农业大学病毒学实验技术之病毒纯化

1、第六章第六章 病毒的纯化病毒的纯化 利用各种物理、化学方法，以利用各种物理、化学方法，以不使不使病毒受损伤和失活为前提病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。缩的病毒样品。病毒微细结构的研究病毒微细结构的研究病毒抗原蛋白的分离纯化病毒抗原蛋白的分离纯化病毒化学成分及其遗传物质的研究病毒化学成分及其遗传物质的研究病毒感染的分子细节的研究病毒感染的分子细节的研究一、病毒纯化的标准一、病毒纯化的标准保持感染性保持感染性具有均一性：具有均一性：结晶形成结晶形成检测病毒制备物均一性的方法：检测病毒制备物均一性的方法：

2、电镜观察：电镜观察：大小、形态均一大小、形态均一超速离心：超速离心：沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带电泳：电泳：颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带免疫学方法：免疫学方法：只与特异性抗体发生反应只与特异性抗体发生反应大小、形态、密度、化学组成、大小、形态、密度、化学组成、分子量、抗原性分子量、抗原性二、病毒纯化的理论依据二、病毒纯化的理论依据病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质，病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质，可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒病毒体具有一定大小、形状和密度，可利病毒

3、体具有一定大小、形状和密度，可利用超速离心技术提纯病毒用超速离心技术提纯病毒三、病毒纯化前的预处理三、病毒纯化前的预处理1 1、病毒感染的组织、脏器或细胞、病毒感染的组织、脏器或细胞 研磨匀浆研磨匀浆超声波处理超声波处理反复冻融反复冻融低速离心去掉细胞碎片低速离心去掉细胞碎片2 2、细胞培养液、鸡胚尿囊液、细胞培养液、鸡胚尿囊液 低速离心去掉可能含有的杂质或直接用低速离心去掉可能含有的杂质或直接用于病毒的分离纯化于病毒的分离纯化沉淀法沉淀法超速离心法超速离心法超滤法超滤法层析法层析法两相溶剂间分配系数法两相溶剂间分配系数法吸附法吸附法电泳法电泳法四、病毒纯化的方法四、病毒纯化的方法（一）沉淀法

4、（一）沉淀法 主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。中性盐沉淀法（盐析）中性盐沉淀法（盐析）聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法皂土法皂土法鱼精蛋白沉淀法鱼精蛋白沉淀法1 1、中性盐沉淀法（盐析）、中性盐沉淀法（盐析） 先用其它方法去除材料中的大量杂质，再先用其它方法去除材料中的大量杂质，再以高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓以高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓冲液悬浮后再进行盐析，反复几次后，悬浮沉冲液悬浮后再进行盐析，反复几次后，悬浮沉淀，用透析法或其它方法脱盐。淀，用透析法或其它方法脱盐。 病毒一般在病毒一般在

5、45%45%以上饱和度的硫酸铵溶液中以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持感染性。沉淀，且保持感染性。 2 2、聚乙二醇（、聚乙二醇（PEGPEG）沉淀法）沉淀法 用于病毒沉淀的分子量：用于病毒沉淀的分子量：2000-6000 2000-6000 将将PEGPEG配成配成50%50%左右的溶液，或直接将固体左右的溶液，或直接将固体PEGPEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在44搅拌搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。过夜，然后离心使病毒沉淀。3 3、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理：原理

6、：A A、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度降低。降低。 B B、与水作用，破坏蛋白质分子的水化膜。、与水作用，破坏蛋白质分子的水化膜。优点：优点：分辨力高，易除去分辨力高，易除去缺点：缺点：易使表面蛋白质变性，溶解脂质易使表面蛋白质变性，溶解脂质4 4、等电点沉淀法（分辨力不高）、等电点沉淀法（分辨力不高）原理：原理：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀（分

7、辨力不高）。生沉淀（分辨力不高）。 多数病毒的等电点在多数病毒的等电点在pH4.pH4.5.55.5之间。之间。5 5、皂土法、皂土法 轮状病毒轮状病毒 皂土在酸性条件下（皂土在酸性条件下（pH4pH44.5)4.5)可吸附轮状病可吸附轮状病毒，在碱性条件下毒，在碱性条件下(pH8.5)(pH8.5)，又使其洗脱下来。，又使其洗脱下来。6 6、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于50nm50nm的病毒）的病毒） 鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直径大于径大于50nm 50nm ）共沉淀的作用，当向这种沉淀物加入）共沉淀的作

