第十章高效液相色谱分析

1、第十章第十章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析10-110-1高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法高效液相色谱法(High Performance Liquid (High Performance Liquid ChromatographyChromatography，HPLC)HPLC)是二十世纪是二十世纪7070年代迅速年代迅速发展起来的一项新颖快速的分离分析技术。发展起来的一项新颖快速的分离分析技术。 高效液相色谱在经典的高效液相色谱在经典的“液相色谱液相色谱”基础基础上，引入了气相色谱法的理论，技术上采用了上，引入了气相色谱法的理论，技术上采用了高压泵高压泵、高效固

2、定相高效固定相和和高灵敏度检测器高灵敏度检测器，实现，实现了分析速度快，分离效能高和操作自动化。了分析速度快，分离效能高和操作自动化。该方法的几个突出特点：该方法的几个突出特点：(1)(1)高压：高压： 液相色谱以液体作为流动相液相色谱以液体作为流动相( (称为载液称为载液) )，液，液 体流经色谱柱受到的阻力较大，为使体流经色谱柱受到的阻力较大，为使载液迅载液迅 速通过速通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般色谱柱，必须对载液施加高压。一般 可达到可达到150150300kg/cm300kg/cm2 2。(2)(2)快速：快速： 由于使用了高压，由于使用了高压，HPLCHPLC所需的时间较之经

3、典所需的时间较之经典 液相色谱短得多，如分离苯的羟基化合物七液相色谱短得多，如分离苯的羟基化合物七 个组分，只需个组分，只需1 1分钟；分钟；对氨基酸的分离，对氨基酸的分离，经典液相色谱需用经典液相色谱需用2020小时才能分离出小时才能分离出2020种氨基种氨基酸，而酸，而HPLCHPLC只需只需1 1小时即可完成。小时即可完成。载液在色谱柱载液在色谱柱内的流速可达内的流速可达1 110mL10mLminmin-1-1。(3)(3)高效：高效： 气相色谱的柱效（气相色谱的柱效（n n值）约为值）约为20002000塔板塔板/m/m，而，而高效液相色谱约为高效液相色谱约为50005000塔板塔板

4、/m/m以上；一根以上；一根高效液高效液相色谱柱可同时分离多达相色谱柱可同时分离多达100100种以上的组分。种以上的组分。(4)(4)高灵敏度：高灵敏度： 由于在由于在HPLCHPLC中使用高灵敏度的检测器，如紫中使用高灵敏度的检测器，如紫外检测器的最小检测量可达外检测器的最小检测量可达1010-9-9g g，荧光检测器荧光检测器可达可达1010-11-11克；所需试样为微升级。克；所需试样为微升级。HPLCHPLC与与GCGC相比较的突出优点：相比较的突出优点： 用用GCGC法分析样品须先气化，目前已知的有机法分析样品须先气化，目前已知的有机 物中，能直接采用物中，能直接采用GCGC法进行

5、分析的仅占法进行分析的仅占20%20%。 而而HPLCHPLC法则不受此限制，尤其适合于分析生法则不受此限制，尤其适合于分析生 物、医学方面的大分子及离子型化合物。物、医学方面的大分子及离子型化合物。 HPLCHPLC方法中，有两个相与样品分子相互作用方法中，有两个相与样品分子相互作用 ，而，而GCGC方法方法中一般认为只有一个相与样品分中一般认为只有一个相与样品分 子相互作用。所以子相互作用。所以HPLCHPLC的选择性大大提高。的选择性大大提高。 HPLCHPLC方法中，因为在常温下进行分析，因此方法中，因为在常温下进行分析，因此 固定相的选择比固定相的选择比GCGC多；另一方面可提高色谱

6、多；另一方面可提高色谱 的分离效率。的分离效率。 HPLCHPLC方法中，可使用灵敏度较高的光度检测方法中，可使用灵敏度较高的光度检测 器，而在器，而在GCGC方法中则无法使用。方法中则无法使用。 HPLCHPLC方法中，样品可以回收，而方法中，样品可以回收，而GCGC方法中样品方法中样品 回收则较困难。回收则较困难。10-2 HPLC10-2 HPLC色谱仪色谱仪高效液相色谱仪的结构如下：高效液相色谱仪的结构如下： 由贮液瓶由贮液瓶、高压泵、高压泵( (梯度洗提装置梯度洗提装置) )、进样器、进样器、色谱柱色谱柱( (恒温器恒温器) )、检测器和记录仪组成。、检测器和记录仪组成。主要部件简述

