色谱分离理论

1、1色谱分离理论色谱分离理论如何评价色谱分离的好坏？或者说色谱如何评价色谱分离的好坏？或者说色谱分析追求的目标什么？分析追求的目标什么？ 分离度、分析时间、样品量？分离度、分析时间、样品量？2 优化色谱分离的目标是实现混合物的完全分离，涉及到各组分色谱峰之间的相互关系，是一个与热力学和动力学有关的综合性问题。因此文献上提出许多不同的多元混合物色谱分离的优化指标。 3SigtimeSigtimeSigtime在色谱中相邻两组分(“物质对物质对”)的分离分离度度：RttWWttWWrrrr21211221212()()热力学热力学：保留值的差别保留值的差别要足够大要足够大动力学动力学：色谱峰要足够：

2、色谱峰要足够窄窄4 R是色谱中两个组分分离好坏程度的标志。从色谱分析的角度看，只有峰窄而间距大的分离峰窄而间距大的分离是令人满意的。在色谱分析中, 并不是要求R越大越好, 而是追求最佳分离。 对于复杂样品的分析，所有待测组分的分辨率要分辨率要足够大（足够大（ R 2R 2），才能满足定量分析的要求，同时分离过程要尽可能短分离过程要尽可能短，保证痕量分析的灵敏度。这就是色谱优化理论。 对于一个具体的色谱分离，对于一个具体的色谱分离，R值应该多大？值应该多大？5 R作为相邻色谱峰重叠程度的量度, 有如下两种情况： 等高峰 不等高峰 要注意防止“交叉污染”。如h1：h2 = 10 : 1，R = 1

3、.0，A2的纯度由97.72 %降低为88 %。Snyder & Kirkland 标准分离曲线标准分离曲线：峰高比1：1128：1，R为0.41.25的分离图通常用通常用R=1.5R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。作为相邻两组分已完全分离的标志。实际工作实际工作R R要多少？要多少？补充材料补充材料7基本分离方程的推导基本分离方程的推导 对于多组分混合物的分离分析, 通常特别关注最难分离的相邻的色谱峰, 即物质对的分离。由于它们的保留值差别较小, 可合理认为（!）, W1 = W2 = W , 则RNkk222411()() （1） （2） （3） 柱效因子柱效因子 相对分离

4、因子相对分离因子 保留程度因子保留程度因子分辨率公式：RttWWttWWrrrr21211221212()()上式没有直接给出分辨率与色谱基本参数k和N的关系。8初始初始图图8. k、N、 对分离的影响对分离的影响增大增大k增大增大Nt 改变改变 St9（1）理论塔板数 当固定相确定以后, 要使一对组分的分离达到某一个R值, 柱必须具有最低限度的理论塔板数，即最最低柱效低柱效。( (初步实验有人常采用初步实验有人常采用“旧旧”柱子？柱子？) ) 增加N值也可改进分离度, 这意味着选择一根性能优良的色谱柱, 并在最佳化条件下操作。 如何提高色谱柱的柱效？ 增加柱长可以改进分离。但是柱长增加（同时

5、压力增大）, 分析时间也随之增加, 峰宽也随保留时间延长而增加, 因此, 单纯追求长柱不可取。 常规GC和HPLC柱长是多少？为什么？10NRkk2222121611() () 在等温条件下在等温条件下, , 对给定色谱柱对给定色谱柱, k, k和和 为常数为常数, , 分离度决定于理论塔板数。使两组分达到某一分分离度决定于理论塔板数。使两组分达到某一分离度所需的塔板数离度所需的塔板数, , 可由下式计算：可由下式计算： （a a）两色谱峰距离近并）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱叠，这表示选择性和柱效都很差。效都很差。（b b）虽然两峰距离拉开）虽

