核酸的生物合成

1、核酸的生物合成 本章重点介绍遗传中心法本章重点介绍遗传中心法则和则和DNA、RNA的生物合成的生物合成，对基因工程作一般介绍。，对基因工程作一般介绍。 遗传信息传递的遗传信息传递的 中心法则中心法则 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。发展了基因工程，给人类的生产

2、和生活带来了深刻的革命。目目 录录 基因工程及分子生物学技术简介基因工程及分子生物学技术简介 DNA的生物合成的生物合成 RNA的生物合成的生物合成 核酸合成的抑制剂核酸合成的抑制剂一、一、 DNA的生物合成的生物合成（细胞内合成（细胞内合成DNA的过程）的过程）1、DNA的复制：的复制：以以DNA为模板指导的为模板指导的DNA 合成，即将合成，即将DNA携带的信息传至子代携带的信息传至子代DNA。3、DNA的修复合成：的修复合成：当各种因素引起当各种因素引起DNA损伤损伤 时，损时，损 伤伤DNA可修复合成，校正错误，完成可修复合成，校正错误，完成 正确合成，以保持正确合成，以保持DNA结构

3、结构 的稳定性和遗传的稳定性和遗传 信息的准确性。信息的准确性。 2 2、逆（反）转录：、逆（反）转录：以以RNA为模板为模板指导的指导的DNA 合成，见于合成，见于RNA病毒。病毒。1、DNA的复制的复制 n1dATP DNA聚合酶聚合酶n2dGTP + RNA DNA + (n1+n2+n3+n4) PPin3dCTP DNA模板模板、Mg+、Mn+n4dTTP原料原料引物引物依赖于依赖于DNA的的DNA合成酶合成酶 DNA复制的方式：复制的方式：半保留复制半保留复制DNA复制的特点复制的特点一、半保留复制的实验依据和意义一、半保留复制的实验依据和意义 DNA生物合成时，母链生物合成时，母

4、链DNA解开为两股解开为两股单链，各自作为模板单链，各自作为模板(template)按碱基配对规按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为碱基序列一致。这种复制方式称为半保留半保留复制复制。半保留复制的概念半保留复制的概念子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 密度梯度实验密

5、度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养继续培养于普通培于普通培养液养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的全部遗传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。（2）复制的起始点与方向）复制的起

6、始点与方向 亲代亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动。开链，复制起始点呈叉型移动。1、复制起始点：、复制起始点： DNA复制要从复制要从DNA分子的特定分子的特定 部位开始，部位开始，此部位称复制起始点。此部位称复制起始点。 原核：仅含一个原核：仅含一个 ，约，约245 bp,特殊的重复序列。特殊的重复序列。 真核：多个起始点真核：多个起始点 例：酵母例：酵母17号染色体含号染色体含400个。个。2、复制方向：含三种机制、复制方向：含三种机制 2个起点，个起点，2个叉，各合成一条链（腺病毒）。个叉，各合成一条链（腺病毒）。 1个起点个起点1个叉，同方向合成两条链（单向复制）。个叉，同方向合成两

7、条链（单向复制）。 1个起点个起点2个叉，不同方向合成两条链，此为常个叉，不同方向合成两条链，此为常 见方式见方式（双向复制）（双向复制）。复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制单向和双向复制单向和双向复制原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从起始点从起始点(origin)向两个方向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向双向复制复制。 环状环状 DNA复制复制时所形成的时所形成的结结构构原核：一个起始点原核：一个起始点大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重

8、复序列复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型复制子复制子生物体内能独立行使复制功能，进生物体内能独立行使复制功能，进行独立复制的行独立复制的DNADNA单位。习惯上把两个相邻起始单位。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子点之间的距离定为一个复制子(replicon)(replicon)。真核：多个起始点真核

9、：多个起始点（3）DNA的半不连续合成的半不连续合成u 在在DNA复制过程中，一条链是连续合成的复制过程中，一条链是连续合成的，而另一条链是不连续合成。，而另一条链是不连续合成。u 体内仅含催化体内仅含催化53合成的合成的DNA酶。酶。 老链老链 3 5 新链新链 5 3 DNA复制时链延长方向复制时链延长方向 :沿沿 5 3 方向进行。方向进行。岗崎片段岗崎片段在在DNADNA复制中形成的复制中形成的DNADNA片段。片段。3 5 3 5 5 3 5 先导链先导链后随链后随链岗崎片段岗崎片段60年代冈琦片段的发现解决了这个问题：年代冈琦片段的发现解决了这个问题：合成合成53前导链（前导链（l