7、：主要部件简述：1.1.高压泵高压泵 其作用是输送其作用是输送载液载液( (流动相流动相) )。由于色谱柱很细。由于色谱柱很细 (1(16mm)6mm)，填充剂粒度小，填充剂粒度小( (几十微米几十微米) )，因此要，因此要 达到快速高效的分离效果，要求压力为达到快速高效的分离效果，要求压力为150150 200kg/cm 200kg/cm2 2。2.2.梯度洗提装置梯度洗提装置 又称又称梯度洗脱梯度洗脱(gradient elution)(gradient elution)和气相色谱和气相色谱 法中的程序升温类似，对复杂混合物的分离带法中的程序升温类似，对复杂混合物的分离带 来方便。来方便。

8、 所谓梯度洗提，指载液中含有两种或两种以所谓梯度洗提，指载液中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变载液中各溶剂的配比。连续改变载液中各溶剂的配比。由此通过改变由此通过改变载液的极性来达到分离组分，提高分离效果。载液的极性来达到分离组分，提高分离效果。3.3.进样装置进样装置因为流路中为高压力工作状态，通常使用耐高因为流路中为高压力工作状态，通常使用耐高 压的六通阀进样装置。压的六通阀进样装置。4.4.色谱柱色谱柱 常用的标准柱型是内径常用的标准柱型是内径4.64.6或或3.9mm3.9mm，长度为，长度为151530cm30c

9、m的直形不锈钢管。填料粒度的直形不锈钢管。填料粒度5 51010 m m，柱，柱效以理论塔板数计大约效以理论塔板数计大约700070001000010000。其。其发展趋势发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。是减小填料粒度和柱径以提高柱效。5.5.检测器检测器常用的检测器：常用的检测器：(1)(1)紫外光度检测器紫外光度检测器(UV)(UV)： 它的作用原理是基于被分析试样对特定波长它的作用原理是基于被分析试样对特定波长紫外光的选择性吸收。池内样品浓度与吸收的紫外光的选择性吸收。池内样品浓度与吸收的光强度服从比耳定律。光强度服从比耳定律。P.304.P.304. 最小检测量为最小检测量为1

10、010-9-9g gmLmL-1-1，对流量和温度的波，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。动不敏感，可用于梯度洗脱。紫外检测器的缺点：不适用于紫外光完全不吸紫外检测器的缺点：不适用于紫外光完全不吸收的试样，溶剂的选用也受到一定的限制。收的试样，溶剂的选用也受到一定的限制。 光电二极管阵列光电二极管阵列(photo-diode array (photo-diode array detector)detector)检测器是紫外检测器的重要进展。检测器是紫外检测器的重要进展。10241024个二极管阵列，各检测特定波长，通过计个二极管阵列，各检测特定波长，通过计算机快速处理，形成三维立体谱图

11、，如图所示。算机快速处理，形成三维立体谱图，如图所示。(2)(2)差示折光检测器：差示折光检测器：偏转式差示折光检测器光路图偏转式差示折光检测器光路图 光源光源1 1射出光线由射出光线由透镜透镜2 2聚焦聚焦, ,透过遮透过遮光板光板4 4的狭缝的狭缝, ,经反经反射镜射镜5 5反射后反射后, ,由透由透镜镜6 6汇聚两次汇聚两次, ,穿过穿过工作池工作池7 7和参比池和参比池8 8 该检测器是继该检测器是继UVUV检测器之后，第二种广泛使检测器之后，第二种广泛使用的液相色谱检测器。图示：用的液相色谱检测器。图示：被平面反射镜被平面反射镜9 9反射出来，成像于棱镜反射出来，成像于棱镜1111的

12、棱口的棱口上，光束均匀分为两束，到达对称的光电管上，光束均匀分为两束，到达对称的光电管1212上。上。 如果工作池和参比池皆通过纯流动相如果工作池和参比池皆通过纯流动相，光，光束无偏转，左右两个光电管的信号相等；束无偏转，左右两个光电管的信号相等； 如果工作池中有试样通过，由于折射率改变，如果工作池中有试样通过，由于折射率改变，造成光束偏转，从而使到达棱镜的光束偏离棱口，造成光束偏转，从而使到达棱镜的光束偏离棱口，左右两个光电管接受的光能量不等，其差值正比左右两个光电管接受的光能量不等，其差值正比于试样的浓度。于试样的浓度。 每种物质都有各自不同的折射率，因此都可每种物质都有各自不同的折射率，

