第三章 细胞破碎

1、第三章第三章细胞破碎细胞破碎与分离与分离3.13.1 概述概述3.2 3.2 细胞壁的结构细胞壁的结构及组成及组成3.3 3.3 细胞壁的破碎细胞壁的破碎3.4 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性3.1 3.1 概述概述v胞外产物胞外产物 霉菌产生糖化酶等霉菌产生糖化酶等v胞内产物胞内产物 基因重组产品等基因重组产品等 分离纯化方法：分离纯化方法： 使用分泌性宿主，使胞内产物分泌到胞外使用分泌性宿主，使胞内产物分泌到胞外 细胞破碎细胞破碎 物理法，化学法，机械法，酶法物理法，化学法，机械法，酶法3.2 3.2 细胞壁的结构及组成细胞壁的结构及组成细胞壁的化学组成：细胞

2、壁的化学组成： 微生物的类型微生物的类型 年龄年龄 生长生理学生长生理学3.2 3.2 细胞壁的结构及组成细胞壁的结构及组成图图3.13.1 细胞外层结构细胞外层结构 3.2 3.2 细胞壁的结构及组成细胞壁的结构及组成微生物微生物革兰式阳性菌革兰式阳性菌革兰式阴性菌革兰式阴性菌酵母酵母壁厚（壁厚（nm）20801025100300层层单层单层多层多层多层多层主要组成主要组成肽聚糖肽聚糖(4090%)肽聚糖肽聚糖(510%)葡聚糖葡聚糖(3040%)多糖多糖脂蛋白脂蛋白甘露聚糖甘露聚糖（30）胞壁酸胞壁酸脂多糖脂多糖蛋白质蛋白质磷脂磷脂蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖蛋白质蛋白质脂类脂类破碎难易程度破

3、碎难易程度难难相对易相对易最难最难表表3.1 各种微生物细胞壁的结构及组成各种微生物细胞壁的结构及组成3.3 3.3 细胞壁的破碎细胞壁的破碎破碎方法的选择：破碎方法的选择： 破碎目的破碎目的 待破碎生物体的类型待破碎生物体的类型v破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗；破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗； 研究胞内产物在体内的功能，宜研究胞内产物在体内的功能，宜 采用软处理。采用软处理。v待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不 同的敏感度（同的敏感度（见表见表3.23.2）3.3 3.3 细胞壁的破碎细胞壁的破碎表表3.2 细胞对破碎的敏感度细胞

4、对破碎的敏感度细胞细胞声波声波搅拌搅拌减压减压冷冻压力冷冻压力动物细胞动物细胞7777革兰式阴性芽孢杆菌和球菌革兰式阴性芽孢杆菌和球菌6566革兰式阳性芽孢杆菌革兰式阳性芽孢杆菌5（4）54酵母酵母3.5342.5革兰式阳性球菌革兰式阳性球菌3.5（2）325孢子孢子2（1）21菌丝菌丝16（1）5注：上述数字表示相对敏感度，括号内数字不确切注：上述数字表示相对敏感度，括号内数字不确切生物体的大小，形态，龄期，品系，生长条件，细胞壁生物体的大小，形态，龄期，品系，生长条件，细胞壁结构，结构，pH，温度以及细胞的变化也影响对破碎的敏感度，温度以及细胞的变化也影响对破碎的敏感度3.3.1 3.3.

5、1 破碎率的评价破碎率的评价破碎率的定义：破碎率的定义： N N0 0：原始细胞数：原始细胞数 N N：经：经t t时间操作后，保存下来的细胞数时间操作后，保存下来的细胞数N N0 0 和和N N的获取：的获取： 直接计数法（平板计数，显微镜计数）直接计数法（平板计数，显微镜计数） 间接计数法（测破碎细胞释放出活性物质量）间接计数法（测破碎细胞释放出活性物质量） 电导率测定法电导率测定法%100(%)00NNNx3.1xR/RmR:破碎后释放的化合物的量破碎后释放的化合物的量Rm:理论最大释放量理论最大释放量电导率测定法：电导率测定法：细胞破碎后，大量带电细胞破碎后，大量带电荷的物质被释放到水