10、eading strand）是连续）是连续 的，方向与复制叉一致。的，方向与复制叉一致。合成合成3 5随从链时，方向与叉相反，合成随从链时，方向与叉相反，合成 不连续，各片段连成一条链。不连续，各片段连成一条链。DNA聚合酶聚合酶(DNA polymetases)引物酶引物酶(peimase)(peimase)和引发和引发体体(primosome)(primosome) DNADNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）DNADNA解链酶解链酶(DNA (DNA helicase)helicase)单链结单链结参与参与DNA复制的复制的酶及蛋白因子酶及蛋白因子合蛋白合蛋白(

11、single-strand binding (single-strand binding protein,protein,SSBSSB) )：拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase(topoisomerase解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物酶和引引物酶和引发体发体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 3 5 5 RNA引引物物（4）参与）参与DNA复制的酶及蛋白因子复制的酶及蛋白因子* DNA聚合酶催化的链延长反应3 5 模板链5 RNA引物引物子链3 35533553大肠杆菌大肠杆菌三三种种DNA聚合酶比较聚合酶比较DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每

12、个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用转化率转化率DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶（复合物）（复合物）109，000400+1120，000100+-0 .05400，00010-20+50比较项目比较项目DNA聚合酶聚合酶：催化催化DNA合成，是真正的复制酶。合成，是真正的复制酶。DNA聚合酶聚合酶：具校对，切除引物，修复损伤，填补具校对，切除引物，修复损伤，填补空缺等功能。（修复酶）空缺等功能。（修复酶） 323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片

13、段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进，进行分子生物学研究中常用的工具酶。行分子生物学研究中常用的工具酶。 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全酶的结构和功能全酶的结构和功能 延长因子延长因子DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNA核心酶核心酶校对校对引物的结引物的结合和识别合和识别促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化功能功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用

14、的酶。 DNA-pol (250kD)DNADNA聚合酶的聚合酶的3 - 5 外切酶水解位点外切酶水解位点3 3 5 5 错配碱基错配碱基3 - 5 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点DNA聚合酶聚合酶5 - 3 外切酶活力外切酶活力5 - 3 核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点单链缺口单链缺口5 3 5 3 5 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 DNA聚合酶的作用切除引物填补空缺DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配碱基错配碱基复制方向复制方向正正 确确核苷酸核苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸（二）真核生物的（二）

15、真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核细胞真核细胞DNA聚合酶聚合酶 种种 类类 负责核负责核DNA的的合成合成不不清清负责负责线粒线粒体体DNA的合的合成成与与功能功能类似类似（聚（聚合酶合酶活性活性占总占总活性活性的的

16、80）校对、校对、修补损修补损伤、填伤、填补空缺补空缺等（具等（具有有3 5 外切外切酶活性酶活性）主主 要要 功功 能能* 引物酶引物酶催化引物合成的酶催化引物合成的酶n1ATPn2GTPn3CTPn4UTP引物酶引物酶 RNADNA模板，模板，Mg+，Mn+原料引物（十引物（十几十个核苷几十个核苷酸组成）酸组成）（3末端为OH）* 连接酶连接酶催化催化DNA片段连接的酶片段连接的酶5 ATCGCAGTA-OH 3 （DNA片段片段1） （DNA片段片段2）5 HO-P-O-GTACG-OH 3 oOHDNA连接连接酶酶ATP或或NAD、Mg25 ATCGCAGTA-O-P-O-GGTACA

17、G-OH 3 OOHDNA连接酶的作用机制连接酶的作用机制（一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白理理顺顺DNA链链拓拓扑扑异异构构酶酶(gyrA, B)稳稳定定已已解解开开的的单单链链单单链链DNA结结合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG(dnaG)运运送送和和协协同同DnaBDnaC(dnaC)解解开开DNA双双链链解解螺螺旋旋酶酶DnaB(dnaB)辨辨认认起起始始点点DnaA(dnaA)蛋蛋白白质质（基基因因）通通用用名名功功能能原原核核生生物物复复制制起起始始的的相相关关蛋蛋白白质质*与解除与解除DNA高级结构有关

