第五章 基因克隆的载体系统2014

1、第五章 基因克隆的载体系统概述概述1、 载体（载体（vector）概念）概念 能将外源能将外源DNA分子携带进入宿主细胞分子携带进入宿主细胞,并进行复制或表达的工具称为载体。并进行复制或表达的工具称为载体。用来进行基因组克隆、用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克克隆或亚克隆的隆的DNA分子分子。按功能分为克隆载体和表达载体。按功能分为克隆载体和表达载体。 载体的功能载体的功能n运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞n为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力n为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2 载体的特点载体的特

2、点n能在宿主细胞内独立复制；能在宿主细胞内独立复制；n有选择标记，易于识别和筛选；有选择标记，易于识别和筛选；n可插入一段较大的外源可插入一段较大的外源DNA分子而不分子而不影响自身复制；影响自身复制；n有合适的限制性酶切位点有合适的限制性酶切位点 第一节第一节 克隆载体克隆载体用于携带用于携带DNA片断进入宿主细胞进行复制片断进入宿主细胞进行复制或保存的载体称为克隆载体。或保存的载体称为克隆载体。 主要的克隆载体主要的克隆载体质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体单链单链DNA噬菌体载体噬菌体载体噬菌粒载体噬菌粒载体动物病毒动物病毒一一、 质粒载体质粒载体（一）质粒一般

3、生物学特性（一）质粒一般生物学特性质粒的概念质粒的概念n质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，被稳定遗传的一类核酸分子，并不是细菌生长所必需的，但可以并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。n质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中n绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNA型的型的(酵母的杀伤质粒是一种酵母的杀伤质粒是一种RNA)n质粒质粒DNA的分子量范围：的分子量范围：1 - 300 kb主要构型主要构型

4、SC构型 cccDNAOC构型 开环DNAL构型 线性DNA3 质粒的基本特性质粒的基本特性1）自主复制性复制起始区（replication origin) ： 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点 （2）质粒的拷贝数）质粒的拷贝数拷贝数拷贝数:常指生长在标准培养基条件下常指生长在标准培养基条件下,每个细菌细胞中所每个细菌细胞中所含有的质粒含有的质粒DNA分子的数目分子的数目. 根据质粒在寄主细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒根据质粒在寄主细胞中

5、的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为可分为松弛型（松弛型（relaxed control ） : 1060copies,高拷贝高拷贝严紧型（严紧型（strigent contorl） : 1几个几个copies,低拷贝低拷贝质粒质粒 复制子复制子 拷贝数拷贝数 pBR322 及其衍生质粒及其衍生质粒 pMB1 1520 pUC 系列质粒及其衍生质粒系列质粒及其衍生质粒 突变的突变的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生质粒及其衍生质粒 p15A10212pSC101 及其衍生质粒及其衍生质粒pSC101 5 ColE1ColE11520（3）、质粒的不相容性质粒的不相容性（plasmid

6、s incompatibility) 在没有选择压力的情况下在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个寄主体系中稳定地共存的现象，称为不能在同一个寄主体系中稳定地共存的现象，称为质质粒的不相容性粒的不相容性. 在细胞的增殖过程中在细胞的增殖过程中,其中必有一种会其中必有一种会被逐渐地排斥掉被逐渐地排斥掉,不相容性的质粒组成不相容性的质粒组成不相容性群不相容性群.nColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容npSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容np1

7、5A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容根据质粒根据质粒DNA中是否含有接合转移基因分为中是否含有接合转移基因分为接合型质粒接合型质粒（能自我转移）（能自我转移） ：又叫自我转移型质粒，除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞胞非接合型质粒非接合型质粒（不能自我转移）（不能自我转移） ： 带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞 （4）可转移性（二）质

8、粒载体的构建及类型二）质粒载体的构建及类型1、天然质粒用做克隆载体的局限性2、质粒载体必须具备的基本条件3、质粒载体的选择标记4、不同类型的质粒载体 1、天然质粒用做克隆载体的局限性天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建野生型质粒为基础进行人工构建2、质粒载体必须具备的基本条件、质粒载体必须具备的基本条件n具有复制起点具有复制起点n具有抗菌素抗性标记具有抗菌素

9、抗性标记n具有若干限制性单一酶切位点具有若干限制性单一酶切位点(多克隆位多克隆位点点(mutiple cloning site简称简称MCS)。n具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数3、质粒载体的选择标记、质粒载体的选择标记n氨苄青霉素 ( Amp )n氯霉素 ( Cml )n卡那霉素 ( Kam )n链霉素 ( Sm )n四环素 ( Tet )筛选标记筛选标记蓝白斑筛选蓝白斑筛选插入失活插入失活4、不同类型的质粒载体、不同类型的质粒载体高拷贝数的质粒载体高拷贝数的质粒载体 ( Col E1、pMB1):拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质

