. 核酸样品浓度的测定核酸样品浓度的测定;毛细管电泳技术简介毛细管电泳技术简介概概 述述 毛细管电泳是一系列以内径毛细管电泳是一系列以内径10-200um10-200um的毛细管为分离的毛细管为分离通道，在高电场强度作用下对小分子和大分子的质量、通道，在高电场强度作用下对小分子和大分子的质量、电荷、淌度（电泳迁移率）进行分离的技术的统称电荷、淌度（电泳迁移率）进