6、然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但技效低。明选择性好，但技效低。（c c）分离最理想，说明）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。选择性好，柱效也高。 补充材料补充材料2121)(2)(211212wwttwwttRrrrr 可见，单独用柱效柱效或选择性选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引人一个综合性指标分离度R。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标，分离度又叫分辨率。13（2）容量因子RNkk222411()()14nQ则分离方程式为 kkQR1令：根据根据 tr = t0 (1k) ，图中，图中前前段段时间曲线与事实不符！

7、时间曲线与事实不符！ 补充材料补充材料14k0.51.03.05.08.0103050k/(1+k)0.33 0.50 0.75 0.83 0.89 0.91 0.97 0.98 即固定相已选定, 即已定, 为了达到良好分离，适当增大k有利于分离。这体现在两方面： 柱长一定, 在给定操作条件下, N值一定, 此时k越大, k/(1k)也越大, R越大。 分离度一定分离度一定, 如如R = 1.5, k越大越大, 达到该分离度所达到该分离度所需的需的N值越小值越小, 即所需柱子越短。但是即所需柱子越短。但是k不是越大越不是越大越有利。观察以下数据：有利。观察以下数据：15 可见可见, 过大的过大

8、的k(10), 使使k/(1+k)的改变不大的改变不大, 对对R的改进不明显的改进不明显, 反而使保留时间大为延长。反而使保留时间大为延长。 使使k改变的方法有：改变的方法有： 改变柱温（如改变柱温（如GC） 改变流动相性质和组成改变流动相性质和组成(在在LC中中) 改变相比改变相比k0.51.03.05.08.0103050k/(1+k)0.33 0.50 0.750.830.890.910.970.98对于一个具体的色谱分离，对于一个具体的色谱分离，k值应该多大？值应该多大？16（3 3）分离因子）分离因子 是柱选择性的量度。是柱选择性的量度。 越大越大, 柱选择性越好柱选择性越好, 越能

9、越能获得良好分离。从以下一组数据获得良好分离。从以下一组数据, 观察观察 对对R的影响：的影响： 从从1.01增加到增加到1.1, 约增加约增加9 %, 而而R却增加到原来却增加到原来的的9倍倍； 从从1.5增加道增加道2.0, 约增加约增加33 %, 而而R只增加到只增加到原来的原来的1.5倍。倍。1.01.0011.011.11.52.0(-1)/ 00.0010.010.0910.330.50对于色谱分离对于色谱分离， 值应该多大？值应该多大？17结论：结论： 值很小的变化值很小的变化, 可使有较大的变化。可使有较大的变化。 值趋近于值趋近于1时时, 它的改变对的增加它的改变对的增加R尤

10、为显著；尤为显著； 值较大时值较大时, 对对R的影响反而减少。的影响反而减少。 在在k、N、 三个参数中三个参数中, 的增加对分离的改的增加对分离的改进最有效进最有效。k从从1增加增加3, R只增加到原来的只增加到原来的1.5倍。倍。N增加到原来的增加到原来的3倍倍, 而而R只增加到原来的只增加到原来的1.7倍。倍。 从从1.01增加带增加带1.1, 约增加约增加9 %, 而而Rs却增加到原来的却增加到原来的9倍倍。18改变组分的改变组分的 值方法值方法： 改变改变固定相固定相, 使各组分的分配系数有较大差别。使各组分的分配系数有较大差别。例如分离苯和环己烷例如分离苯和环己烷, 若以邻苯二甲酸

11、二壬酯作固定若以邻苯二甲酸二壬酯作固定液液, 值为值为1.5；而以；而以 , -氧二丙腈作固定液氧二丙腈作固定液, 值增值增加至加至6.3。 改变改变柱温柱温。柱温的改变对不同组分的分配系数的。柱温的改变对不同组分的分配系数的影响不同。采用较低柱温影响不同。采用较低柱温, 一般有利于增大一般有利于增大 值。值。 改变流动相的性质和组成。改变流动相的性质和组成。 利用化学衍生法改变利用化学衍生法改变组分的性质组分的性质, 从而改变它们从而改变它们的分配系数。的分配系数。19多组分分离多组分分离 色谱法的最大优点是能对含多组分色谱法的最大优点是能对含多组分( (几十到几百个几十到几百个) )的样品