18、的酶及蛋白因子高级结构有关的酶及蛋白因子 拓扑异构酶：拓扑异构酶：能改变能改变DNA空间构型的酶。空间构型的酶。 兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。解链。 型型单链上切口和封口单链上切口和封口 两型两型 型型双链上切口和封口双链上切口和封口旋转酶旋转酶1010 8 8 局部解链后局部解链后DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成*与解除与解除DNA高级结构有关的酶及蛋白因子高级结构有关的酶及蛋白因子

19、解链酶：解链酶：作用：解除作用：解除DNADNA双螺旋，使其变成单链双螺旋，使其变成单链破破坏双螺旋间的氢键。（消耗坏双螺旋间的氢键。（消耗ATPATP） 单链结合蛋白单链结合蛋白SBB（Single strand binding protein）:作用：与解开的单链作用：与解开的单链DNA结合，结合，稳定单链区稳定单链区防防止重新形成双螺旋，防止核酸酶降解。止重新形成双螺旋，防止核酸酶降解。 DNA的复制过程的复制过程1. 复制的起始（分两步）复制的起始（分两步）(1) 螺旋的松弛与解链（需旋转酶、解链酶、螺旋的松弛与解链（需旋转酶、解链酶、SBB等）等）(2) 引发引发 （需引发酶及引发前

20、体参与）（需引发酶及引发前体参与）2. DNA链的延长链的延长（1）反应体系：）反应体系： DNA模板，模板， DNA聚合酶，聚合酶， dNTP，引物，引物，Mg2+离子离子（2）过程：引物）过程：引物3-OH dNTP ppi、引物引物-dNMP（3）反应式：）反应式：DNA+dNTP （DNA）n+1+ppi （4）反反应机理：应机理： 磷亲核攻击。磷亲核攻击。3. 终止终止DNA复制后复制后 DNA超螺旋超螺旋装配成染色体装配成染色体u原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合

21、酶合酶ISSB3 3 5 前导链前导链随后链随后链3 5 复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5 RNA引物引物3 3 DNA连连接酶接酶聚合酶聚合酶III核心酶核心酶大肠杆菌复制大肠杆菌复制体结构示意图体结构示意图聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶III核心酶核心酶滞后链滞后链前导链前导链解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成酶RNA引物引物引发体引发体拓扑异构酶拓扑异构酶II -夹子夹子 -聚体聚体 -夹子夹子 -复合物复合物RNA引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB）复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物聚合

22、酶聚合酶III全酶全酶引物引物引物体引物体引物体引物体解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体复制的终止复制的终止oric复制叉复制叉2复制叉复制叉1终止复制叉终止复制叉2终止复制叉终止复制叉1复制叉复制叉1复制叉复制叉2完成复制完成复制DNA拓扑异构酶拓扑异构酶连锁染色体连锁染色体u真核细胞真核细胞DNA复制复制 多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点 端粒（端粒（telemeretelemere）复制）复制端粒端粒真核细胞染色体末端的一种膨大的粒状结真核细胞染色体末端的一种膨大的粒状结构（线性染色体末端构（线性染色体末端DNA），），含有类似这

23、样的重复序含有类似这样的重复序列列TTTGGG。端粒酶（端粒酶（Telomerase）组成组成： RNA（含端区重复序列约（含端区重复序列约1.5拷贝）蛋白质拷贝）蛋白质作用作用：可作为反转录酶，以含：可作为反转录酶，以含 端区端区DNA重复序列拷贝的重复序列拷贝的RNA作模板，合成端区作模板，合成端区DNA片段。片段。CC5 3 AAACCCAAACCCA5 3 GGGTTT5 3 3 TTTGGG5 3 5 老链及其端粒新链及引物端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工端粒酶生物学意义端粒酶生物学意义：1、合成端区

24、，保证染色体复制的完整性。、合成端区，保证染色体复制的完整性。2、保护、保护DNA末段不被降解及相互融合。末段不被降解及相互融合。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。对生命衰老的认识。真核生物复制的特点真核生物复制的特点1、复制速度：是原核的、复制速度：是原核的1