13、因此都可用差示折光检测器进行检测，所以是一种通用型用差示折光检测器进行检测，所以是一种通用型的浓度检测器。的浓度检测器。灵敏度为灵敏度为1010-7-7g gmLmL-1-1。 缺点：对温度变化很敏感，此检测器不能缺点：对温度变化很敏感，此检测器不能用于梯度洗提。用于梯度洗提。3-3 HPLC3-3 HPLC的理论基础简述的理论基础简述 高效液相色谱法的理论基础基本与气相色高效液相色谱法的理论基础基本与气相色谱法相同，但有其不同之处。两者的主要区别谱法相同，但有其不同之处。两者的主要区别在于在于流动相流动相的不同。的不同。根据速率理论，根据速率理论，HPLCHPLC中影响柱效的因素如下：中影响

14、柱效的因素如下： 涡流扩散项涡流扩散项H He e H He e=2=2 d dp p 其含义与气相色谱法相同。其含义与气相色谱法相同。2.2.纵向扩散项纵向扩散项 H Hd d 式中式中C Cd d为常数，为常数，D Dm m为分子在流动为分子在流动相中的扩散系数。相中的扩散系数。由于分子在液体中的扩散系数比在气体中小由于分子在液体中的扩散系数比在气体中小4 45 5个数量级，当流动相的线速度个数量级，当流动相的线速度0.5cm0.5cms s-1-1，该项，该项对对H H的影响可忽略不计。而的影响可忽略不计。而GCGC中该项的影响则很中该项的影响则很大。大。3.3.传质阻力项传质阻力项 与

15、与GCGC类似，类似， HPLCHPLC也可分为也可分为固定相传质阻力固定相传质阻力项项和和流动相传质阻力项流动相传质阻力项。dmdC DHu固定相传质阻力固定相传质阻力H Hs s主要发生在液液分配色谱主要发生在液液分配色谱中，类似于气液色谱中的液相传质阻力项。中，类似于气液色谱中的液相传质阻力项。 式中式中C Cs s 为常数为常数( (与与k k有关有关) )；D Ds s为组为组分分子在固定液内的扩散系数；分分子在固定液内的扩散系数；由上式可见，由上式可见，H Hs s与与GCGC中的中的C CL L含义是一致的。含义是一致的。 流动相传质阻力流动相传质阻力HPLCHPLC中该项有两种

16、形式，分为中该项有两种形式，分为在流动的流动相中在流动的流动相中和和滞留的流动相中滞留的流动相中的传质阻力，的传质阻力，分别用分别用H Hm m和和H Hsmsm表示。表示。2sfssC dHuD式中式中C Cm m是常数是常数( (与与k k有关有关) )，D Dm m 为组为组分分子在流动相中的扩散系数。分分子在流动相中的扩散系数。式中式中Csm为一常数；为一常数； 综上所述，由柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度综上所述，由柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：的变化可归纳为：2mpmmC dHuD将上式简化：将上式简化： H= A + B/u + CuH= A + B/u + Cu2

17、smpsmmC dHuD 可见，减小填料的孔径和粒度，采用低粘度可见，减小填料的孔径和粒度，采用低粘度及低流速流动相，适当提高温度等方法都可提高及低流速流动相，适当提高温度等方法都可提高柱效。柱效。 由由H H d dp p2 2可知，其中减小填料粒度是提高柱可知，其中减小填料粒度是提高柱效的最有效途径；因孔穴深度也同时随之减小。效的最有效途径；因孔穴深度也同时随之减小。 总结：总结：HPLCHPLC速率方程式形式与速率方程式形式与GCGC一致，其主要一致，其主要区别在于区别在于HPLCHPLC纵向扩散项纵向扩散项(Hd )可以忽略不计，可以忽略不计，影响柱效的主要因素是影响柱效的主要因素是涡

18、流扩散项涡流扩散项He和传质阻和传质阻力项力项Hm、Hsm 、Hs。3-4 HPLC3-4 HPLC的主要类型及其分离原理的主要类型及其分离原理根据分离机制的不同，根据分离机制的不同，HPLCHPLC可分为下述几种主可分为下述几种主要类型：要类型：液液-液色谱法液色谱法、液液-固色谱法固色谱法、离子交换离子交换色谱法色谱法、离子对离子对色谱法色谱法、离子、离子色谱法和色谱法和空间排阻色谱法空间排阻色谱法等等。1.1.液液- -液分配色谱法液分配色谱法(L-L partition chromatograph)(L-L partition chromatograph) 流动相和固定相都是液体，其分