6、相，使电导率上升荷的物质被释放到水相，使电导率上升，电导率随破碎率的增加呈线性增加。，电导率随破碎率的增加呈线性增加。 由于电导率与微生物的种类，处理由于电导率与微生物的种类，处理条件，细胞浓度，温度，悬浮液中电解条件，细胞浓度，温度，悬浮液中电解质含量有关，因此，正式测定应采用其质含量有关，因此，正式测定应采用其它方法测定标准曲线。它方法测定标准曲线。3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法破碎方式破碎方式机械法机械法非机械法非机械法液体剪液体剪切作用切作用固体剪固体剪切作用切作用干燥干燥处理处理溶胞溶胞作用作用珠磨法珠磨法压榨压榨高压高压匀浆匀浆超声超声破碎破碎酶溶酶溶法法化学法化学法 物

7、理法物理法图图3.2 细胞破碎方法分类细胞破碎方法分类3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法图图3.3 细胞破碎机理细胞破碎机理3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法图图3.4 3.4 珠磨机简图珠磨机简图 珠磨法珠磨法生产厂商生产厂商: 瑞士瑞士WAB公司公司 德国西门子德国西门子机械公司机械公司形式：形式：立式立式卧式卧式（效率高）（效率高）3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法原理：原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击

8、而破碎，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套带走。产热由夹套带走。 珠磨法珠磨法珠磨机主体：珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体立式和卧式圆筒型腔体一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：因为因为立式机中向上流动的液体在某种程度上会立式机中向上流动的液体在某种程度上会使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。研磨珠：研磨珠：玻璃玻璃( (密度为密度为2.5g2.5gcmcm3 3) )或氧化或氧化锆锆( (密度为密度为6.0 g6.0 gcmcm3 3) )微球微球( (粒径约粒径约0.10.110mm)10mm)，填充率为，填

9、充率为80808585。3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法动力学方程：遵循一级动力学方程动力学方程：遵循一级动力学方程 珠磨法珠磨法1 . 3.)(RRkdtdRmR：t时间内释放的蛋白质数量（时间内释放的蛋白质数量（mg/g） Rm：能释放的蛋白质最大数量，即能释放的蛋白质最大数量，即100破碎破碎 k：破碎的比速率：破碎的比速率2 . 3.1100ktxLnkdtRRdRtRm其中：其中：XR/Rm，破碎率，破碎率3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法影响破碎效率的因素：影响破碎效率的因素：v转盘外缘速度转盘外缘速度v细胞浓度细胞浓度v珠粒大小及装载量珠粒大小及装载量v温度温度v流

10、速流速 珠磨法珠磨法影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素转盘外缘速度：转盘外缘速度： 在一定范围内，破碎的比速率与外在一定范围内，破碎的比速率与外缘速度成正比缘速度成正比 珠磨法珠磨法3 . 3.uk该式有一定的适用范围，转盘外缘速度增该式有一定的适用范围，转盘外缘速度增加到一限定值后，蛋白质释放就不再增加加到一限定值后，蛋白质释放就不再增加图图3.5 搅拌速率与蛋白质释放的关系搅拌速率与蛋白质释放的关系 70%珠体积；珠体积； 80%珠体积；珠体积； 85%珠体积珠体积影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加，转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加，但产生的热量和消

11、耗的功率也增加。破碎但产生的热量和消耗的功率也增加。破碎效率效率E E被定义为：被定义为： 珠磨法珠磨法4 . 3.pRcqER：每：每Kg成品酵母释放的蛋白质数量成品酵母释放的蛋白质数量 q：物料通过量：物料通过量 c：酵母的浓度：酵母的浓度 P：5L珠磨机中，用于破碎所消耗的功率珠磨机中，用于破碎所消耗的功率图图3.6 某一珠磨机下在不同流量和搅拌速率的效率某一珠磨机下在不同流量和搅拌速率的效率1 1、8m/s8m/s2 2、10m/s10m/s3 3、15m/s15m/s4 4、20m/s20m/s10010010106 6m m3 3/s/s505010106 6m m3 3/s/s2