10、粒载体 ( F因子、因子、pSC101):来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因失控的质粒载体失控的质粒载体 :一类温度敏感型复制控制质粒 插入失活型的质粒载体插入失活型的质粒载体 :载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329 正选择的质粒载体正选择的质粒载体:直接选择转化后的细胞.只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长，如pUR2、pTR262等表达型质粒载体表达型质粒载体:在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应的蛋白质的克隆载体特称为表达载体.5、常用的大肠杆菌质粒载体pBR3224363 bpOrigin of Repl

11、icationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr1）元件来源）元件来源复制起点复制起点:来源于ColE1 的派生质粒 pMB1的DNA复制起点Ampr基因基因:来源于pSF2124质粒易位子Tn3的Ampr基因Tetr基因基因:来源于pSC101的Tetr 基因pBR322的优点的优点 具氨苄青霉素和四环素双抗菌素抗性选择标记 分子小，克隆能力大 载体越小越好，10kb的DNA在纯化过程中容易断裂 高拷贝数 氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全 失去了转移蛋白基因mob

12、（mobilization）。不能通过接合转移保留了转移蛋白（mob）的作用位点，能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移。BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpBR322 改造而来 通过 -互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒pUC18 / 19：正选择标记正选择标记 lacZ 的显色原的显色原理理OHHHOHHOHHOHCH2OHO

13、NClBr5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚基吲哚基-b-D-半乳糖苷半乳糖苷 X-galb b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a-肽段肽段ClBrClBrONNPlacMCSlacZ兰-白斑筛选 如pUC质粒含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，称之为蓝-白斑筛选。PUC质粒的优点:n具有更小的分子量和更高的拷贝数n适用于组织化学方法检测重组体n具有多克隆位点MCS区段MCSlacZPT7PSP6oripGEM-3Z2743 bpApr注意：T7和SP6启动

14、子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等多拷贝多克隆位点正选择颜色标记lacZ具有两个噬菌体强启动子用于外源基因的高效表达在体外转录克隆基因的质粒载体在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体n人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记,可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体n大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体n大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体n大肠杆菌-动物细胞穿梭载体（五）质粒载体的稳定性问题（五）质粒载体的稳定性问题质粒稳定遗传必须的两个条件质粒稳定遗传必须的两个条件（1）每个世代、每个质粒至少要复制一

15、次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细 胞中1、结构不稳定性:寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。2、分离的不稳定性:在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。（六）影响质粒载体稳定性的主要因素 新陈代谢负荷新陈代谢负荷;质粒载体的拷贝数质粒载体的拷贝数 ;寄主菌的重组体系寄主菌的重组体系 二、噬菌体二、噬菌体(bacteriophage)载体载体高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞;自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩自主复制繁殖性能使外源基因

16、在受体细胞中高效扩增增噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发能被开发成为基因工程的有用载体成为基因工程的有用载体噬菌体一般生物学特性噬菌体一般生物学特性大多数多呈带尾部的二十面体大多数多呈带尾部的二十面体. 如 噬菌体,部分为线状体型.如 M13噬菌体颗粒的外壳是蛋白质分子噬菌体颗粒的外壳是蛋白质分子,内部是核酸内部是核酸,常见的是双链常见的是双链DNA核酸相对分子量相差较大核酸相对分子量相差较大感染率极高感染率极高生命周期可分为溶菌周期和溶源生命周期可分为溶菌周期和溶源周期周期（一）噬菌体的一般特性1.噬菌体的基本功能2.结构及核酸类型3.噬菌体的感染

17、性4.溶菌周期5.溶源周期6.重组噬菌体的分离1 溶菌周期溶菌周期 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。 2 溶源周期溶源周期 感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。只有双链DNA的噬菌体才有溶源周期.温和噬菌体温和噬菌体:既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体.溶源性细菌溶源性细菌:具有一套完整的噬菌体基因组的细菌.溶源化溶源化:用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程整合整合:噬菌体的DNA被包容在寄主细菌染色体DNA之中,便