25、/10，但复制起始点多。，但复制起始点多。2、引物和冈琦片段小于原核，引物为、引物和冈琦片段小于原核，引物为10个，片段个，片段100200；原核引物十几；原核引物十几几十，片段几十，片段10002000。3、复制需、复制需DNA pol及多种因子参加，及多种因子参加， pol pol 在在核内起主要作用。核内起主要作用。4、 pol 为线粒体复制酶。为线粒体复制酶。5、 DNA复制位于细胞周期的复制位于细胞周期的S期。期。 DNA复制过程是一个高度精确的过程，复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌据估计，大肠杆菌DNA复制复制109-1010碱基对碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性

26、的原因主仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点要有以下三点:a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循聚合酶的高度专一性（严格遵循 碱基配对原则）碱基配对原则）b、DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5 外切酶切除）外切酶切除）c、起始时以、起始时以RNA作为引物作为引物起始时以起始时以RNARNA作为引物的作用作为引物的作用 DNA复制为什么要合成一个复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。聚合过程高度精确的又一措施。已知已知DNA 聚合酶具有聚合酶具有35

27、外切酶功能校对复制过程中的核外切酶功能校对复制过程中的核苷酸苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时暂时”的，当的，当DNA开开始聚合以后再以始聚合以后再以53 外切酶的功能切除，以高忠实性的脱外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。氧核苷酸取而代之

28、，确保复制的忠实性。DNADNA复制分子机制的基本特点复制分子机制的基本特点1、复制是半保留的、复制是半保留的2、原核生物的复制起始于特定位置，一个起始点；真、原核生物的复制起始于特定位置，一个起始点；真核细胞有多个起点核细胞有多个起点3、复制可以单向也可以双向进行，后者更常见、复制可以单向也可以双向进行，后者更常见4、复制时，两条链都从、复制时，两条链都从5到到3端延伸端延伸5、复制是半不连续的，分为连续合成的的前导链和不、复制是半不连续的，分为连续合成的的前导链和不连续合成的后随链连续合成的后随链6、冈崎片段的合成起始于一小段、冈崎片段的合成起始于一小段RNA引物，引物随后引物，引物随后被

29、酶切除，缺口由脱氧核苷酸补满后再与新生被酶切除，缺口由脱氧核苷酸补满后再与新生DNA链连链连在一起在一起7 、复制有多种机制，即使在同一细胞内也会因环境不、复制有多种机制，即使在同一细胞内也会因环境不同而具有不同的起始机制和链延长的方式同而具有不同的起始机制和链延长的方式真核和原核真核和原核DNA细胞复制比较细胞复制比较概念概念逆转录酶逆转录酶病毒逆转录过程病毒逆转录过程逆转录的生物学意义逆转录的生物学意义 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA，这与通常转录过程中遗传这与通常转录过程中遗传信息从信息从DNADNA到到RNARNA的方向相的方向相反，故称为反，故称为逆转录作用逆转录作

30、用。 1970年年Temin等人自等人自Rous肉瘤病毒（肉瘤病毒（RSV）中发现一种酶）中发现一种酶,此酶催化此酶催化RNA合成合成DNA，合，合成方向成方向53* 逆转录过程（逆转录过程（RNA指导下的指导下的DNA合成）合成） n1dATP n2dGTPn3dCTPn4dTTP+ RNA或或DNA DNA+(n1+n2+n3+n4) PPiCDNA(互补互补DNA)依赖于依赖于RNA的的DNA合成酶合成酶逆转录酶逆转录酶RNA模板、模板、Mg+2、Mn+2cDNA以以RNA（mRNA、tRNA、rRNA）为模板）为模板在反转录在反转录 酶催化下合成的酶催化下合成的DNA（含有（含有RNA