12、02010106 6m m3 3/s/s影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素细胞浓度：细胞浓度：影响悬浮液的流变特性，从而影响影响悬浮液的流变特性，从而影响蛋白质的释放，一般由实验确定蛋白质的释放，一般由实验确定一般控制在一般控制在4040左右，细胞湿重左右，细胞湿重/ /体积体积 珠磨法珠磨法影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素珠粒大小及装载量：珠粒大小及装载量：过少不，不易破碎过少不，不易破碎过多，能耗大，热扩散性能降低，引起温度升高过多，能耗大，热扩散性能降低，引起温度升高，不利搅拌，一般控制，不利搅拌，一般控制808090%.90%. 珠磨法珠磨法图图3.7 微珠直径对破碎率的影响微珠

13、直径对破碎率的影响对对细菌细菌，磨珠越，磨珠越小，破碎率越高小，破碎率越高；对；对酵母和藻类酵母和藻类，存在最佳范围，存在最佳范围实验室：实验室：0.2mm工业：不小于工业：不小于0.4mm影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素温度：温度：热稳定性，目的产物不受破坏热稳定性，目的产物不受破坏夹套冷却夹套冷却 珠磨法珠磨法影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素流量：流量： 珠磨法珠磨法图图3.8 流量对破碎速率常数的影响流量对破碎速率常数的影响处理能力但释放量破碎量QQVtQkQ影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素微生物类型：微生物类型： 酵母较细菌在珠磨机中更易破碎酵母较细菌在珠磨机中更易破碎，因

14、为细菌细胞的大小仅为酵母细胞，因为细菌细胞的大小仅为酵母细胞的十分之一，在高速珠磨机中不易破的十分之一，在高速珠磨机中不易破碎。碎。 珠磨法珠磨法影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素 珠磨法珠磨法影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素 延长研磨时间，增加珠体装量，提高基延长研磨时间，增加珠体装量，提高基本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率，使，使能耗能耗加大。同时加大。同时: :1 1、产生较多热能，增加冷却控温的难度；、产生较多热能，增加冷却控温的难度；2 2、大分子目的产物失活增加、大分子目的产物失活增加3 3、细胞碎片较小，碎片不易分离，给后续、细胞

15、碎片较小，碎片不易分离，给后续操作带来困难。操作带来困难。因此因此, ,破碎率控制在破碎率控制在8080以下。以下。 珠磨法珠磨法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法图图3.3 HC23-3.3 HC23-高压细胞高压细胞破碎机破碎机高压匀浆法高压匀浆法图图3.4 3.4 DY89-1 型电动型电动玻璃匀浆机玻璃匀浆机作用机理：作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速之间的环隙高速( (可达到可达到450m450ms)s)喷出后撞击喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而

16、在撞击力和剪切力等剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为为505070MPa70MPa。 高压匀浆法高压匀浆法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法动力学方程：高压匀浆法中影响细胞破碎的因素动力学方程：高压匀浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率X X与操作压力与操作压力P P和循环操作次数和循环操作次数N N之间的关系可表之间的关系可表达为：（服从一级反应规律达为：（服从一级反应规律) )高压匀浆法高压匀浆法Nkpx11lnK:K:与温度

17、，粘度等有关的速率常数与温度，粘度等有关的速率常数 ：2.92.9（酿酒酵母）；（酿酒酵母）；2.21(2.21(大肠杆菌大肠杆菌) )3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法影响细胞破碎的因素：影响细胞破碎的因素：温度温度压力压力循环操作次数循环操作次数细胞浓度细胞浓度阀座形式阀座形式高压匀浆法高压匀浆法影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素温度：温度：破碎率随温度的增加而增加破碎率随温度的增加而增加例如：操作温度由例如：操作温度由55增加到增加到3030，破碎率约提高，破碎率约提高1.51.5倍。倍。高温对破碎有利，但应考虑热变性高温对破碎有利，但应考虑热变性压力每增加压力每增加10MPa1