18、叫做已整合的噬菌体DNA原噬菌体原噬菌体:在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA,叫原噬菌体,原噬菌体中如有某些基因缺失了,称之为缺陷性的原噬菌体 lysogenic state :噬菌体侵染宿主细胞后，将 噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞的现象称溶源状态溶源状态。 u溶源细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染. 抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫性超感染免疫性.u经过许多世代之后,溶源性的细菌便能开始进入溶菌周期,这个过程叫做溶源性细菌的诱发溶源性细菌的诱发溶源细菌有两个重要特点溶源细菌有两个重要特

19、点:（二）单链DNA噬菌体载体（M13）1、生物学特性2、M13克隆体系3、噬菌体展示载体生物学特性噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和(+)DNA组成组成 基因组为单链基因组为单链DNA;DNA;不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长DNA上上至少有至少有10个基因个基因不存在包装限制。不存在包装限制。 M13M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌，但噬菌体只感染雄性大肠杆菌，但M13 DNAM13 DNA可以转染雌性大肠杆菌，可以转染雌性大肠杆菌，颗粒内含有长颗粒内含有长6407 bp6407 bp的闭合环状的闭合环状DNADNA基因组。基因组。M

20、13的侵染周期很短，不需要插入寄主的基因组。的侵染周期很短，不需要插入寄主的基因组。M13通过细菌的纤毛通过细菌的纤毛插入大肠杆菌，单链分子作为模板合成互补链，形成双链插入大肠杆菌，单链分子作为模板合成互补链，形成双链DNA分子分子。转染转染:感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸所感染，随后能产生出正常噬菌体后代；感染感染:病原微生物在寄主组织内立足的状态 复制型DNA(Replicative form DNA ):n在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，这种双链 DNA 称为复制型 DNA 。 M13载体的构建 在M13

21、基因组中有一段507个核苷酸区域的间隔序列,称为IS区;在其间插入序列不受影响n插入LacZ,编码B-半乳糖苷酶前面146个氨基酸,含有其操纵基因和启动子区,n插入接头M13 DNA载体的特点载体的特点：优点优点n有有MCS，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段n Xgal显色反应，可供直接选择显色反应，可供直接选择n无包装限制，克隆能力大无包装限制，克隆能力大n可以克隆双链可以克隆双链DNA分子中的每一条链分子中的每一条链 缺点缺点n插入外源插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降后，遗传稳定性显著下降n实际克隆能力小于实际克隆能力小于1500bp(三三)、双链噬菌体载体、双链噬菌体载

22、体研究得最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体l l 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性n线状双链线状双链DNADNA分子分子nl l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-DNA组成组成nl l-DNA全长全长48502个核苷酸个核苷酸nl l-DNA上上至少有至少有61个基因个基因n两端各有两端各有12bp的粘性末端的粘性末端 噬菌体线性噬菌体线性DNA分子的粘性末端及其环化作用分子的粘性末端及其环化作用a.具有互补粘性的DNA分子b.通过粘性末端环化了的DNA分子粘性末端形成的双链区域称为cos位点 细胞内环化形式的野生型噬菌体基因图细胞内环化形式的野生型噬菌体基因图野生

23、型做为克隆载体的缺点:n限制性内切酶有较多的切割位点l l-DNA载体的构建：载体的构建：去除非必需区，建立外源去除非必需区，建立外源DNADNA片段的克隆或替换位点片段的克隆或替换位点 野生型野生型l l-DNA有包装限制，有包装限制，l l噬菌体的包装能力控制在野生型的噬菌体的包装能力控制在野生型的75%到到105%（36-51kb）。必须区是）。必须区是28kb，所以，所以l l载体的最大载体的最大克隆容量是克隆容量是23kb 插入选择标记基因插入选择标记基因 cI失活，失活，Spi筛选和筛选和LacZ蓝白斑筛选蓝白斑筛选建立重组建立重组l lDNA分子的体外包装系统分子的体外包装系统根

24、据切除的多少，可将根据切除的多少，可将l l-DNA分成两大类分成两大类载体载体：插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体I、插入型载体插入型载体具有一个限制酶位点可便于外源DNA插入的,其承受的外源DNA片段较小.一般在10K以内。广泛用于cDNA及小片段DNA克隆。经改造后的长度为37kb，为包装的下限，插入片段最大为14kb（51-37kb）如 lgt10、lgt11、lBV2、lNM540、lNM1590、lNM607插入失活常包括插入失活常包括免疫功能失活型免疫功能失活型 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内，插入导致载体不能合成阻遏物， l载体DNA不能进入溶源期，受体

25、菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入的l载体感染受体菌形成混浊噬菌斑 如lNM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部 b b-半乳糖苷酶失活型载体半乳糖苷酶失活型载体 在l基因组中引入了LacZ序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记替换型载体（替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于lDNA的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。如： l EMBL4、Ch