19、离原理为试流动相和固定相都是液体，其分离原理为试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异。当浓度分配达到平衡时，应服从于下在差异。当浓度分配达到平衡时，应服从于下式：式：sMMsCVKkkCV液液- -液分配色谱主要有两种类型：液分配色谱主要有两种类型： 正相液正相液-液分配色谱液分配色谱 用于分离极性较强的水溶性样品，非极性或弱用于分离极性较强的水溶性样品，非极性或弱 极性的物质不易被保留，出峰较早。极性的物质不易被保留，出峰较早。 反相液反相液-液分配色谱液分配色谱 用于分离水溶性较差的样品，出峰次序与正相用于分离水溶性较差的样品，出峰次序与正

20、相 的相反，极性组分先被洗脱。的相反，极性组分先被洗脱。特点：色谱柱制备的重现性较好；缺点：特点：色谱柱制备的重现性较好；缺点： 分离分离过程中由于流动相通过色谱柱时的机械冲击，过程中由于流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液会不断流失而导致柱的保留行为变化。固定液会不断流失而导致柱的保留行为变化。 为此将各种有机基团通过化学反应键合上担体为此将各种有机基团通过化学反应键合上担体表面，代替机械涂渍的液体固定相，如此可克表面，代替机械涂渍的液体固定相，如此可克服该方法的缺点。服该方法的缺点。2.2.液液- -固色谱法固色谱法(L-S adsorption (L-S adsorption chrom

21、atographchromatograph) ) 流动相为液体，固定相为吸附剂。根据物质流动相为液体，固定相为吸附剂。根据物质对对 组分分子吸附作用的不同来进行分离。组分分子吸附作用的不同来进行分离。该方法适用于分离脂溶性试样，该方法适用于分离脂溶性试样，对具有不同官能对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：由缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。3.3.离子交换色谱法离子交换色谱法(ion-exchange chromatography)(ion-exchange chromatography) 该方法

22、是基于离子交换树脂上可电离的离该方法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中携带相同电荷的组分离子进行可子与流动相中携带相同电荷的组分离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂的不同亲和力逆交换，依据这些离子对交换剂的不同亲和力而进行分离。而进行分离。凡是在溶剂中凡是在溶剂中能电离的物质能电离的物质通常都可用离子交通常都可用离子交换色谱法进行分析。换色谱法进行分析。 离子交换色谱法主要用来分离离子交换色谱法主要用来分离离子离子或或可离可离解的化合物解的化合物，2020世纪世纪6060年代前后，已成功分离年代前后，已成功分离了氨基酸、核酸、蛋白质等，在生物化学领域了氨基酸、核酸、蛋白质等，在生物化

23、学领域得到了广泛的应用。得到了广泛的应用。3344()()()()MNa O SMO SNaXClR NXR NCl ：- - -载载液液中中 载载液液中中载载液液中中 载载液液中中阳阳离离子子交交换换：树树脂脂树树脂脂 + +阴阴离离子子交交换换树树脂脂树树脂脂 + + 空间排阻色谱法以凝胶空间排阻色谱法以凝胶(gel)(gel)为固定相。分为固定相。分离机理与其它色谱法完全不同。离机理与其它色谱法完全不同。 该方法分离的机理类似分子筛的作用，但孔该方法分离的机理类似分子筛的作用，但孔径比分子筛要大，为数纳米到数百纳米。溶质在径比分子筛要大，为数纳米到数百纳米。溶质在两相间的分离不是由于相互

24、作用力的不同，而是两相间的分离不是由于相互作用力的不同，而是按分子大小进行分离。按分子大小进行分离。4.4.空间排阻色谱法空间排阻色谱法(steric exclusion (steric exclusion chromatographchromatograph) ) 试样中的大分子不能进入胶孔而受试样中的大分子不能进入胶孔而受到排阻，就直接通过柱子首先在色谱图到排阻，就直接通过柱子首先在色谱图上出现；另外一些小分子可以进入胶孔上出现；另外一些小分子可以进入胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。留值最大，在色谱图上最后出现。 排阻色

