利用生物信息学方法开发鹌鹑微卫星标记

1、利用生物信息学方法开发鹌鹑微卫星标记白俊艳，庞有志，赵淑娟（河南科技大学动物科技学院，471003）中文摘要：本研究对已公布的鹌鹑核酸序列和EST序列总计635条序列中16核苷酸重复SSR的分布进行了分析。结果表明，其中共发现120条SSR，检出率为18.9%。二核苷酸重复基元的SSR占40.0%，三核苷酸重复基元的SSR占35.8%，五核苷酸重复基元和四核苷酸重复基元的SSR类型，分别占14.2%和10.0%，没有发现六核苷酸重复基元的SSR。组成这些SSR的主要基序有AT/TA，CA/GT，GA/CT，CAG/GTC，AGG/TCC，TAA/AAT，GGC/CGG，GAC/CTG，CGA/

2、GCT，GCA/CGT，GAG/CTC，ACC/CCA，TCTT，TTTG，TCCA，ATGAT/ATCAT，TCCCT，TTCCC。并且SSR的重复次数都在5以上，由此可以推测利用鹌鹑核苷酸序列和EST序列中的SSR序列将有可能开发一批有价值的SSR分子标记供各种研究所用，还有助于鹌鹑高密度遗传图谱的构建、重要功能基因克隆及基因功能等研究。关键词：鹌鹑，微卫星，生物信息学方法鹌鹑分为野生鹌鹑和家养鹌鹑两类。野生鹌鹑主要有野生普通鹌鹑和野生日本鸣鹑两种野生普通鹌鹑。鹌鹑具有体型小、产蛋能力强、繁殖快、易饲养、耗料少等特点，因而具有较高的经济价值，同时还因其敏感性好、世代间隔短，是一种很好的实验

3、动物，可供营养学、遗传学、疾病学、组织学、胚胎学、生理学、繁殖学、药理学等学科方面的实验和研究。然而，现阶段对鹌鹑的遗传资源研究不多，对于分子遗传标记领域的研究报道比较少。微卫星（microsatellite）是DNA序列中以16个碱基为一个重复单位，重复一般在1020次左右，首尾相接的串联重复序列，又称为简单序列重复DNA（SSR）。目前微卫星标记已经广泛应用于牛、猪、羊等家畜的遗传育种中，主要包括个体识别和品系鉴定，群体遗传结构与遗传关系分析，功能基因和QTL定位，构建基因图谱，杂种优势预测。微卫星标记在鹌鹑中的研究报道比较少，Kayang等1（2004）开发了鹌鹑100多个的微卫星标记，

4、并首次绘制了鹌鹑的部分遗传连锁图谱。Kayang等2（2006）利用AFLP和SSR标记构建了鹌鹑的部分染色体的遗传连锁图谱。到目前为止，已经开发的鹌鹑的微卫星标记仍然为数不多。随着生物技术、生物信息学的发展，GeneBank、DDBJ等国际生物学公共数据库中核酸序列信息也在不断增多，为我们开发鹌鹑微卫星标记提供了条件。利用生物信息学方法从这些数据库中检索SSR序列无疑是一个简便快速的方法。这种方法节省了传统微卫星开发过程中的大量测序费用，也节省了大量人力，因此具有广阔的应用前景。本研究的目的就是利用生物信息学方法开发鹌鹑的新微卫星标记，为开展鹌鹑遗传多样性研究、品种鉴定、比较基因组研究、进一

5、步完善鹌鹑遗传连锁图谱等工作提供更方便实用的标记。一、材料与方法首先，对NCBI中的公共数据库Genebank中的所有鹌鹑核酸序列和EST序列进行检索，网站为：。然后，用微卫星在线搜索工具SSRIT从这些鹌鹑序列中查找微卫星，网站为。最后将找到的微卫星利用进行序列同源比对，对于获得的SSR进行统计分析。二、结果与分析（一）鹌鹑SSR的检出率： 截至于2009年4月底，从NCBI网站上检索到鹌鹑的496条核苷酸序列和139条EST序列，总计635条序列。其中共发现120条SSR，检出率为18.9%。（二）鹌鹑不同重复核苷酸数SSR分布表1 SS不同重复核苷酸数的数量及百分比重复核苷酸数SSR数量

6、（条）占所有SSR的百分比（%）二核苷酸4840.0三核苷酸4335.8四核苷酸1210.0五核苷酸1714.2SSRs总数120不同重复核苷酸SSR在鹌鹑的基因组中并不是均匀分布的，由表1可以看出，二核苷酸重复基元的SSR类型最多，占总数的40.0%，其次是三核苷酸重复基元的SSR类型，占35.8%，最少的是五核苷酸重复基元和四核苷酸重复基元的SSR类型，分别占14.2%和10.0%。而且，在鹌鹑中没有发现单核苷酸重复基元和六核苷酸重复基元的SSR。(三)鹌鹑各种SSR分布表2 二核苷酸基元和三核苷酸基元的SSR重复单元数重复单元SSR数量（条）百分比（%）二核苷酸GA/CT1531.3CA