18、0MPa，温度，温度22。高压匀浆法高压匀浆法影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素浓度：浓度：一般认为，酵母破碎率与细胞浓度无关一般认为，酵母破碎率与细胞浓度无关 DoulachDoulach等人通过理论分析，认为破碎等人通过理论分析，认为破碎率与细胞浓度存在下列关系：率与细胞浓度存在下列关系：高压匀浆法高压匀浆法ZppR0exp1Z:Z:常数；常数；P P：破碎压力；：破碎压力；p p0 0：临界压力；：临界压力； ：取决于细胞浓度的参数；：取决于细胞浓度的参数；R:R:蛋白质的释放量蛋白质的释放量影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素压力：压力：高压匀浆法高压匀浆法），能耗（每能耗磨损KW5

19、 . 3MPa100TRP不能单纯追求高破碎率，随意增加操作不能单纯追求高破碎率，随意增加操作压力。压力。影响破碎效率的因素影响破碎效率的因素阀座形式：阀座形式：在相同的操作压力下，刃缘阀座比平在相同的操作压力下，刃缘阀座比平边阀座破碎率高，但更易磨损。边阀座破碎率高，但更易磨损。高压匀浆法高压匀浆法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法高压匀浆法高压匀浆法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法图图3.5 JY92-3.5 JY92-型超声波细胞粉碎机型超声波细胞粉碎机 超声波法超声波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法作用机理：作用机理： 在超声波作用下，液体发生空化作用在超声波作

20、用下，液体发生空化作用(cavitaton)(cavitaton)，空穴的形成、增大和闭合产，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。声波的声频、声能有关。 超声波法超声波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法动力学方程：一级动力学方程：一级 超声波法超声波法)exp(1ktxx x：蛋白质释放分率：蛋白质释放分率t t：超声波发射时间（：超声波发射时间（minmin）k k：蛋白质释放常数：蛋白质释放常数(min(min-1-1),

21、),取决于输取决于输 入声能入声能3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法超声波的负面影响：超声波的负面影响：1 1、温度上升：悬浮液预冷，夹套冷却、温度上升：悬浮液预冷，夹套冷却 短期冷却与短期破碎交替短期冷却与短期破碎交替负载因素：声波破碎负载因素：声波破碎/ /冷却的时间比率。冷却的时间比率。2 2、超声处理会引起诸如游离基这样的化学、超声处理会引起诸如游离基这样的化学效应，破坏目的产物，可加入游离基清除效应，破坏目的产物，可加入游离基清除剂（组氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。剂（组氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。 超声波法超声波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法影响破碎细胞的因素：影响

22、破碎细胞的因素：振幅：直接与声能有关，影响比速率振幅：直接与声能有关，影响比速率k k粘度：影响能耗，并抑制空穴现象粘度：影响能耗，并抑制空穴现象表面张力：表面活性剂显著影响声波破碎效表面张力：表面活性剂显著影响声波破碎效率，因起泡使蛋白质变性，空穴清除率，因起泡使蛋白质变性，空穴清除悬浮液体体积：大体积需要高的声能悬浮液体体积：大体积需要高的声能 超声波法超声波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法影响破碎细胞的因素：影响破碎细胞的因素： 加入珠粒体积与直径加入珠粒体积与直径: :加入细小珠粒，利于空加入细小珠粒，利于空穴形成，并有辅助穴形成，并有辅助“研磨效应研磨效应”，提高破碎率。，

23、提高破碎率。在相同珠粒填充密度下，随珠粒直径变化，在相同珠粒填充密度下，随珠粒直径变化，k k存存在最大值。在最大值。 探头的材料和形状：选择具有良好声学和机探头的材料和形状：选择具有良好声学和机械性能并对生物物质无毒的金属材料，如：钛，械性能并对生物物质无毒的金属材料，如：钛，不锈钢等；探头的振幅与其面积呈反比，小直径不锈钢等；探头的振幅与其面积呈反比，小直径探头，声能限制在较小范围内，并且效率低。探头，声能限制在较小范围内，并且效率低。 细胞悬浮液的流速：流速增加，破碎率低，处理细胞悬浮液的流速：流速增加，破碎率低，处理量大量大 工业未使用，向大量悬浮液通入足够能量，工业未使用，向大量悬浮