8、用，当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中，时，其它蛋白质又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。而鱼精蛋白仍然沉淀。（二）层析法（二）层析法葡聚糖柱层析法葡聚糖柱层析法凝胶层析法凝胶层析法离子交换柱层析法离子交换柱层析法亲和层析法亲和层析法 （三）两相溶剂间分配系数法（三）两相溶剂间分配系数法原理：原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同而选择性地分配于其中的一方。而选择性地分配于其中的一方。常用的溶剂：常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate, Ds) de

9、xtran sulphate, Ds) 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG） 甲基纤维素（甲基纤维素（MCMC） 聚乙烯醇（聚乙烯醇（PVAPVA）分配体系：分配体系：Ds-PEGDs-PEG系、系、Ds-PVADs-PVA系、系、Ds-MCDs-MC系系（四）吸附法（四）吸附法原理：原理：利用对病毒或对杂质有选择吸附能力的固利用对病毒或对杂质有选择吸附能力的固体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定的盐溶体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定的盐溶液把它们洗脱下来。液把它们洗脱下来。 作为吸附剂必须具备的特点：作为吸附剂必须具备的特点：有较大的表面积和吸附能力有较大的表面积和吸附能力较高的吸附选择性

10、较高的吸附选择性便于洗脱便于洗脱性质稳定性质稳定常用吸附剂：常用吸附剂：白土白土磷酸钙磷酸钙硅藻土硅藻土红细胞红细胞离子交换树脂离子交换树脂羧甲基纤维素羧甲基纤维素（六）超滤法（六）超滤法 利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。优点：优点：可用于大容量样品的浓缩可用于大容量样品的浓缩可以在室温或低温下操作可以在室温或低温下操作对被浓缩产物的损害小对被浓缩产物的损害小浓缩的同时可达到部分纯化浓缩的同时可达到部分纯化回收率高回收率高可防止外来污染可防止外来污染（五）

11、电泳法（五）电泳法（七）离心法（七）离心法差速离心差速离心速度区带离心法速度区带离心法密度梯度离心密度梯度离心 1.1.差速离心法差速离心法原理：原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。不同大小和比重的粒子沉降速度不同。用途：用途：从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附释放的病毒悬液中提纯病毒。吸附释放的病毒悬液中提纯病毒。优点：优点：可快速处理大量样品可快速处理大量样品步骤：步骤：低速（低速（2000-3000r/min, 20-30min)2000-3000r/min, 20-30min)、中速、中速（10000min, 20-30min)10000m

12、in, 20-30min)去除较大的宿主细胞碎片、去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。再选择较高速度污染的细菌及其它较大的杂质。再选择较高速度离心离心1-2h1-2h使病毒沉淀。使病毒沉淀。速度梯度离心法速度梯度离心法密度梯度离心法密度梯度离心法原理原理沉降与颗粒质量成正比，沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进以物质沉降速度的不同进行分离行分离沉降与颗粒密度成正比，沉降与颗粒密度成正比，以物质浮密度的不同进行以物质浮密度的不同进行分离分离介质介质密度小，密度小，1-1.3286，预制，预制梯度，不连续梯度，不连续密度大，密度大，1-1.9025，连续，连续梯度梯度离心力

13、场离心力场强，离心速度高，使被分强，离心速度高，使被分离物质易沉降离物质易沉降稍强，速度相对低，使稍强，速度相对低，使CsCl形成梯度，建立沉降形成梯度，建立沉降扩散平衡扩散平衡离心过程离心过程 样品向离心管底沉降样品向离心管底沉降样品停留于介质的等密度样品停留于介质的等密度部位部位离心时间离心时间 较短，几小时到几十小时较短，几小时到几十小时较长，十几小时到数天较长，十几小时到数天2. 速度梯度离心法与密度梯度离心法速度梯度离心法与密度梯度离心法速度梯度离心速度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心AB五、病毒纯化应注意的问题五、病毒纯化应注意的问题1 1、保持病毒的感染性、保持病毒的感染性 严格