26、aron40等可取代片断中如果包含LacZ，可用Xgal显色作筛选标记替换型克隆外源DNA包括三个步骤:1.应用适当的核酸内切酶消化l噬菌体,除去基因组中可取代的DNA区段2.将上述所得的lDNA臂同外源DNA片段连接3对重组体的lDNA分子进行包装和增殖,以得到有感染性的l重组噬菌体l噬菌体载体一般用途 ：主要用于克隆 DNA 片段构建 cDNA 文库和基因组文库，并从中筛选目标基因 亚克隆在大容量载体（如粘粒）中增殖的外源 DNA 片段l l载体的体外包装载体的体外包装（1）体外包装）体外包装 在试管中与在试管中与l l噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体

27、颗粒，才能高效地感染细菌，把重组噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入注入受体菌中受体菌中包装过程包装过程:nE 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。）。nD基因的产物也是头部蛋白，但主要与基因的产物也是头部蛋白，但主要与l l DNA 进入头进入头部和头部的成熟有关（只占部和头部的成熟有关（只占20%）。）。l lDNA载体的优点载体的优点 l l -DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌l l -DNA载体的装载能力为23 kb，远远大于质粒的装载量重组l l -DNA分子的筛选较为方便l l -DNA载体适合

28、克隆和扩增外源DNA片段，不适合表达外源基因用在真核生物基因组文库的建立三、柯斯质粒载体三、柯斯质粒载体1、柯斯质粒载体的构建2、柯斯质粒载体的特点3、柯斯克隆4、柯斯克隆的改良考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒 l l -DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为23 kb和1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量.在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在

29、体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。1 粘粒载体粘粒载体（考斯质粒载体）考斯质粒载体） 粘粒的结构特征u粘粒（cosmid）：一类由人工构建的含有l 噬菌体 DNA的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 u粘粒的组成 包括质粒复制起点（包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（），抗性标记（ampr），）， cos 位点位点, 能象质粒一样转化（能象质粒一样转化（transform)和增殖和增殖(multiplication) u大小： 一般一般 5-7kb

30、左右，用来克隆大片段左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆的最，克隆的最大大 DNA 片段可达片段可达 45kb 考斯质粒（考斯质粒（cosmid）pHC796400bpTcrl l fragmentcosoriAprPstIBamHISalI三部分组成:一个抗药性标记和一个质粒的复一个抗药性标记和一个质粒的复制起始位点制起始位点带有带有l l -DNA cos序列序列;一个或多一个或多个限制性内切酶的单一切割位点个限制性内切酶的单一切割位点装载范围为31 - 45 kb考斯质粒载体的特点考斯质粒载体的特点n能像能像l l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受

31、体细胞n能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制n重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易n装载量大（装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围）且克隆片段具有一定的大小范围n不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞4、粘粒载体的工作原理、粘粒载体的工作原理n分离外源DNA片断35-45kbn外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同n体外包装：l 噬菌体 A 基因蛋白的末端酶功能作用下切割两个 cos 位点，并将两个同方向 cos 位点之间的片段包装到 l 噬菌体颗粒中去 n线状的重组 DNA 注入细胞并通过 cos 位点环化，形成粘粒载体

32、，象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。用途n在构建基因文库中，减少重组体的数目n在单个重组体中克隆和增殖完整的基因n克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段n在染色体步查（chromosome walking) 过程中具有优势，是 噬菌体 文库的两倍，可克隆45kb 染色体步查：采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作探针，以鉴定含有相邻序列的重组克隆cosmid载体克隆的缺点载体克隆的缺点n载体片断自我连接n外源DNA片断自我连接n多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体cosmid载体的改良载体的改良 npJB8 cosmid载体载体 在在BamH I位点两侧各有一个

33、位点两侧各有一个EcoR I切点。使克隆切点。使克隆在在BamH I上的外源上的外源DNA可被可被EcoR I切下来。切下来。四、噬菌粒载体四、噬菌粒载体1、概念2、pUC118和 pUC1193、pBluescript噬菌粒载体概念 由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型噬菌粒载体系列结合而成的新型噬菌粒载体系列n能像能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞那样体外包装，并高效转染受体细胞 n能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制n装载量比常规的装载量比常规的M13mp系列要大很多（系列要大很多（10 kb）

