生化实验论文

1、小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 小组成员：李 朋武 浩2021级一大班法医2021年1月3日小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化复原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶

2、解度低易析出，最适温度为37，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。?小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定?实验方案实验目的熟悉并掌握生化四大技术离心、层析、比色、电泳。熟悉并掌握别离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。实验原理匀浆原理：别离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度

3、很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过参加有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的别离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，局部杂蛋白那么沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，别离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。盐析原理：蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。通过向过氧化氢酶粗提液中参加适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而局部杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存在

4、于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与局部杂蛋白的别离。透析原理：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，那么过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与局部杂蛋白的别离。层析原理：凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混

5、合物中各种物质得到别离的技术。采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的别离，通过监测洗脱液在407nm过氧化氢酶特征性吸收波长和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。米氏常数测定原理：底物浓度与反响速率之间的关系可用V=表示，图形为矩形双曲线如下将此式取倒数可得，以和作图可得一直线由图可知该直线与横轴的截距为-。找出一系列的点，将点复原为直线，即可求出Km点的取法：设置不同的底物浓度，参加酶的量相同，反响相同的时间，找出反响后过氧化氢的量，分解的底物可以求得，用它来表示反响速率。

6、剩余的过氧化氢用高锰酸钾滴定。2KMnO4+5H2O2+3H2SO4=2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O蛋白质浓度测定原理：蛋白质中的酪氨酸等与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。Lowry法测定蛋白质可分为两个步骤：1、在碱性溶液中，蛋白质与铜离子发生反响Cu2+蛋白质Cu-蛋白质2、Cu-蛋白质使试剂中的磷钨酸-磷钼酸复原成为蓝色化合物，测定光吸收值就可以推算出蛋白质的含量。试剂中的碳酸钠有缓冲作用，使溶液的pH始终保持在10左右，显色最深。福林-酚法的灵敏度高、蛋白质浓度测定范围是25250g/ml.但此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸等与试剂

7、的反响，因此他受蛋白质氨基酸组成的影响，即不同蛋白质中氨基酸组成的不同会使显色强度有所差异；此外，样品中酚类及柠檬酸的干扰会使结果偏高。低浓度的尿素约0.5%左右、胍约0.5%左右、硫酸钠1%、硝酸钠1%、三氯醋酸0.5%、乙醇5%、丙酮0.5%对显色无影响，上述物质浓度高时必须做校正曲线。SDS-PAGE测定分子量原理：在聚丙烯酰胺凝胶系统中参加阴离子去污剂十二烷基磺酸钠SDS，那么蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于分子量大小Mr，而与本身所带的电荷量和形状无关。具体公式:lgMW=(A+B)Rf实验步骤：(一)、组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液 1.颈椎脱臼处死6只小鼠，取肝脏约6g； 2.参

8、加预冷匀浆缓冲液51ml,用组织捣碎机匀浆3min,取200L，匀浆液留样放入冰箱-20保存； 3.冰浴下缓慢参加3ml氯仿，再次匀浆1min;匀浆液离心4，7500rpm,30min弃沉淀，收获上清液44ml于锥形瓶中； 4.取匀浆上清液120L,参加40L 4×电泳上样Buffer,沸水浴5min，备用于SDS-PAGE检测-20保存，另取200L匀浆后上清液-20保存。二、盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶 1.冰浴搅拌状态下向肝脏匀浆上清液缓慢滴加7mlNa2SO4,继续用玻璃棒手动冰浴搅拌1h; 2.将盐析溶液离心4，7500rpm,10min弃上清保存沉淀; 3.用24ml磷

9、酸缓冲液溶解沉淀15min，离心4，5000rpm,10min弃沉淀保存上清液; 4.取盐析后上清液120L，用40L 4×电泳上样Buffer，沸水浴5min,备用于SDS-PAGE检测，-20保存； 5.将透析袋至于沸水浴5min，清洗晾凉后备用； 6.将上清液放入透析袋中，置于透析液中两周，中途更换一次透析液； 7.两周后取透析袋中浑浊溶液离心4，7500rpm，10min弃上清保存沉淀; 8.用3ml磷酸缓冲液溶解沉淀15min,离心4，4000rpm,10min弃沉淀保存上清液; 9.取上清液120L，用40L 4×电泳上样Buffer制样沸水浴5min,备用于S

10、DS-PAGE检测，于-20保存； 10.将透析袋至于沸水浴5min,清洗晾凉后备用； 11.将收获的上清液放入处理后的透析袋中置于75的甘油中包埋浓缩2h，待样品浓缩至1.2ml收样，置于-20保存。三、凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶 1.凝胶的处理预先处理好； 2.装柱取一支层析柱，于底部填塞薄棉，将层析柱垂直夹于铁架台，于柱中参加缓冲液5cm，使用前将凝胶混匀顺玻璃棒缓慢注入柱中，待其自然下沉，凝胶床至少2/3柱高; 3.平衡磷酸缓冲盐溶液流洗，控制流速5-10滴/min; 4.浓缩样品； 5.加样用吸管吸取待别离的浓缩液1.2ml,在接近凝胶床外表处沿柱壁缓慢参加； 6.洗脱用磷酸盐缓