31、基因组的基因组的信息）信息）.依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶* 逆转录过程中逆转录过程中cDNA的合成的合成* 反转录酶：具三种酶活性反转录酶：具三种酶活性。以以RNA为模板合成为模板合成DNA。 以以DNA为模板合成为模板合成DNA。 RNaseH活性：降解活性：降解RNA-DNA杂交双链中的杂交双链中的RNA链。链。逆转录病毒（逆转录病毒（RNA肿瘤病毒）的肿瘤病毒）的生活周期生活周期RNA衣壳衣壳被膜被膜逆转逆转录酶录酶转录转录转译转译整合入宿主细胞染色体整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞进入细胞丢失被膜丢失被膜丢失

32、衣壳丢失衣壳逆转录逆转录RNARNAcDNA衣壳蛋衣壳蛋白白被膜蛋被膜蛋白白逆转录逆转录酶酶早期晚期反转录作用的生物学意义反转录作用的生物学意义扩充了中心法则扩充了中心法则有助于对病毒致有助于对病毒致癌机制的了解。癌机制的了解。与真核细胞分裂与真核细胞分裂和胚胎发育有关和胚胎发育有关逆转录酶是分子逆转录酶是分子生物学重要工具生物学重要工具酶。酶。 突变及损伤的因素突变及损伤的因素 化学因素：诱变剂（化学因素：诱变剂（碱基类似物碱基类似物、碱基修饰碱基修饰剂剂、嵌入染料等）嵌入染料等） 物理因素：物理因素：紫外线和电离辐射紫外线和电离辐射 突变的类型突变的类型 碱基对的置换碱基对的置换 移码突变

33、移码突变 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于用于DNA，造成，造成DNA结构和功能的破坏，称为结构和功能的破坏，称为DNA的的损伤损伤. 损伤损伤类型类型 形成聚丁基二聚体形成聚丁基二聚体 脱嘌呤脱嘌呤 脱氨基脱氨基DNA损伤的类型损伤的类型紫外线紫外线突变的意义突变的意义1、进化、分化的分子基础。、进化、分化的分子基础。2、基因型改变。（表型不变）、基因型改变。（表型不变）3、致死性的突变。（消灭病原体）、致死性的突变。（消灭病原体）4、某

34、些疾病的发病基础。、某些疾病的发病基础。DNA修复意义：修复意义： DNA复制中的错误若保留下来，在体复制中的错误若保留下来，在体细胞将影响功能；在性细胞将影响后代，体内的修细胞将影响功能；在性细胞将影响后代，体内的修复系统保证了复系统保证了DNA复制的高度精确性。复制的高度精确性。*DNADNA损伤的修复损伤的修复 光修复系统光修复系统修复系统修复系统 切除修复切除修复 暗修复系统暗修复系统 重组修复重组修复 SOS修复修复DNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体、形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于、光复合酶结合于损伤部位损伤部位3、酶被可见光激活、酶被可见光激

35、活4、修复后酶被释放、修复后酶被释放DNA的损伤和切除修复的损伤和切除修复碱基丢失碱基丢失碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配结构缺陷结构缺陷切开切开 核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切除切除DNA聚合酶聚合酶DNA连接连接酶酶AP核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切开切开切除切除修复修复连接连接糖苷酶糖苷酶插入酶插入酶碱基碱基取代取代DNA的重组修复的重组修复胸腺嘧胸腺嘧啶二聚啶二聚体体复制复制核酸酶及核酸酶及重组蛋白重组蛋白修复复制修复复制DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶重组重组（四）（四）SOS修复修复 当当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱损伤广泛难以继续复制时，由此而诱

36、发出一系列复杂的反应。发出一系列复杂的反应。 在在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。致较广泛、长期的突变。二、二、 RNA的生物合成的生物合成 概念及概念及DNA的有义链和反义链的有义链和反义链 RNA聚合酶及催化反应聚合酶及催化反应

37、 RNARNA合成过程合成过程（以原核为主）（以原核为主） RNARNA转录后的加工转录后的加工（一）（一） 转录的概念和转录的概念和DNA的有义链和反义链的有义链和反义链 启动子启动子（promoter) 终止子终止子(terminator)模板链（模板链（templatte strand） 反意义链反意义链(antisense strand)有意义链有意义链(sense strand)编码链（）编码链（）非信息区非信息区5 5 3 3 *转录与转录与DNA复制的相复制的相似之处：似之处：均以均以DNA为模板；为模板；都需依赖都需依赖DNA的聚合酶；的聚合酶；都是生成都是生成3，5磷酸二酯磷