7、/GT1633.3AT/TA1735.4GC/CG00.0三核苷酸TTA/AAT49.3GGC/CGG37.0GAC/CTG37.0CAG/GTC920.9CGA/GCT37.0GCA/CGT37.0AGG/TCC818.6GAG/CTC37.0ACC/CCA37.0CCT12.3TTG12.3CGC12.3GAT12.3鹌鹑各种SSR的分布见表2和表3，可以看出，在48条含有二核苷酸重复基元的SSR中，含有AT/TA重复基元的数量最多，有17条，占35.4%，其次是CA/GT和GA/CT重复基元的，分别占33.3%和31.3%，并且没有发现GC/CG重复基元的SSR。在43条含有三核苷酸重复

8、基元的SSR中，含有CAG/GTC重复基元的数量最多，占20.9%，其次是AGG/TCC，占18.6%，然后依次是TAA/AAT、GGC/CGG、GAC/CTG、CGA/GCT、GCA/CGT、GAG/CTC、ACC/CCA，数量最少的只有1条，他们是CCT、TTG、CGC、GAT。在12条含有四核苷酸重复基元的SSR中，含有TCTT重复基元的数量最多，占25.0%，其次是TTTG和TCCA，分别占16.7%和16.7%。在17条含有五核苷酸重复基元的SSR中，含有ATGAT/ATCAT重复基元的数量最多，有8条，占47.1%，其次是TCCCT和TTCCC，分别占23.5%和23.5%。表3

9、四核苷酸基元和五核苷酸基元的SSR重复单元数重复单元SSR数量（条）百分比（%）四核苷酸TCTT325.0TTTG216.7TCCA216.7TCCT18.3CCAT18.3TTAT18.3AAAT18.3AACA18.3五核苷酸ATGAT/ATCAT847.1TCCCT423.5TTCCC423.5CTTCC15.9（四）鹌鹑SSR的重复次数分布 在120条SSR中，发现重复次数最多的是重复5次，有53条SSR，占44.2%；其次是重复次数为6次的，有36条SSR，占30%；其次是7次和8次的，而重复次数为9次和22次的为最少，只有1条SSR。三、讨论本研究对已公布的鹌鹑核酸序列和EST序列

10、中其16核苷酸重复SSR的分布进行了分析，结果表明，二核苷酸重复基元的SSR占总数的40.0%，三核苷酸重复基元的SSR类型，占35.8%，五核苷酸重复基元和四核苷酸重复基元的SSR类型，分别占14.2%和10.0%。并且SSR的重复次数都在5以上，由此可以推测利用鹌鹑核苷酸序列和EST序列中的SSR序列将有可能开发一批有价值的SSR分子标记供各种研究所用。同时发现，利用生物信息学方法开发SSR有以下几个特点：首先，生物信息学方法开发SSR简便、快捷、可以节省人力财力；其次，生物信息学方法可以开发出更高核苷酸重复基元的SSR，如三、四、五、六核苷酸重复基元的SSR，而其他方法开发的SSR多为二

11、核苷酸重复基元的SSR；最后，生物信息学方法开发的SSR的重复次数不是很高，多数在58次重复范围，这也可能与这些SSR是位于基因内部有关，其保守性可能比较好。尽管SSR具有广泛的用途，但是其开发过程却是相当费时费力，目前SSR标记的开发有4种方法：文库筛选法，基于锚定PCR技术的方法，生物信息学方法，转移扩增法。文库筛选法是目前最常用的方法，虽然采用文库富集法可以使SSR开发效率（功能引物数/测序克隆数）达到40%60%，但是无论单引物延伸富集法3，4，还是选择杂交富集法5，6，都存在过程烦琐复杂、技术要求高等缺点。Hayden 和Sharp 11在锚定PCR的基础上发明了SAM法。随着更多的

12、动物基因组序列、mRNA序列不断增加，生物信息学方法将会成为一种简便、快速、实用的微卫星开发方法。参考文献：1 Kayang B B, Vignal A, Inoue-Murayama M A et al. First-generation microsatellite linkage map of the Japanese quail. Anim Genet. 2004, 35(3): 195-200.2 Kayang B B, Vignal A, Inoue-Murayama M A et al. Integrated maps in quail (Coturnix japonica) c

13、onfirm the high degree of synteny conservation with chicken (Gallus gallus) despite 35 million years of divergence. BMC Genomics, 2006, 7:1-18.3 Fisher P J, Richardson T E, Gardner R C, et al. Characteristics of single- and multi-copy microsatellites from Pinus radiata. Theor Appl Genet, 1998, 96: 9

14、699794 Varghese J P, Rudolph B, Uzunova M I, et al. Use of 5´-anchored primers for the enhanced recovery of specific microsatellite markers in Brassica napus L. Theor Appl Genet, 2000, 101:1151195李明芳，郑学勤.开发SSR引物方法之研究动态.遗传, HEREDITAS,2004,26(5):7697766 Hayden M J, Stephenson P, Logojan A M, et al. A new approach to exten