24、液通入足够能量，很困难，产热问题。很困难，产热问题。 超声波法超声波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法机械法破碎细胞的优缺点：机械法破碎细胞的优缺点：优点：优点：v内含物全部释放内含物全部释放v时间短，效率高，成本低时间短，效率高，成本低v通用性强，适于实验室和工业生产通用性强，适于实验室和工业生产缺点：缺点：v需要高的能量需要高的能量v产生高温，高剪切力，引起产品变性失活产生高温，高剪切力，引起产品变性失活v非专一性，碎片分布宽，给分离造成困难非专一性，碎片分布宽，给分离造成困难3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法作用机理：作用机理：酶溶法酶溶法(Enzymaticlysis)(

25、Enzymaticlysis)利用溶解细利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大脑内产物的遇透性。增大脑内产物的遇透性。 溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTAEDTA使之更有效地作用于使之更有效地作用于细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。酵母细胞的酶溶需用不同的酶。酵母细

26、胞的酶溶需用Zymo1yase(Zymo1yase(几种细菌几种细菌酶的混合物酶的混合物) )、 -1,6-1,6葡聚糖酶葡聚糖酶( (或甘露糖酶）；破或甘露糖酶）；破坏植物细胞壁需用纤维素酶坏植物细胞壁需用纤维素酶 酶法胞溶酶法胞溶3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法优点：优点：v产品释放选择性高产品释放选择性高v抽提速率和收率高抽提速率和收率高v产品破坏少产品破坏少vpHpH、温度外界条件要求低、温度外界条件要求低v不残留细胞碎片不残留细胞碎片 酶法胞溶酶法胞溶缺点：缺点：v费用高费用高v通用性差通用性差v存在产品抑制存在产品抑制v不适于工业生产不适于工业生产3.3.2 3.3.2 破

27、碎方法破碎方法应用：应用：v原生质体融合原生质体融合v释放出克隆出的胞内蛋白释放出克隆出的胞内蛋白v制取特殊的壁葡萄糖聚合物制取特殊的壁葡萄糖聚合物v与机械法破碎细胞协同使用与机械法破碎细胞协同使用v从细胞内不同的位置选择性的释放蛋白从细胞内不同的位置选择性的释放蛋白 酶法胞溶酶法胞溶3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法作用机理：作用机理：用化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分用化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分处理方法：处理方法：酸碱处理；化学试剂；表面活性剂；有机溶剂酸碱处理；化学试剂；表面活性剂；有机溶剂EDTAEDTA螯合剂；变性剂螯合剂；变性剂 化学渗透法化学渗透法3.3.

28、2 3.3.2 破碎方法破碎方法优点：优点：v产物释放有一定的产物释放有一定的 选择性选择性v不需要特殊设备不需要特殊设备v细胞外形保持完整，细胞外形保持完整， 细胞碎片少，浆液粘细胞碎片少，浆液粘 度低，利于后续分离度低，利于后续分离 化学渗透法化学渗透法缺点：缺点：v通用性差通用性差v时间长，效率低时间长，效率低v某些化学试剂有毒某些化学试剂有毒3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法应用：应用：v检测胞内酶活性检测胞内酶活性v释放胞内物质研究释放胞内物质研究 化学渗透法化学渗透法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法渗透压冲击法：渗透压冲击法： 渗透压冲击渗透压冲击(Osmotic s

29、hock)(Osmotic shock)是在各种是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细咆，如动物细胞和革兰氏阴于破碎的细咆，如动物细胞和革兰氏阴性菌。性菌。 物理法物理法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法冻融法：冻融法： 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的琉水到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的琉水键结构，增加其亲水性和通透性。键结构，增加其亲水性和通透性。 另一方面，出于胞内水结晶使胞内外另一方面，出于胞内

30、水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂胞膨胀而破裂 物理法物理法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法干燥法：干燥法： 将细胞用不同的方法干燥（真空、冷冻将细胞用不同的方法干燥（真空、冷冻、喷雾和气流等），细胞膜结合水丧失，渗、喷雾和气流等），细胞膜结合水丧失，渗透性发生变化而破裂透性发生变化而破裂缺点：条件变化剧烈，易引起生物物质变性缺点：条件变化剧烈，易引起生物物质变性 物理法物理法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法比较项目比较项目 机械法机械法 非机械法非机械法比较项目比较项目 机械法机械法 非机械法非机械法破碎机理破碎