11、冲液保持流速； 7.收集及检测样品下降至底部5cm开始用试管收集流出液，每管收集2ml,收集管依次在407nm和280nm波长下测吸光度值，绘制洗脱曲线；如图1 8.收获纯化产物收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管； 9.取2ml纯化后存样于-20保存，备于蛋白质浓度和Km值测定； 10.取层析样品60L，用20L 4×电泳上样Buffer制样，沸水浴5min,备用于SDS-PAGE检测，于-20保存。四、Lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度 1.选择标准蛋白:选择与待测样品层析后的纯化样品相同或组成类似的蛋白质作为标准蛋白溶液。 2.标准蛋白溶液的配制:将标准蛋白经凯氏定氮

12、法准确测定其蛋白质含量，再用无离子水配制成0.1mg/ml的储存液。 3.实验结果表1所示配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光光度计上测定650nm处的光密度值。 4.以各标准溶液浓度为横坐标，各管的光密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。如图2 5.测定样品蛋白:取试管两支，一支放1ml稀释的层析后纯化样品和1ml试剂AB混合液，另一支放1ml生理盐水和1ml试剂AB混合液，两者均混匀后在50水浴保温10分钟，冷却，再各参加试剂C 3ml立即混匀，置于50水浴中保温20分钟，冷却后测定650nm波长处的光密度值。五.双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数 1.稀释匀浆后和

13、层析后样品各1000倍5L-5ml 2.过氧化氢的浓度再标定:取清洁锥形瓶2支，各加0.04mol/L的过氧化氢溶液2.0ml和25硫酸2.0ml。分别用0.002mol/L高锰酸钾滴定至微红，记录滴定毫升数去平均值，计算过氧化氢的摩尔浓度。 3.反响测速:取枯燥的50ml锥形瓶5只，编号后操作。终止反响：血液参加后立即计时10分钟，到时立即参加25硫酸2.0ml,边加边摇，终止酶促反响。 4.滴定:用标准0.002mol/L高锰酸钾滴定，记录各瓶耗高锰酸钾的ml数。 5.计算 1.反响瓶中过氧化氢浓度计算 S=H2O2摩尔浓度*H2O2的ml数/3.0 2.反响速度计算 V=H2O2的摩尔浓

14、度*参加H2O2毫升数-0.002*2.5*消耗KMnO4的ml数 =参加的H2O2的毫摩尔数-剩余的H2O2的毫摩尔数 3.求Km值 如图3六.SDS-PAGE法测定纯化的过氧化氢酶分子量 1.凝胶的制备：(预先处理好) 2.蛋白质 样品的处理：将蛋白质溶解在蛋白质样品溶解液中，在100加热2-5分钟。蛋白质的最后浓度一般为0.05-1mg/ml. 3.加样 4.电泳 5.剥胶和固定垂直柱形电泳 6.染色和脱色 7.蛋白质的定量如图4实验结果：小鼠肝脏过氧化氢酶别离纯化溶液体积ml蛋白浓度mg/ml酶活Km分子量IU/ml 总酶活比活IU/mg回收率%匀浆产物442.7-57,891 层析产

15、物20.205102048.78-0.0795 图1图2图3图4试验中的几个考前须知1) 使用离心机要注意平衡，平稳，对称，牢固，缓慢，以防止损伤离心机。2) 手动玻璃匀浆器助溶时，要注意缓慢旋转推移，时间稍微长一些，使溶解的更充分。3) 使用分光光度计前，要记得调零。4) 装柱时，防止出现断层，干胶。实验必须保证试管，量筒，吸管等的清洁，以防止试剂之间的污染，影响实验结果。5) 匀浆制备中快慢交替，防止温度过高对过氧化氢酶产生影响6) 洗脱速度不可过快，以防样品带扩散结果误差分析本次实验结果与理论数值根本符合，但稍有误差。可能因为：1 使用的仪器内有杂质，仪器老化2 滴加的试剂与酶没有充分接触3 酶因为操作时温度稍高局部会失活4 拿出离心管时稍微晃动使沉淀与上清液混合5 层析时收集的液滴大小不均造成吸光度测量误差6 滴定时计时不准确，滴定终点人为判断不一致7 滴定前过氧化氢分解或稍被硫酸污染 8 周围环境中的杂蛋白影响，可能因为实验时间过长造成酶活性降低实验讨论1 盐析时，为什么要在冰浴搅拌的状态下，且要缓慢滴加？答：常温下，酶的活性有损伤。搅拌和缓慢滴加，是防止局部盐浓度过高，使杂蛋白析出。2 为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液，而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液？答：醋酸缓冲液的