25、谱法中，载液排阻色谱法中，载液分子通常都很小，它们一分子通常都很小，它们一般最后被洗脱般最后被洗脱(t(tM M最大最大) )，结果是：整个试样都在结果是：整个试样都在t tM M( (死时间死时间) )以前洗脱。以前洗脱。 由于由于排阻色谱法的排阻色谱法的分离机理与其他色谱法分离机理与其他色谱法不同，具有几个突出的不同，具有几个突出的特点：特点：(1)(1)试样峰全部在溶剂的保留时间前出峰，它们试样峰全部在溶剂的保留时间前出峰，它们 在柱内的停留时间短，故柱内产生的峰扩展在柱内的停留时间短，故柱内产生的峰扩展 比其他方法小得多。比其他方法小得多。(2)(2)固定相和流动相的选择简便。固定相和

26、流动相的选择简便。(3)(3)适用于分离相对分子质量差别在适用于分离相对分子质量差别在10%10%以上的以上的 分子。分子。 GC GC中可供选择的载气只有三四种，它们的中可供选择的载气只有三四种，它们的性质差异不大。要提高柱的选择性，主要是改性质差异不大。要提高柱的选择性，主要是改变固定相的性质。变固定相的性质。3-6 HPLC3-6 HPLC的流动相的流动相 而而HPLCHPLC中，当固定相选定时，流动相的种类中，当固定相选定时，流动相的种类、配比能显著地影响分离效果。选择流动相时应、配比能显著地影响分离效果。选择流动相时应注意以下几方面因素：注意以下几方面因素： 纯度纯度 如溶剂不纯，则

27、长期积累杂质会导致检测如溶剂不纯，则长期积累杂质会导致检测器噪声增加，同时也影响收集的馏分纯度。器噪声增加，同时也影响收集的馏分纯度。(2)(2)避免使用引起柱效损失或保留特性变化的溶避免使用引起柱效损失或保留特性变化的溶 剂。剂。(3)(3)对试样要有适宜的溶解度，否则在柱头易产对试样要有适宜的溶解度，否则在柱头易产 生沉淀。生沉淀。(4)(4)考虑到泵压，流动相的粘度小些为好。考虑到泵压，流动相的粘度小些为好。(5)(5)应与检测器相匹配，如紫外光检测器，就不应与检测器相匹配，如紫外光检测器，就不 能使用对紫外光吸收的溶剂。能使用对紫外光吸收的溶剂。 常用溶剂的极性顺序排列如下常用溶剂的极

28、性顺序排列如下：水水( (极性最大极性最大) )、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、异丙酮、四氢呋喃、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、异丙醚、氯仿、苯、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、环醚、氯仿、苯、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、环己烷、煤油己烷、煤油( (极性最小极性最小) )。 溶剂还可采用二元或多元组合。根据分别所起溶剂还可采用二元或多元组合。根据分别所起的作用，采用的溶剂可分成的作用，采用的溶剂可分成底剂底剂及及洗脱剂洗脱剂两种。两种。 底剂底剂决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况；洗脱剂洗脱剂则起则起调节试样组分的滞留并对某几个组

29、分具有选择性调节试样组分的滞留并对某几个组分具有选择性的分离作用。的分离作用。 正相色谱中，正相色谱中，底剂底剂采用低极性溶剂如正己采用低极性溶剂如正己烷、苯、氯仿等；而烷、苯、氯仿等；而洗脱剂洗脱剂则根据试样的性质则根据试样的性质选取极性较强的针对性溶剂如醚、酯、酮、醇选取极性较强的针对性溶剂如醚、酯、酮、醇和酸等。和酸等。 反相色谱中，反相色谱中，底剂底剂一般采用水，一般采用水，洗脱剂洗脱剂常常采用有机溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。采用有机溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。 而离子交换色谱法主要在含水介质中进行而离子交换色谱法主要在含水介质中进行，组分的保留值可通过调节流动相中的离子强，组分的保留值可通过调节流动相中的离子强度和度和pHpH来控制。来控制。 排阻色谱所用的溶剂必须与凝胶本身非常排阻色谱所用的溶剂必须与凝胶本身非常相近，以润湿凝胶并防止吸附作用。对分离大分相近，以润湿凝胶并防止吸附作用。对分离大分子化合物，易采用粘度小的溶剂作流动相如四氢子化合物，易采用粘度小的溶剂作流动相如四氢呋喃、甲苯等。对分离生物物质，主要采用水、呋喃、甲苯等。对分离生物物质，主要采用水、缓冲盐溶液等。缓冲盐溶液等。3-7 HPLC3-7 HPLC分离类型的选择分离类型的选择 应用应用HPLCHPLC对试样进行分离对试样