31、机理 切碎细胞切碎细胞溶解局部溶解局部壁膜壁膜效率效率效率高效率高效率低效率低碎片大小碎片大小 碎片细小碎片细小 碎片较大碎片较大设备设备需专用需专用设备设备不需专不需专用设备用设备内含物内含物释放释放全部全部部分部分通用性通用性强强差差粘度粘度高（核酸高（核酸多）多）低（核酸低（核酸少）少）经济经济成本低成本低成本高成本高时间时间时间短时间短时间长时间长应用范围应用范围实验室、实验室、工业范围工业范围实验室实验室范围范围表表3.3 机械破碎法和非机械破碎法的比较机械破碎法和非机械破碎法的比较3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法破碎技术的选择原则：破碎技术的选择原则：v目的产物在细胞质中，

32、需机械破碎法目的产物在细胞质中，需机械破碎法v目的产物在细胞膜附近，可采用非机械目的产物在细胞膜附近，可采用非机械破碎法破碎法v目的产物与细胞膜或细胞壁结合，可采目的产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用两种方法结合用两种方法结合3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法破碎技术的研究发展方向：破碎技术的研究发展方向：v多种破碎方法结合多种破碎方法结合v与上游过程结合与上游过程结合 1 1、培养过程控制、培养过程控制 2 2、寄主细胞选择、寄主细胞选择 3 3、克隆噬菌体溶解基因、克隆噬菌体溶解基因 4 4、耐高温产品的基因表达、耐高温产品的基因表达v与下游结合与下游结合 从后分离过程考察细胞破碎技术

33、从后分离过程考察细胞破碎技术3.4 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性 外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体成不可溶、无生物活性的聚集体(aggregation)又称包涵体又称包涵体(inclusion body) 以包涵体形式存在的聚集蛋白质分子不具以包涵体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构有正确的三维结构(天然结构天然结构),它们在水溶它们在水溶液中通常不溶解且没有活性液中通常不溶解且没有活性,包含体必须经包含体必须经过变性、复性才能获得生物学功能过变性、复性才能获得生物学功能 什么是包涵体

34、什么是包涵体3.4 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的形成包涵体的形成图图3.8 蛋白质的合成、折叠与聚集示意图蛋白质的合成、折叠与聚集示意图v包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果。活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、。活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率( (如图如图3.83.8所示所示) )。在高水平表达时。在高水平表达时, ,新生肽链的聚集速新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包涵体的形成。涵体的形成。

35、v重组蛋白分子内及分子间二硫键的错配重组蛋白分子内及分子间二硫键的错配v由于重组蛋白在大肠杆菌中表达时由于重组蛋白在大肠杆菌中表达时,缺乏一缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子,如如折叠酶和分子伴侣等折叠酶和分子伴侣等,是包涵体形成的又一是包涵体形成的又一原因。原因。 包涵体的形成包涵体的形成3.4 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体形成对重组蛋白的生产的优势包涵体形成对重组蛋白的生产的优势: :v包涵体具有高密度包涵体具有高密度, ,易于分离纯化易于分离纯化; ;v重组蛋白以包涵体的形式存在有效地重组蛋白以包涵体的形式存在

36、有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解白的降解; ;v对于生产那些处于天然构象时对宿主对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白时细胞有毒害的蛋白时, ,包涵体形成无包涵体形成无疑是最佳选择疑是最佳选择包涵体的形成包涵体的形成3.4 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性溶菌酶处理溶菌酶处理高压匀质破碎高压匀质破碎低速离心低速离心包含体沉淀包含体沉淀 需用去污剂需用去污剂(TtitonX 100(TtitonX 100或脱氧胆或脱氧胆酸钠酸钠) )和低浓度变性剂和低浓度变性剂( (如如2mol/L2mol/L尿素尿素或盐酸胍等

37、或盐酸胍等) )洗涤以除去脂类和膜蛋洗涤以除去脂类和膜蛋白。通过以上制备可获得高纯度的包白。通过以上制备可获得高纯度的包含体含体( (纯度高于纯度高于70%)70%)包涵体的制备包涵体的制备3.4 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性复性又称再折叠复性又称再折叠(refolding),是指变是指变性蛋白质在变性剂去除或浓度降低性蛋白质在变性剂去除或浓度降低后，就会自发地从变性的热不稳定后，就会自发地从变性的热不稳定状态向热力学稳定状态转变，形成状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物学功能的天然结构具有生物学功能的天然结构蛋白质的复性蛋白质的复性3.4 3.4 包涵体的分