38、酸二酯键；键；合成的方向都是合成的方向都是5 3；遵从碱基配对规律遵从碱基配对规律。*转录的不对称转录的不对称包括：包括：一条链可转录一条链可转录 另一条链不能转录另一条链不能转录； 模板链可不在同模板链可不在同一链上；一链上； 按细胞需要按细胞需要“开开放或关闭放或关闭”。RNARNA转录特点转录特点：（二）（二） 参与转录的酶和蛋白因子参与转录的酶和蛋白因子 1. 1. RNA聚合酶聚合酶(依赖于依赖于DNADNA的的RNARNA合成酶合成酶) n1ATPn2GTPn3CTPn4UTPRNA聚合酶聚合酶DNA模板、模板、Mg+2、Mn+2RNA + (n1+n2+n3+n4) PPi5 -

39、A T G A A C G A T G G A C G T C A G C T T A G-3 编码链编码链3 -T A C T T G C T A C C T G C A G T C G A A T C-5 模板链模板链 5 -A U G A A C G A U G G A C G U C A G C U U A G-3 mRNA 合成方向：合成方向： 5 3 RNA聚合酶催化的反应聚合酶催化的反应ACGACGUU模板模板DNA5 3 5 3 新合成新合成RNA大肠杆菌RNA聚合酶的结构示意图 核心酶核心酶( (2 2 ) ) 起始因子起始因子全酶全酶( (2 2 ) )核心酶的功能：延长核

40、心酶的功能：延长RNA链和辨认转录终止点。链和辨认转录终止点。 因子的功能：识别转录起始点并参与解开因子的功能：识别转录起始点并参与解开DNA双螺旋，寻找模板链双螺旋，寻找模板链 真核细胞真核细胞RNA聚合酶聚合酶类类 型型 别别 名名 细胞定位细胞定位 合成合成RNA类型类型 -鹅膏蕈碱抑制程度鹅膏蕈碱抑制程度(A酶酶) rRNA聚合酶聚合酶 核仁核仁 rRNA 10-3mol/L,不敏感不敏感(B酶酶) 不均一不均一RNA 聚合酶聚合酶 核质核质 HnRNA 10-910-10,高度敏感高度敏感(C酶酶) 小分子小分子RNA 聚合酶聚合酶 核质核质 5SrRNA 10-410-5,中度敏感

41、中度敏感 tRNA真核真核RNA聚合酶聚合酶原核启动子原核启动子 真核真核启动子结构启动子结构（以（以RNA pol为例）为例） 于于-25处含处含AT富集区富集区, 共有序列共有序列TATAA（TATA box）-70处含共有序列处含共有序列CAAT ,还含许多其它还含许多其它box ,例如例如 GC box,E-box等。等。含增强子含增强子enhancer和静息子和静息子silencsrl RNA pol和和 RNA pol与聚合酶与聚合酶所识别的启动所识别的启动 子差异较大。子差异较大。原核启动子原核启动子真核启动子真核启动子终止因子终止因子 rho蛋白蛋白 (因子因子): 它与它与R

42、NA聚合酶结合聚合酶结合参与合成终止参与合成终止.强终止子：强终止子：由由DNA分子上终止信号分子上终止信号(终止子终止子)单独进行的终止。单独进行的终止。 弱终止子：弱终止子：由终止子和终止蛋白由终止子和终止蛋白(因子因子)共同引起的终止共同引起的终止.* *RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子启动子（promoter) 终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开 合成起始（原核）合成起始（原

43、核） 开始识别部位开始识别部位: -35区区(典型的由典型的由9对核苷酸组成对核苷酸组成)-该区该区 中心位于中心位于-35. 牢固结合部位牢固结合部位: -10区区(含含TATAATC碱基顺序碱基顺序,即该区富即该区富 含含AT碱基对碱基对)称为称为Pribnow box 起始点起始点: 含含G或或A启动子启动子起始点起始点RNA链的延伸图解链的延伸图解3 5 RNA-DNA杂交螺旋杂交螺旋聚合酶的移动方向聚合酶的移动方向新生新生RNA复链复链解链解链有义链有义链模板链（反义链）模板链（反义链）延长部位延长部位基因基因33端端模板链模板链合成方向合成方向基因基因55端端RNARNAA. 合成