14、控制温度、严格控制温度、pHpH及试剂的选择。及试剂的选择。2 2、选用适宜的纯化实验起始材料、选用适宜的纯化实验起始材料无其它病毒或毒株的污染无其它病毒或毒株的污染病毒体的含量高病毒体的含量高杂质含量少并易于处理杂质含量少并易于处理3 3、根据具体情况选择提纯方法、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的特点、研究的目的以及实验室的条件等，选择特点、研究的目的以及实验室的条件等，选择适宜的纯化方法。适宜的纯化方法。4 4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法六、伪狂犬病毒的浓缩提纯六、伪狂犬病毒的浓缩提纯1 1、

15、病毒材料、病毒材料 将伪狂犬病病毒接种于将伪狂犬病病毒接种于PK-15PK-15细胞，病变细胞，病变后收集细胞培养物，反复冻融后收集细胞培养物，反复冻融3 3次，即为样品次，即为样品材料。材料。2 2病毒提纯浓缩病毒提纯浓缩去细胞碎片及杂质：去细胞碎片及杂质：将细胞培养物将细胞培养物4 3000r/min4 3000r/min离离心心30min30min，收集上清液。，收集上清液。硫酸铵沉淀：硫酸铵沉淀：按按100ml100ml病毒液病毒液42.5g42.5g硫酸铵的量加入硫酸铵的量加入硫酸铵，搅匀后置硫酸铵，搅匀后置44冰箱搅拌沉淀过夜，冰箱搅拌沉淀过夜，4 4 5000r/min5000r

16、/min离心离心40min40min，去上清，沉淀用适量的灭菌，去上清，沉淀用适量的灭菌ddHddH2 2O O悬浮。悬浮。透析：透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddHddH2 2O O或或PBSPBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5 5次，第次，第5 5次透析过夜。次透析过夜。浓缩：浓缩：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病毒浓缩至合适的体积。毒浓缩至合适的体积。超离纯化：超离纯化：l在离心管中加入不同浓度的甘油垫层，即先加入在离心管中加入不同浓度的甘油垫层，即先加入45%45

17、%甘油，再加入甘油，再加入5%5%甘油。甘油。l加入病毒悬液（应不超过离心管总容积的加入病毒悬液（应不超过离心管总容积的10%10%）。）。l20000-25000r/min20000-25000r/min离心离心2h2h。l弃上层液体，沉淀用适量弃上层液体，沉淀用适量TENTEN重悬（涡旋或超声波重悬（涡旋或超声波处理，使沉淀分散）。处理，使沉淀分散）。l速度区带离心速度区带离心l密度梯度离心密度梯度离心l在离心管中加入不同浓度的在离心管中加入不同浓度的CsClCsCl或蔗糖垫层，再或蔗糖垫层，再加入病毒悬液，超高速离心。加入病毒悬液，超高速离心。l蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心：在离心管

18、中加入：在离心管中加入20%20%60%60%不连续蔗不连续蔗糖密度梯度糖密度梯度, 20000-25000r/min, 20000-25000r/min离心离心2h2h3h 3h ，收集蔗糖，收集蔗糖浓度为浓度为35%35%处的病毒带，加入适量缓冲液稀释后，再次处的病毒带，加入适量缓冲液稀释后，再次20000-25000r/min20000-25000r/min离心离心2h2h，沉淀用适量，沉淀用适量TENTEN重悬。重悬。 PrVPrV鄂鄂A A株电镜观察株电镜观察l左图：上带中的左图：上带中的P PrVrV粒子粒子l右图：下带中的右图：下带中的P PrVrV粒子粒子浓缩（方法二）浓缩（方法二）l将经低速离心去掉细胞碎片及杂质的病毒悬将经低速离心去掉细胞碎片及杂质的病毒悬液直接液直接20000-25000r/min20000-25000r/min离心离心2h2h。l弃上层液体，沉淀用适量弃上层液体，沉淀用适量TENTEN重悬。重悬。l将重悬的病毒液再经梯度离心纯化。将重悬的病毒液再经梯度离心纯化。如何利用纯化的病毒进行下一步的研究如何利用纯化的病毒进行下一步的研究l研究病毒的结构研究病毒的结构l研究病毒感染的分子细节研究病毒感染的分子细节病毒粒子的标记病毒粒子的标记研究与受体的结合研究与受体的结合研究病毒的侵