38、离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性复性步骤复性步骤:用脲或盐酸胍等变性剂溶解包涵用脲或盐酸胍等变性剂溶解包涵体使其变成伸展的肽链结构。体使其变成伸展的肽链结构。脱除变性剂，使伸展的肽链折叠脱除变性剂，使伸展的肽链折叠成正确的空间结构。成正确的空间结构。蛋白质的复性蛋白质的复性3.4 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性 溶解：溶解：在复性之前，包含体必需用强在复性之前，包含体必需用强变性剂变性剂( (如如8mol/L8mol/L尿素尿素,6mol/L,6mol/L盐酸胍盐酸胍) )、去污剂、去污剂( (如如) )或酸或酸(70%(70%甲酸甲酸) )溶溶解，在变

39、性液中需加入还原剂二硫基解，在变性液中需加入还原剂二硫基苏糖醇（苏糖醇（DTTDTT）或）或巯基乙醇（巯基乙醇（Z ZMEME）以使重组蛋白质中所有的二硫键）以使重组蛋白质中所有的二硫键打开打开, ,同时还需加入金属鳌合剂如同时还需加入金属鳌合剂如EDTAEDTA或或EGTA,EGTA,以鳌合以鳌合CuCu2 2、FeFe3 3等金属离子等金属离子, ,防止已处于还原状态的巯基与之发生防止已处于还原状态的巯基与之发生氧化反应。氧化反应。蛋白质的复性蛋白质的复性3.4 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性包涵体的分离与蛋白质的复性提高复性成功率采取措施：提高复性成功率采取措施：v在低浓度下进行蛋白

40、质复性（稀释在低浓度下进行蛋白质复性（稀释 复性复性) )v膜分离法脱除变性剂膜分离法脱除变性剂v加入凝集抑制剂加入凝集抑制剂v加入分子伴侣加入分子伴侣v层析复性（吸附和凝胶过滤色谱）层析复性（吸附和凝胶过滤色谱）v反胶团萃取反胶团萃取v双水相萃取双水相萃取蛋白质的复性蛋白质的复性提高复性成功率采取措施提高复性成功率采取措施1 1、稀释复性、稀释复性蛋白质的复性蛋白质的复性 蛋白质折叠为分子内反应蛋白质折叠为分子内反应, ,为一级反应过程为一级反应过程, ,而聚集体的生成为二级以上的反应过程。所而聚集体的生成为二级以上的反应过程。所以以, ,低蛋白质浓度有利于获得较高的复性收率低蛋白质浓度有利

41、于获得较高的复性收率。因此。因此, ,目前蛋白质复性的浓度均较低。目前蛋白质复性的浓度均较低。提高复性成功率采取措施提高复性成功率采取措施1 1、稀释复性、稀释复性 10105050 g/mlg/ml缺点：缺点：降低蛋白质浓度势必增大蛋白质溶液降低蛋白质浓度势必增大蛋白质溶液体积体积, ,给后续的分离纯化增加困难，耗费大给后续的分离纯化增加困难，耗费大 解决办法：解决办法：将流加操作引入复性过程将流加操作引入复性过程, ,即以即以流加的方式向复性缓冲液中输入变性蛋白质流加的方式向复性缓冲液中输入变性蛋白质。由于在流加的同时复性液中的蛋白质发生。由于在流加的同时复性液中的蛋白质发生折叠复性折叠复

42、性, ,使变性蛋白质浓度始终保持在较使变性蛋白质浓度始终保持在较低的水平低的水平, ,可在较高的蛋白质终浓度下获得可在较高的蛋白质终浓度下获得高复性收率。这种复性方法在变性溶菌酶复高复性收率。这种复性方法在变性溶菌酶复性中得到了验证性中得到了验证蛋白质的复性蛋白质的复性提高复性成功率采取措施提高复性成功率采取措施2 2、膜分离法脱除变性剂、膜分离法脱除变性剂膜分离法中可采用透析、超滤或电渗析等除膜分离法中可采用透析、超滤或电渗析等除去变性剂。此法不会增加料液体积和降低目去变性剂。此法不会增加料液体积和降低目标蛋白浓度，克服了稀释法的缺点标蛋白浓度，克服了稀释法的缺点 。缺点：缺点：透析法耗费时