34、n通过克隆双链通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链能获得同等长度的单一单链DNAn重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119npUC118 pUC18 + M13间隔区间隔区 IGnpUC119 pUC19 + M13间隔区间隔区 IG重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子组成。 MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可以定向体外转录噬菌粒具有以下特征 双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征； 免却了

35、将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤； 由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链。噬菌粒的主要优点： 可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规 M13 载体。缺点： 辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差。五、大分子五、大分子DNA克隆载体克隆载体 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源与质粒组装在一起，即可构成染色体载

36、体。当大片段的外源DNA克克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体它能像天然染色隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括目前常用的人造染色体载体包括：n细菌人造染色体（细菌人造染色体（BAC）n酵母人造染色体（酵母人造染色体（YAC)1 酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）利用酿酒酵母（利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染）的染色体的复制元件构建的载体色体的复制元件构建的载体

37、 u生长的代时为 90 分钟；u含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14106 bp；u具真核 mRNA 的加工活性 YAC载体应含有下列元件载体应含有下列元件u控制酵母控制酵母DNA复制的自主复制序列复制的自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） u一段来自酵母染色体的着丝粒一段来自酵母染色体的着丝粒（centromere ， CEN）序列；序列； 有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 u一对酵母的一对酵母的端粒重复序列端粒重复序列 定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的定位于染

38、色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构降解，以形成稳定的结构 n酵母系统的酵母系统的选择标记：选择标记：trp 1、 leu 2 ，his 3 ，ura3 ，sup4 n宿主酵母菌宿主酵母菌 ade 2-1 ade 2-1 ，sup4 白色菌落白色菌落 ade 2-1 红色菌落nYAC载体的装载量为载体的装载量为: :350 - 400 kb缺点n 存在高比例的嵌合体，一个克隆含两个不相连的独立片段；n部分克隆子不稳定，转代培养中可能会发生缺失或重排；n 难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体有相似结构；n 操作时容易发生染色体机

39、械切割。2 细菌人造染色体（细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）n细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础质粒的基础上构建的，其装载量范围在上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间之间.n各种类型的各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝贝.主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene cluster）结构）结构;构建动植物基因文库构建动植物基因文库; 克隆大片段克隆大片段DNA，100-300kb结构特征n一个抗生素抗性标记

40、:氯霉素抗性和 Lac Z n一个来源于大肠杆菌 F 因子的复制子 oriS(严谨型控制)n一个易于 DNA 复制的的解旋酶（RepE）(由 ATP 驱动)n三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和parC ） 。n 优点 易于用电击法转化E.coli（效率比酵母高10-100倍）；超螺旋环状载体，易于操作； F质粒本身所带的基因控制了质粒的复制； 很少发生体内重排。低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。缺点:n拷贝数小,制备难度大第二节第二节 表达载体表达载体n可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录翻译的载体

41、,一般在克隆载体基础上增加了基因表达的调控元件.n质粒表达载体n病毒表达载体n大片段表达载体n其他一、质粒表达载体以质粒为基本骨架和克隆载体的基础上,组装启动子,转录终止子和核糖体结合位点等表达元件而构建成的.n原核表达载体nTi质粒表达载体n动物质粒表达载体(一) 原核表达载体启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号1表达元件主要包括:n启动子:trp-lac（tac）启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子n转录终止子n核糖体结合位点:核糖体结合位点（RBS）,起始密码子（ATG）和SD序列用途：表达外源目的基因，获得重组融合蛋白用途：表达外源目的基因，获得重组融合蛋白2 表达方式:n组

42、成型表达:在组成型启动子驱动下，外源基因源源不断地表达。n诱导型表达：表达受一些因素的诱导，属于可控性表达。n融合型表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签，表达为融合蛋白，可方便后续的蛋白分离纯化和检测。n分泌型表达：在起始密码和目的基因之间加入一个信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，可避免表达产物在细胞内过度积累而影响细胞的生长，或形成包含体，且表达产物是可溶性的，不需要重复。典型的原核表达载体pET-12a大肠杆菌原核细胞表达1） 表达载体：较常用的是具可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白可获得表达而且表达量较高 （占细菌总蛋白的25%以上）。2） 寄主菌：细菌染色体上含有噬菌体T7-RNA聚合酶基因，它的启动子为Lac启动子，可被IPTG诱导3） 融合蛋白：常用6-10组氨酸-融合蛋白，只增加几个氨基酸，对蛋白质结构影响较少。 GST-融合蛋白，选择大肠杆菌偏爱密码子，易表达外源蛋白。融合蛋白有利于表达和纯化。4） 用途：获得融合蛋白，用于抗体制备，生化性质研究等。 n