金银花检验方法验证方案

1、金银花检验方法验证方案本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开放前采收，干燥。 性状 本品呈棒状，上粗下细，略弯曲，长23cm，上部直径约3mm，下部直径约1.5mm。表面黄白色或绿白色（贮久色渐深），密被短柔毛。偶见叶状苞片。花萼绿色，先端5裂，裂片有毛，长约2mm。开放者花冠筒状，先端二唇形；雄蕊5，附于筒壁，黄色；雌蕊1，子房无毛。气清香，味淡、徼苦。 鉴别 取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，放置12小时，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录 B)试验

2、，吸取供试品溶液1020l、对照品溶液lOl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 检查 水分 不得过12.0%(附录H 第二法)。 总灰分 不得过10. 0%(附录K)。 酸不溶性灰分 不得过3O%（附录K）。 重金属及有害元素 照铅、镉、砷、汞、铜测定法（附录B原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法）测定，铅不得过百万分之五；镉不得过千万分之三；砷不得过百万分之二；汞不得过千万分之二；铜不得过百万分之二十。 含量测定 绿

3、原酸 照高效液相色谱法(附录D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4%磷酸溶液(13：87)为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000。 对照品溶滚的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每Iml含40g的溶液，即得(10以下保存)。 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率30kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色量瓶

4、中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5lOl，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品按干燥品计算，含绿原酸(Cl6H1809)不得少于1.5%。 木犀草苷 照高效液相色谱法(附录D)测定。色谱条件与系统适用性试验 用苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈为流动相A，以o5%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为350nm。理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20000。 时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 015 1020 9080 15

5、30 20 80 3040 2030 8070 对照品溶液的制备 取木犀草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品细粉末（过四号筛）约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)l小时，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液lOml，回收溶剂至干，残渣用70%乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10弘l，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品按干燥品计算，含木犀草苷(C21H20O

6、11)不得少于0.050%。四、验证小组成员及职责4.1验证小组成员4.2人员职责人 员职 责验证小组组长组织相关的验证培训；负责起草验证方案、组织项目的具体验证、督促验证小组成员按照验证方案的要求做好验证记录；起草并完成验证报告，对整个验证项目负责。验证小组成员按照方案实施验证、并做好记录、意外情况及时汇报和记录、协助起草验证方案和报告。 表1：五、验证实施步骤5.1、为了确保验证数据的准确可靠，采取以下几个先行保障措施5.2仪器：己经过校正并在有效期内5.3人员：均经过培训，熟悉方法及使用的仪器5.4对照品：均购自药品检验所5.5材料：均符合检验要求5.6参考资料：中国药典2010年版一部

7、药品生产验证指南(2003版) 检测结果:表检验结果结果判断试验A试验B检测人: 检测日期:5.7 验证标准:试验A供试品溶液在与对照药材溶液及对照品溶液相同的位置显相同颜色的斑点。试验B供试品溶液在与对照品溶液相同的位置未显斑点。5.8 检验结果评价 六 含量测定照高效液相色谱法测定。仪器：LC-10AT液相色谱仪6.1空白溶液的制备：直接取甲醇作为空白溶液。6.2将结果填入下表。表 含量测定专属性试验表保留时间供试品溶液对照品溶液空白溶液检测人： 检测日期：6.3验证标准：供试品溶液中应呈现与木犀草苷对照品保留时间相同的色谱峰；空白溶液中在这点应无色谱峰。6.4结果评价以浓度为横坐标，峰面

8、积为纵坐标，绘制标准曲线。将结果填入下表。表 木犀草苷不同浓度的峰面积浓度（mg/ml）峰面积（v*sec）回归方程相关系数检测人： 检测日期：6.5结果评价6.6准确度6.7 色谱条件与系统适用性试验 用苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈为流动相A，以o5%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为350nm。理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20000。 时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 015 1020 9080 1530 20 80 3040 2030 8070 6.

9、8 对照品溶液的制备 取木犀草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。6.9供试品溶液的制备 取本品细粉末（过四号筛）约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)l小时，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液lOml，回收溶剂至干，残渣用70%乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10Ml，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品按干燥品计算，含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.050%。式中f为对照

10、品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值；AT为对照品峰面积；单位v*sec ；n为供试品的稀释倍数；WT为供试品的称量；单位g。6.11 计算结果填入下表：表5 含量测定木犀草苷加样回收率试验表序号样品称量（g）样品中木犀草苷含量（mg）对照品加入量（mg）实测值（mg）回收率（%）回收率的平均值（）RSD（%）123456789检测人： 检测日期：6.12 结果评价七 精密度7.1重复性（设操作人员A）7.1.1色谱条件与系统适用性试验 用苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈为流动相A，以o5%冰醋酸

11、溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为350nm。理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20000。 时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 015 1020 9080 1530 20 80 3040 2030 80707.1.2对照品溶液的制备 取木犀草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。7.1.3供试品溶液的制备 取本品细粉末（过四号筛）约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)l小时，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液lOml，回收

12、溶剂至干，残渣用70%乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10Ml，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品按干燥品计算，含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.050%。7.1.4计算 式中f为对照品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值；AT为对照品峰面积；单位v*sec ；n为供试品的稀释倍数；WT为供试品的称量；单位g。7.1.5将计算的结果填入下表表 含量测定木犀草苷重复性试验表序号样品称量（g）含量（g/g）含量的平均值（g/g）RSD（%）123456检测人： 检测日期：7.1.6结果评价7.2中间精密度（换一时间，换

13、一操作人员，设操作人员为B）7.2.1色谱条件与系统适用性试验 用苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈为流动相A，以o5%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为350nm。理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20000。 时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 015 1020 9080 1530 20 80 3040 2030 80707.2.2对照品溶液的制备 取木犀草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。7.2.3供试品溶液的制备 取本品细粉末

14、（过四号筛）约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)l小时，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液lOml，回收溶剂至干，残渣用70%乙醇溶解，转移至5ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10Ml，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品按干燥品计算，含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.050%。7.2.4计算 式中f为对照品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值；AT为对照品峰面积；单位v*sec ；n为供试品的稀释倍数；WT为供试品的称量

15、；单位g。7.2.5将计算的结果填入下表表： 含量测定木犀草苷中间精密度试验表序号样品称量（g）含量（g/g）含量的平均值（g/g）RSD（%）操作员A123456操作员B123456检测人： 检测日期：7.2.6结果评价八 耐用性8.1以流动相的组成比例、同一规格的色谱柱为变动因素，得出测定结果不受影响的程度，为使方法用于常规检验提供依据。8.2色谱条件与系统适用性试验 用苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈为流动相A，以o5%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为350nm。理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20000。 时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 015 1020 9080 1530 20 80 3040 2030 80708.3对照品溶液的制备 取木犀草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。8.4供试品溶液的制备 取本品细粉末（过四号筛）约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)l小时，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重