43、间较长，易形成蛋白质沉淀。透析法耗费时间较长，易形成蛋白质沉淀。超滤和电渗析速度较快，由于剪切力，容易超滤和电渗析速度较快，由于剪切力，容易使蛋白失活，且易引起膜污染，操作时应注使蛋白失活，且易引起膜污染，操作时应注意。意。蛋白质的复性蛋白质的复性提高复性成功率采取措施提高复性成功率采取措施3 3、加入凝集抑制剂、加入凝集抑制剂由于分子间疏水性作用导致的聚集体生成是由于分子间疏水性作用导致的聚集体生成是影响蛋白质复性收率的主要原因影响蛋白质复性收率的主要原因, ,加入凝集加入凝集抑制剂抑制聚集体的生成抑制剂抑制聚集体的生成, ,从而开发了从而开发了“添添加稀释加稀释”复性技术。甘油、聚乙二醇、

44、表面复性技术。甘油、聚乙二醇、表面活性剂、单克隆抗体和丙酮；另添加肽基活性剂、单克隆抗体和丙酮；另添加肽基 脯氨酰基顺反异构酶、脯氨酰基顺反异构酶、 精氨酸和谷胱苷精氨酸和谷胱苷肽等促使蛋白质某些结构位点肽等促使蛋白质某些结构位点( (如二硫键如二硫键) )的的形成形成, ,也可促进蛋白质折叠复性。也可促进蛋白质折叠复性。 缺点：缺点：体系中增加新物质，增加后续纯化难度。体系中增加新物质，增加后续纯化难度。蛋白质的复性蛋白质的复性提高复性成功率采取措施提高复性成功率采取措施4 4、加入分子伴侣、加入分子伴侣分子伴侣分子伴侣( (一种蛋白质一种蛋白质, ,如：如：GroEL和和GroES)在体内

45、和体在体内和体外均可辅助蛋白质折叠成正确的天然态。外均可辅助蛋白质折叠成正确的天然态。 GroEL分子可分子可通过疏水性作用捕获变性蛋白质通过疏水性作用捕获变性蛋白质, ,诱导蛋白质的折叠。同诱导蛋白质的折叠。同时时, ,在在GroES和腺苷三磷酸和腺苷三磷酸(ATP)(ATP)的共同作用下的共同作用下, ,部分或完部分或完全折叠的蛋白质被释放到溶液中全折叠的蛋白质被释放到溶液中, ,未完成折叠的蛋白质可未完成折叠的蛋白质可被被GroEL重新捕获重新捕获, ,直至复性完全为止。直至复性完全为止。模拟分子伴侣模拟分子伴侣的两步复性过程的两步复性过程, , 第一步是利用去污剂分第一步是利用去污剂分

46、子子( (模拟模拟GroEL) )捕获变性蛋白质捕获变性蛋白质, ,防止蛋白质的分子间疏防止蛋白质的分子间疏水作用水作用, ,第二步是利用环糊精第二步是利用环糊精( (模拟模拟GroES和和ATPATP）对去）对去污剂快速剥离污剂快速剥离, ,释放部分复性或完全复性的蛋白质。这种释放部分复性或完全复性的蛋白质。这种方法操作方便方法操作方便, ,添加剂成本低廉添加剂成本低廉, ,复性效率较高复性效率较高, ,有广泛的有广泛的应用前景。应用前景。 提高复性成功率采取措施提高复性成功率采取措施5 5、层析复性、层析复性（吸附和凝胶过滤色谱）（吸附和凝胶过滤色谱）吸附：金属螯合、亲和色谱、离子交换和疏水等吸附：金属螯合、亲和色谱、离子交换和疏水等优点优点: :在进样后可很快除去变性剂在进样后可很快除去变性剂; ;由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显地由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显地减少、甚至完