12、进行分析。的样品进行分析。 若样品只含数个组分若样品只含数个组分, , 且它们的且它们的k k没有很大差别没有很大差别, , 可可通过增加理论塔板数通过增加理论塔板数, , 改变相对保留值和流动相速度改变相对保留值和流动相速度来实现分离。但对于一些复杂情况来实现分离。但对于一些复杂情况, , 采用固定的一组采用固定的一组条件往往难于达到最佳分离。例如条件往往难于达到最佳分离。例如, , 样品含多个样品含多个k k值差别很大组分。在这种情况下值差别很大组分。在这种情况下, , 若若设计等温或等度洗脱实验条件设计等温或等度洗脱实验条件, , 不能达到最佳分离。不能达到最佳分离。 在色谱图上所确定的

13、空间里在色谱图上所确定的空间里, , 要分离的组分太多而要分离的组分太多而容纳不下容纳不下, , 超过色谱图的峰容量。超过色谱图的峰容量。20（a）较低柱温或洗脱强度（b）中等柱温或洗脱强度（c）较高柱温或洗脱强渡不同色谱条件的分离图不同色谱条件的分离图St1 23 45 6Tt21 要解决多组分的分离问题要解决多组分的分离问题, , 必须采用一些必须采用一些特殊的分特殊的分离技术离技术。 如上图，假定在开始分离时如上图，假定在开始分离时, , 采用（采用（a a）的条件）的条件, , 使使组分组分1 1和和2 2在接近在接近k=2k=2的条件下得到快速而良好的分离。的条件下得到快速而良好的分

14、离。接着接着, , 将条件从（将条件从（a a）变到（）变到（b b）, , 使组分使组分3 3和和4 4的的k k值也值也减少至减少至2 2左右左右, , 得到良好分离。最后得到良好分离。最后, , 将条件从（将条件从（b b）改到（改到（c c）, , 使组分使组分5 5和和6 6良好分离。良好分离。 在一般分离过程中在一般分离过程中 , , 峰宽连续增加峰宽连续增加, , 特别在分离后特别在分离后阶段阶段, , 峰容量变小。采用峰容量变小。采用（d d）这种特殊技术后这种特殊技术后, , 谱带谱带宽度在分离过程中维持不变宽度在分离过程中维持不变, , 因而在色谱图的有限空因而在色谱图的有

15、限空间内间内, , 可容纳更多的峰。由于峰变窄可容纳更多的峰。由于峰变窄, , 有利于痕量组有利于痕量组分的检测分的检测, , 而且使分析时间减少。而且使分析时间减少。22柱温 T或Org.%流相强溶剂A%time125程序升温和梯度洗拖曲线程序升温和梯度洗拖曲线23改变改变k的特殊方法的特殊方法： 程序升温程序升温：在分离过程中：在分离过程中, 柱温按预定速率柱温按预定速率, 随时间呈线性随时间呈线性或非线性增加或非线性增加, 以使各组分在最佳柱温下流出色谱柱。程序升以使各组分在最佳柱温下流出色谱柱。程序升温用于气相色谱。温用于气相色谱。 对于宽沸程的多组分混合物，可采用程序升温法，即在分析

16、过程中按一定速度提高柱对于宽沸程的多组分混合物，可采用程序升温法，即在分析过程中按一定速度提高柱温，在程序开始时，柱温较低，低沸点的组分得到分离，中等沸点的组分移动很慢，高温，在程序开始时，柱温较低，低沸点的组分得到分离，中等沸点的组分移动很慢，高沸点的组分还停留于柱口附近；随着温度上升，组分由低沸点到高沸点依次分离出来。沸点的组分还停留于柱口附近；随着温度上升，组分由低沸点到高沸点依次分离出来。25(2) (2) 梯度洗脱梯度洗脱：在分离过程中：在分离过程中, , 让流动相的组成让流动相的组成( (含有两种或含有两种或两种以上极性不同的溶剂两种以上极性不同的溶剂) )按一定程序连续变化。梯度

