实验三 细胞的传代培养与冻存

1、实验三实验三细胞的传代培养及冻存细胞的传代培养及冻存实验目的实验目的1.掌握细胞传代培养的方法掌握细胞传代培养的方法2.掌握细胞冻存的方法掌握细胞冻存的方法3.建立严格的无菌操作观念建立严格的无菌操作观念实验原理实验原理 传代培养是组织培养常规保种方法之一，也是传代培养是组织培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。几乎所有细胞生物学实验的基础。 当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。

2、 传代要在严格的无菌条件下进行。传代要在严格的无菌条件下进行。实验原理实验原理l利用冻存技术将细胞置于利用冻存技术将细胞置于-196液氮中低温保存，可液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验，起到了细胞这样在需要的时候再复苏细胞用于实验，起到了细胞保种的作用。还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄保种的作用。还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。赠、交换和运送某些细胞。l 细胞冻存时向培养基中加入保护剂细胞冻存时向培养基中加入保护剂-终浓度终浓度5%-15%的甘油或二甲基

3、亚砜的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。晶形成，从而避免细胞损伤。 采用采用慢冻快融慢冻快融的方法的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到到 -2/min，当温度低于，当温度低于-25时可加速，到时可加速，到-80之后可之后可直接投入液氮内直接投入液氮内(-196)。 低温保护剂低温保护剂细胞直接冻存会导致细胞死亡。必须加低温保护剂。细胞直接冻存会导致细胞死亡。必须加低温保护剂。常用：常用：二

4、甲亚砜（二甲亚砜（DMSO）。是一种渗透性保护剂。是一种渗透性保护剂。机理：可迅速透入性别，降低冰点，提高细胞膜对水的通机理：可迅速透入性别，降低冰点，提高细胞膜对水的通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。浓度：浓度：510%，细胞冻存，细胞冻存12年，存活率年，存活率 8090%。 二甲亚砜有一定的毒副作用，能引起蛋白质变性。解冻二甲亚砜有一定的毒副作用，能引起蛋白质

5、变性。解冻后，细胞出现凝集现象。用于病人可出现心律失常、高后，细胞出现凝集现象。用于病人可出现心律失常、高血压等症状。血压等症状。 目前，造血干细胞冻存时，采用目前，造血干细胞冻存时，采用5DMSO+6%HES（羟（羟乙基淀粉）两种冷冻保护剂。乙基淀粉）两种冷冻保护剂。实验材料实验材料l癌细胞癌细胞 ；l10%胎牛血清和胎牛血清和DMEM培养液；消化液（培养液；消化液（0.25%胰蛋胰蛋白酶白酶-0.02%EDTA溶液）；溶液）；D-Hanks液；冻存液液；冻存液l细胞培养皿；离心管细胞培养皿；离心管 ；冻存管；微量移液器；冻存管；微量移液器l75酒精棉球；酒精灯酒精棉球；酒精灯1台；废液缸台

6、；废液缸l液氮；二氧化碳液氮；二氧化碳l显微镜；细胞培养箱显微镜；细胞培养箱lNCI-H460lSPCA1lKYSE30lKYSE510操作步骤操作步骤l弃去细胞瓶中的原有培养液。弃去细胞瓶中的原有培养液。l加入适量加入适量D-HankD-Hanks s液液(1mL)(1mL)，轻轻摇动，洗去老化的细，轻轻摇动，洗去老化的细胞及残留的培养液。重复两次。胞及残留的培养液。重复两次。l加入适量消化液加入适量消化液(1mL) (1mL) ，轻轻摇晃至平铺细胞瓶底层，轻轻摇晃至平铺细胞瓶底层，37静置静置2 min2 min，直至，直至细胞层发白、卷边、有间隙细胞层发白、卷边、有间隙，即将脱落，加入即

7、将脱落，加入3mL3mL营养液终止消化。营养液终止消化。l用吸管反复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个用吸管反复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个细胞状态向细胞沉淀中再加入细胞状态向细胞沉淀中再加入6ml6ml的营养液制成细胞悬的营养液制成细胞悬液，分别加入新的细胞培养瓶中（液，分别加入新的细胞培养瓶中（5mL/5mL/瓶），拧好瓶瓶），拧好瓶盖，放入培养箱中。盖，放入培养箱中。37培养培养24h24h后观察结果。后观察结果。操作步骤操作步骤l弃去细胞瓶中的原有培养液。弃去细胞瓶中的原有培养液。l加入适量加入适量D-HankD-Hanks s液液(1mL)(1mL)，轻轻摇动，洗去老化的细

8、，轻轻摇动，洗去老化的细胞及残留的培养液。重复两次。胞及残留的培养液。重复两次。l加入适量消化液加入适量消化液(1mL) (1mL) ，轻轻摇晃至平铺细胞瓶底层，轻轻摇晃至平铺细胞瓶底层，37静置静置2 min2 min，直至，直至细胞层发白、卷边、有间隙细胞层发白、卷边、有间隙，即将脱落，加入即将脱落，加入3mL3mL营养液终止消化。营养液终止消化。l用吸管反复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个用吸管反复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个细胞状态。转移到离心管中，细胞状态。转移到离心管中，1500r/min,1500r/min,离心离心5min5min。l弃去上清，细胞沉淀中再加入弃去上

9、清，细胞沉淀中再加入0.9ml0.9ml的营养液制成细胞的营养液制成细胞悬液，转移入冻存管，再向冻存管中加入悬液，转移入冻存管，再向冻存管中加入0.9ml0.9ml冻存液冻存液, ,拧好瓶盖，放入拧好瓶盖，放入4 4冰箱中冰箱中1h,-201h,-20冰箱中冰箱中1h,-801h,-80冰冰箱中过夜，转移至液氮中。箱中过夜，转移至液氮中。实验结果实验结果1、观察细胞形态、观察细胞形态2、注意是否污染、注意是否污染3、冻存细胞、冻存细胞注意事项注意事项l操作前要洗手，进入超净台后手用操作前要洗手，进入超净台后手用75%75%的酒精的酒精擦拭。试剂等瓶口也要擦拭或灼烧。擦拭。试剂等瓶口也要擦拭或灼

10、烧。l所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。l吸过营养液的用具不能再灼烧，以免烧焦形成吸过营养液的用具不能再灼烧，以免烧焦形成碳膜。碳膜。l不能用手接触已消毒器皿的工作部分。不能用手接触已消毒器皿的工作部分。l吸溶液的吸管不能混用。吸溶液的吸管不能混用。l传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。每次最好只进行一种细胞的操作。交叉污染。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。开。 l每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好