44、开始后合成开始后,亚基释放，然后都由核心酶催化。亚基释放，然后都由核心酶催化。B. 核心酶沿模板移动，选择核心酶沿模板移动，选择NTP，暂时形成，暂时形成DNA-RNA杂交链。杂交链。RNARNA链的延长链的延长合成方向合成方向53释放释放RNARNA分子分子RNARNA聚合酶聚合酶脱离脱离终止：终止：终止信号：富含终止信号：富含GC的回文序列和随后一段富含的回文序列和随后一段富含AT的结构。的结构。 RNpol到达终止位点，聚合反应停止。到达终止位点，聚合反应停止。RNA的转录过程的转录过程甲基化作用甲基化作用专一核酸内切酶专一核酸内切酶30S前体前体17StRNA25S专一核酸外切酶专一核

45、酸外切酶16S rRNAtRNA23S rRNA5S rRNA专一核酸外切酶专一核酸外切酶 甲基化作用甲基化作用45S 前体前体18S rRNA5.8S rRNA28S rRNA18S5.8S28S核酸内切酶核酸内切酶a a、切除、切除tRNAtRNA前体两端多余的序列：前体两端多余的序列： 5 5端切除几到端切除几到1010个核苷酸。个核苷酸。b、末端添加：、末端添加：3-端添加端添加CCA序列。序列。c、修饰：形成稀、修饰：形成稀有有碱基如碱基如DH2 。RNAasePRNAaseFRNAasePRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC表示核酸内切酶的作用表示核酸内切酶的作用 表示

46、核苷酸转移酶的作用表示核苷酸转移酶的作用 表示核酸外切酶的作用表示核酸外切酶的作用 表示异构化酶的作用表示异构化酶的作用 酵母（真核）酪氨酸酵母（真核）酪氨酸tRNA前体的加工前体的加工早转录本早转录本成熟成熟tRNA加工加工 真核细胞真核细胞mRNAmRNA的加工的加工5 “帽子帽子”PolyA 3 顺反子顺反子(cistron ) 55端接上一个端接上一个“帽子帽子”(CAP)(CAP)结构结构 33端添加端添加PolyAPolyA“尾巴尾巴”, ,由由RNARNA末端核苷酸转移酶催末端核苷酸转移酶催化化 剪接：剪去内含子剪接：剪去内含子(intron)(intron)，拼接外显子拼接外显

47、子(extron(extron) ) mRNA的前体的前体HnRNA一个基因的结构* 真核生物和原核生物转录的差别真核生物和原核生物转录的差别DNA核核核糖体核糖体新生蛋白质新生蛋白质真核生物真核生物原核生物原核生物mRNA前体前体转运转运加工加工mRNAmRNA 真核生物中转录与翻译在不同的区域真核生物中转录与翻译在不同的区域 RNA聚合酶不相同聚合酶不相同 启动子不同启动子不同 转录后转录后RNA加工修饰不同加工修饰不同DNA和和RNA合成的比较合成的比较噬菌体噬菌体Q 的合成的合成A. 负链的合成负链的合成B. 正链的合成正链的合成病毒的正链病毒的正链复制中间体复制中间体复制中间体复制中

48、间体新合成的正链新合成的正链新合成的负链新合成的负链负链负链2、RNA的复制的复制正链病毒负链病毒3、 核酸合成的抑制剂核酸合成的抑制剂 核苷酸合成抑制剂核苷酸合成抑制剂氨基酸类似物氨基酸类似物 叶酸类似物叶酸类似物 碱基和核苷酸类似物碱基和核苷酸类似物嵌合剂嵌合剂 烷化剂烷化剂 与与DNA模板结合的抑制剂模板结合的抑制剂 作用于作用于DNA聚合酶或聚合酶或RNA集合酶的抑制剂集合酶的抑制剂抗菌素抗菌素:如利福平、曲张霉素如利福平、曲张霉素有机化合物：如磷羧基乙酸有机化合物：如磷羧基乙酸4、 基因工程及分子生物学基因工程及分子生物学 技术技术简介简介 基因工程基因工程 体细胞克隆技术体细胞克隆技术 聚合