17、洗脱用于按一定程序连续变化。梯度洗脱用于液相色谱。液相色谱。(3) (3) 联用柱联用柱/ /柱切换柱切换：柱切换技术指两根或两根以上色谱柱：柱切换技术指两根或两根以上色谱柱( (这些柱对组分能提供不同的这些柱对组分能提供不同的k k和和 值值), ), 通过合适的方式组合通过合适的方式组合, , 让组分在某柱中得到初步分离让组分在某柱中得到初步分离, , 然后设法让其中一些组分在第然后设法让其中一些组分在第二柱中分离二柱中分离, , 让另一些组分在第三柱中分离让另一些组分在第三柱中分离, , 而第二和第三柱而第二和第三柱对各自组分具有高选择性。从而达到分离完全和快速的目的。对各自组分具有高选

18、择性。从而达到分离完全和快速的目的。 此外，还有此外，还有程序变速程序变速、程序变压程序变压等特殊技术。等特殊技术。26 非手性柱非手性柱-手性柱联用技术分离苯丙醇反应液手性柱联用技术分离苯丙醇反应液 串联柱示意图串联柱示意图Col1: SiO2柱柱 Col2: OB柱柱 反冲技术反冲技术27应用柱切换技术测定不对称合成反应液中应用柱切换技术测定不对称合成反应液中的苯丙醇的光学纯度的苯丙醇的光学纯度 柱切换技术示意图柱切换技术示意图 A A（干扰成分）（干扰成分） B B（苯丙醇）（苯丙醇） C C1 1（SiOSiO2 2柱）柱） C C2 2（OBOB柱）柱） 28l高效液相色谱法柱切换技

19、术高效液相色谱法柱切换技术 硅胶柱可以有效地分离饱和烃和芳烃，但硅胶柱可以有效地分离饱和烃和芳烃，但胶质在硅胶柱上强烈保留。采用腈基键合柱胶质在硅胶柱上强烈保留。采用腈基键合柱串联硅胶柱，键合相柱降低了胶质的强保留串联硅胶柱，键合相柱降低了胶质的强保留作用，利用反冲技术洗脱胶质。作用，利用反冲技术洗脱胶质。l l填充毛细管液相色谱填充毛细管液相色谱- -高温毛细管气相色谱高温毛细管气相色谱在线联用分析润滑油在线联用分析润滑油（关亚风，色谱，（关亚风，色谱，1616：469469（19981998）29分离速度分离速度 分析速度决定分析时间。简单地讲，分析时间不少分析速度决定分析时间。简单地讲，

20、分析时间不少于最后一个样品峰的保留时间：于最后一个样品峰的保留时间： 可见，分离速度与流动相线速度密切相关，而后可见，分离速度与流动相线速度密切相关，而后者决定于色谱填料粒度、流动相的柱内压力降、流者决定于色谱填料粒度、流动相的柱内压力降、流动相粘度、柱渗透率或阻抗因子等色谱参数和操作动相粘度、柱渗透率或阻抗因子等色谱参数和操作条件。条件。uHkkRkuLtSR223222)1 ()1(16)1 (30色谱柱峰容量色谱柱峰容量 色谱柱峰容量定义：对给定色谱系统和操作条件，色谱柱峰容量定义：对给定色谱系统和操作条件，在一定时间内，最多能从色谱柱洗出达到一定分离度在一定时间内，最多能从色谱柱洗出达到一定分离度的色谱峰个数。假设在一定的时间内，被分离色谱峰的色谱峰个数。假设在一定的时间内，被分离色谱峰的区域宽度相等，则分离峰的数目为：的区域宽度相等，则分离峰的数目为： 峰容量是色谱系统的一个重要性能参数，峰容量峰容量是色谱系统的一个重要性能参数，峰容量很小的色谱类型（如凝胶